一种提升烟草植株抗赤星病的方法和用途与流程

1.本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一种提升烟草植株抗赤星病的方法和用途。


背景技术：

2.烟草赤星病是由链格孢菌(alternaria alternata)侵染所引起的、发生在烟草上的病害。烟草赤星病是烟叶成熟期的病害，在烟株打顶后，叶片进入成熟阶段开始发病，条件适宜病情会逐渐加重。烟草赤星病主要为害部位是叶片，茎秆、花梗、蒴果也受为害。
3.烟草赤星病在世界各国均有发生。温度主要影响烟草赤星病发生的早晚和潜育期时间的长短，湿度主要影响发病的程度。一般温度达21-22℃、湿度达70-80％开始发病；当温度达25-28℃、连续降雨或烟田24小时有水滴时，5-8天后大规模暴发病害。烟草赤星病防治时，应提倡“预防为主，综合治理”的防治方针，主要的防治手段包括选用抗病品种、清除田间病株、改进栽培方法、综合应用化学防治和生物防治等措施，可取得较好的防治效果。
4.目前，国内防治烤烟赤星病的主要手段是化学药物。但是，长期使用这类农药将导致病害逐渐产生抗药性，使得农药的剂量和使用次数不断增加，从而进入一个恶性循环。与此同时烟叶中药物的残留量不断上升，严重影响烟叶品质。而通过生物育种获取抗烟草赤星病的抗病品种，成为解决上述问题的重要方法。
5.为了解决以上问题，提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明目的通过以下技术方案实现。
7.本发明提供了一种提升烟草植株抗赤星病的方法，其包括以下步骤：
8.利用crispr/cas9基因编辑系统定点敲除烟草中ntccoaomt6、ntccoaomt6l和ntcad14基因，所述的ntccoaomt6、ntccoaomt6l和ntcad14基因的序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
9.优选地，对ntccoaomt6、ntccoaomt6l和ntcad14基因序列进行翻译后，所得编码蛋白序列如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示。
10.优选地，所述crispr/cas9基因编辑系统的sgrna包括sgrna1和sgrna2。
11.优选地，选择了ntccoaomt6和ntccoaomt6l基因中一个共同的sgrna靶点作为所述crispr/cas9基因编辑系统的sgrna1，序列如seq id no.7所示，或包含该序列连续15个碱基及以上dna序列，或包含该序列互补序列的连续15个碱基及以上dna序列。
12.优选地，ntcad14基因敲除的crispr/cas9基因编辑系统的sgrna2如seq id no.8所示，或包含该序列连续15个碱基及以上dna序列，或包含该序列互补序列的连续15个碱基及以上dna序列。
13.本发明第二方面提供了一种第一方面所述的抗赤星病烟草植株的烤后烟叶用于卷烟燃烧的用途。
14.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
15.1、本发明获得的烟草种质具有较好的抗烟草赤星病的抗性。
16.2、本发明的烟草烟叶制备的卷烟燃烧性能较好，co含量较低明显，烟草有害性降低。
附图说明
17.图1a为半叶法赤星病抗性图，图1b为烟草赤星病病害直径的统计(mu为实施例1烟叶；wt为对比例1野生型烟叶)；
18.图2为烟叶提取物抑菌圈实验图(mu实施例1烟叶提取物；wt对比例1烟叶提取物；pc为1mg/ml头孢噻肟钠-95％乙醇溶液(阳性对照)；bc为95％乙醇(空白对照))；
具体实施方式
19.下面结合具体实施例对本发明进行说明，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件以及手册中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明,均可从商业途径得到。
20.实施例1
21.(1)sgrna引物设计与合成
22.设计合成seq序列(包含sgrna1和sgrna2)如下表1所示，并交由公司进行合成。
23.表1构建引物的寡聚核苷酸序列
[0024][0025]
(2)基因敲除载体的构建
[0026]
将合成的seq序列连接在pore-cas9载体(西南大学提供)的bsai酶切位点上，获得基因敲除载体，具体步骤：
[0027]
利用bsai限制性内切酶分别处理pore-cas9载体，对酶切后的产物切胶回收纯化，纯化后的线性化载体与seq退火产物用t7连接酶连接，将上述连接体系放于25℃金属浴30min，连接产物转化dh5α。
[0028]
t7酶连接体系(20μl)：
[0029][0030][0031]
(3)敲除载体质粒转入农杆菌
[0032]
将农杆菌eha105从-80℃冰箱取出，放在冰上冻融。吸取1μl构建成功载体质粒于冻融农杆菌中，用食指指腹轻弹使混合均匀后，放于冰上静置10min。取适量液氮于泡沫盒
中，将农杆菌置于液氮中冷冻2-3min。迅速将农杆菌从液氮中取出置于37℃金属浴热激5min。
[0033]
向农杆菌中加入200μlyeb无抗液体培养基后，置于28℃恒温摇床220rpm培养1h。吸取50μl菌液涂布于yeb+rif+kan平板，置于28℃恒温培养箱2d。
[0034]
待平板上长出单一菌落后，设计pcr引物检测平板中的单菌落，选取阳性克隆接种于200μlyeb+rif+kan液体培养基，28℃，220rpm过夜培养。
[0035]
将摇混后的菌液涂布于yeb+rif+kan平板，置于28℃恒温培养箱黑暗培养2d至平板上长满菌落。
[0036]
(4)转化烟草
[0037]
烟草无菌苗准备：栽培烟草红花大金元在培养瓶25℃下培养30～40天获得无菌苗植株。
[0038]
侵染农杆菌制备：向长满菌落的农杆菌平板加入适量ms液体培养基，用涂布棒将菌苔洗下。吸取菌液于含有ms液体的离心管中，混匀，用细胞密度仪调节od值至0.6-0.8，得到农杆菌重悬液。
[0039]
侵染：用打孔器将无菌苗打孔，先放入ms液体培养基备用，将叶盘转移至重悬液中浸染10min，将叶盘从侵染液中取出移至无菌滤纸片上吸干叶盘表面液体。
[0040]
共培养：在超净工作台中将侵染最终得到的叶盘转移至含有植物激素的共培养基中，28℃恒温箱中黑暗培养72小时。
[0041]
选择和分化培养：超净工作台中将共培养最终得到的叶盘转移至含有卡那霉素、特美汀和植物激素的选择培养基中培养，每隔10～15天更换一次培养基，直至诱导分化出现明显膨大的愈伤组织，转移到组培瓶中进行培养，待愈伤组织生出2cm左右分化芽。
[0042]
生根培养：在超净工作台中将分化芽用无菌手术刀沿基部切下移至生根培养基中培养，约7～20天生根，至此我们获得了无菌再生烟草植株。
[0043]
(4)纯合体的获得
[0044]
收获t0代纯和基因编辑植株的种子后，点种到漂浮育苗基质中，待幼苗长到1cm时并且生根时，用镊子绿色的幼苗移栽到土盆中。提取t1代基因编辑幼苗基因组验证是否纯合，以获得无标签基因编辑纯合体的稳定遗传株系。
[0045]
(5)纯合体烟草的栽培
[0046]
将获得的纯合体种子，点种到漂浮育苗盘中，待苗长到15cm左右时，进行移苗移栽到种植，移苗时每株加入1g醋酸钙。
[0047]
对比例1
[0048]
选取野生型红花大金元种子，按照常规方法进行点种，移苗种植，种植条件与实施例1一致。
[0049]
取实施例1和对比例1两个月大的叶片按照半叶法进行烟草赤星病抗性检测(guo,z.j.,chen,x.j.,wu,x.l.,ling,j.q.,&xu,p.(2004).overexpression of the ap2/erebp transcription factor opbp1 enhances disease resistance and salt tolerance in tobacco.plant molecular biology,55,607-618.)，及其烟叶乙醇提取物进行烟草赤星病抗性检测(ma,qing hu,h.h.zhu,and m.y.qiao."contribution of both lignin content and sinapyl monomer to disease resistance in tobacco."plant pathology(2017).
(2018)67,642
–
650)，结果分别如图1和图2以及表1所示。结果显示，不管是叶片还是其提取物，相对于对比例1，实施例1植株具有较好的抗病性。
[0050]
表1.烟叶提取物抑菌圈直径数据
[0051][0052]
注：数值表示为均值
±
sd；
“‑”
表示无抑菌圈；a,b表示差异显著性(p《0.05).
[0053]
(mu实施例1烟叶提取物；wt对比例1烟叶提取物；pc为1mg/ml头孢噻肟钠-95％乙醇溶液(阳性对照)；bc为95％乙醇(空白对照))
[0054]
将实施例1和对比例1所得烤后烟叶，按照行业标准yc/t 0004-92，测试卷烟的燃烧性，结果表2所示。与对比例1相比，实施例1阴燃时间提高了17％。
[0055]
表2.烟叶阴燃时间
[0056]
id实施例1对照例2阴燃时间s4.32
±
0.34a5.07
±
0.27b
[0057]
注：a,b表示差异显著性(p《0.05).
[0058]
将实施例1和对比例1所得烤后烟叶卷制成卷烟，按照国标gb/t23356—2009，测试卷烟的co释放量，结果表3所示。与对比例1相比，实施例1co释放量降低了9.2％。
[0059]
表3.co释放量时间
[0060]
id实施例1对照例2阴燃时间s12.75
±
0.58a11.58
±
0.63b
[0061]
注：a,b表示差异显著性(p《0.05).seq id no.1：
[0062][0063]
seq id no.2：
[0064]
[0065]
[0066][0067]
seq id no.3：
[0068][0069][0070]
seq id no.4：
[0071][0072]
seq id no.5：
[0073][0074]
seq id no.6：
[0075][0076]
seq id no.7：
[0077][0078]
seq id no.8：
[0079][0080]
seq id no.9：
[0081][0082]
seq id no.10：
[0083]

技术特征：
1.一种提升烟草植株抗赤星病的方法，其特征在于，其包括以下步骤：利用crispr/cas9基因编辑系统定点敲除烟草中ntccoaomt6、ntccoaomt6l和ntcad14基因，得到抗赤星病烟草植株，所述的ntccoaomt6、ntccoaomt6l和ntcad14基因的序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述ntccoaomt6、ntccoaomt6l和ntcad14基因序列进行翻译后，所得编码蛋白序列如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑系统的sgrna包括sgrna1和sgrna2。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述sgrna1对应敲除ntccoaomt6和ntccoaomt6l基因，sgrna1序列如seq id no.7所示，或包含该序列连续15个碱基及以上dna序列，或包含该序列互补序列的连续15个碱基及以上dna序列。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述sgrna2对应敲除ntcad14基因，sgrna2序列如seq id no.8所示，或包含该序列连续15个碱基及以上dna序列，或包含该序列互补序列的连续15个碱基及以上dna序列。6.权利要求1所述的抗赤星病烟草植株的烤后烟叶用于卷烟燃烧的用途。

技术总结
本发明第一方面提供了一种提升烟草植株抗赤星病的方法，其包括以下步骤：利用CRISPR/CAS9基因编辑系统定点敲除烟草中NtCCoAOMT6、NtCCoAOMT6L和NtCAD14基因，所述的NtCCoAOMT6、NtCCoAOMT6L和NtCAD14基因的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明第二方面提供了一种第一方面所述的抗赤星病烟草植株的烤后烟叶用于卷烟燃烧的用途。本发明获得的烟草种质具有较好的抗烟草赤星病的抗性。本发明的烟草烟叶制备的卷烟燃烧性能较好，CO含量较低明显，烟草有害性降低。性降低。性降低。


技术研发人员：王晋 张建铎 杨光宇 张承明 陈建华 许永 孔维松 李晶 胡巍耀 朱龙 乐志伟
受保护的技术使用者：云南中烟工业有限责任公司
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/9