一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备改善肠道菌群产品中的应用

1.本发明属于生物制备技术领域，尤其涉及一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备改善肠道菌群产品中的应用。


背景技术：

2.类外泌体样纳米颗粒(exosome-like nanoparticles，elns)是细胞所分泌的纳米级小泡，双层磷脂包围的囊泡状结构，携带独特的生物活性物质(如脂质、蛋白质、mirnas和次级代谢物等)。植物elns中蛋白含量丰富，多数为膜蛋白，可维持elns结构的稳定以及作为生物活性成分发挥作用。植物elns通常为可食用植物分泌的，具有安全可靠、副作用小的优点，还可作为药物载体。
3.目前，大量药食同源的植物被广泛用于各种疾病的治疗，而从这些植物中分离出的多糖、多酚等物质被视为治疗疾病的主要功能成分。近年来研究表明，植物中除了上述化学成分外，自身能够分泌elns。其中，软枣猕猴桃(actinidia arguta)，别名软枣子、奇异莓等，是猕猴桃科的一种多年生落叶藤本植物，其果实较小，皮薄无毛。果实中含有叶黄素、黄酮、多酚、天然肌醇和矿物质(p、ca、fe、zn等)等，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降低胆固醇、调节记忆力、抗糖尿病、抗过敏和抗疲劳等功能。因此，软枣猕猴桃是一种价值高、用途广、具有广阔发展前景的果实，但关于软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(actinidia arguta exosome-like nanoparticles，aaelns)的制备和功能作用研究暂无报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备改善肠道菌群产品中的应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备改善肠道菌群产品中的应用，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
7.将软枣猕猴桃果实的汁液进行3500～4500g离心5～15min取上清液a、上清液a 6500～7500g离心15～25min取上清液b、上清液b 9500～10500g离心25～35min取上清液c、上清液c 119000～121000g离心65～75min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000～121000g离心65～75min得到沉淀2，pbs缓冲液重悬沉淀2，即得软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。
8.优选的，所述离心的温度为2～6℃。
9.优选的，所述软枣猕猴桃果实的汁液的制备包括将软枣猕猴桃果实研磨得到。
10.优选的，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒使乳酸杆菌、不动杆菌的丰度增加，使变形杆菌、大肠杆菌-志贺氏菌和索氏梭菌丰度降低。
11.本发明还提供了上述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备促进益生菌生长产
品中的应用。
12.优选的，所述益生菌包括乳酸杆菌。
13.本发明还提供了上述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备抑制有害菌生长产品中的应用。
14.优选的所述有害菌包括变形杆菌、大肠杆菌-志贺氏菌和索氏梭菌中的一种或多种。
15.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
16.本发明提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备改善肠道菌群产品中的应用，本发明采用超高速梯度离心的方法制备软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒，该方法操作简单、快速，制备得到的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒结构完整性以及稳定性好，具有改善肠道菌群的作用，且该产品来源于可食用的软枣猕猴桃，安全性高，为制备改善肠道菌群产品的筛选提供了一种更加安全可靠的新选择。
附图说明
17.图1为aaelns的形貌表征，a为aaelns超高速离心后沉淀在离心管底部的图片；b：透射电子显微镜观察aalens图片；
18.图2为aaelns的粒径和zeta电位表征，a为粒径分布；b为zeta电位；
19.图3为aaelns的rnas和蛋白质表征结果，a：琼脂糖凝胶电泳图；b：sds-page结果图；
20.图4为不同储存时间和温度下aaelns的粒径变化结果，a为不同的储存温度aaelns的粒径随时间的变化结果；b为-80℃条件下，不同的储存时间aaelns的粒径变化结果；
21.图5为aaelns在不同ph(1.2、6.8和7.8)溶液中对其粒径的影响；
22.图6为aaelns在模拟胃液(0和4h)、小肠液(0和24h)、结肠液(0和72h)中的粒径结果；
23.图7为c57bl/6小鼠对aaelns的摄取和分布，a为体内荧光成像结果；b为器官成像结果；
24.图8为不同处理条件下，发酵过程中发酵液的ph值对比结果；
25.图9为序列长度分布结果；
26.图10为小鼠肠道菌群β-多样性分析，a为主成分分析；b为主坐标分析；
27.图11为门水平菌群分类学组成以及组间含量较高的分类单元丰度分布；
28.图12为属水平菌群分类学组成以及组间含量较高的分类单元丰度分布。
具体实施方式
29.本发明提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备改善肠道菌群产品中的应用，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
30.将软枣猕猴桃果实的汁液进行3500～4500g离心5～15min取上清液a、上清液a 6500～7500g离心15～25min取上清液b、上清液b 9500～10500g离心25～35min取上清液c、上清液c 119000～121000g离心65～75min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000～121000g离心65～75min得到沉淀2，pbs缓冲液重悬沉淀2，即
得软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。
31.在本发明中，所述软枣猕猴桃果实的汁液的制备优选的包括将软枣猕猴桃果实研磨得到，本发明采用研磨工艺保证了软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的结构完整性。本发明采用超高速梯度离心方法能够除去植物汁液中的果肉组织、杂细胞、细胞片段、细胞器等物质，从而制备纯化软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。作为一优选的实施方式，依次进行3700～4200g离心7～13min取上清液a、上清液a 6600～7300g离心17～23min取上清液b、上清液b 9800～10300g离心27～34min取上清液c、上清液c 119500～120500g离心68～72min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119500～120500g离心68～72min得到沉淀2，pbs缓冲液重悬沉淀2。所述离心的温度优选为2～6℃，进一步优选为3～5℃。
32.在本发明中，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的平均粒径为157.8nm，zeta电位为-23.07mv，表明aaelns的稳定性好，囊泡数量6.5
×
10
12
particle/ml，囊泡数量(particles)与蛋白质或rna浓度的比值反应样品纯度，而aaelns的两者比值分别为1.08
×
10
12
particles/μg rna和7.56
×
10
11
particles/μg蛋白质，表明本发明的aaelns纯度高。同时本发明所述方法制备得到aaelns结构完整性好、还具有耐酸性。
33.在本发明中，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒使乳酸杆菌、不动杆菌的丰度增加，使变形杆菌、大肠杆菌-志贺氏菌和索氏梭菌丰度降低。
34.本发明还提供了上述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备促进益生菌生长产品中的应用。
35.在本发明中，所述益生菌优选的包括乳酸杆菌。将软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒添加至含乳酸杆菌产品中，如酸奶，可以保证酸奶中乳酸杆菌的活菌数，提高酸奶等产品的品质。
36.本发明还提供了上述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备抑制有害菌生长产品中的应用。
37.在本发明中，所述有害菌优选的包括变形杆菌、大肠杆菌-志贺氏菌和索氏梭菌中的一种或多种。将软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒用于食品、试剂或药物时，能够防止有害菌的污染。
38.在本发明中，所述产品包括试剂、食品或药物。所述产品还优选的包括药学上可接受的辅料，如粘合剂、赋形剂、稀释剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂和表面活性剂中的一种或多种。所述药物的剂型优选的包括片剂、丸剂、溶液剂、注射剂、颗粒剂、胶囊剂或喷剂。本发明中所述的药物可经口服、直肠、腹腔内、皮下、肌肉内、静脉内或鼻腔施用。
39.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
40.在以下的实施例中，所述试验所用材料、试剂名称及厂家见表1。
41.材料与试剂：
42.表1试验所用试剂名称及厂家
43.[0044][0045]
在以下实施例中，本发明所用的统计学分析：试验数据采用graphpad prism8软件分析和制图。通过spss 22.0软件统计分析，采用单因素方差分析(one-wayanova)，以最小显著差异(least significant difference，lsd)法进行两两比较，p《0.05具有统计学意义。
[0046]
实施例1
[0047]
软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(aaelns)对肠道微生物的影响
[0048]
1.1软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(aaelns)的制备
[0049]
一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(aaelns)的制备方法，步骤如下：
[0050]
选用新鲜的软枣猕猴桃成熟期果实，清洗干净后研磨成汁，取汁液于50ml离心管中，在4℃条件下依次进行4000g离心10min取上清液a、上清液a 7000g离心20min取上清液b、上清液b 10000g离心30min取上清液c、上清液c120000g离心70min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1120000g离心70min，小心弃干净上清得到沉淀2，用pbs缓冲液溶解沉淀2，吹打混匀后为aaelns。以上操作均在无菌条件下进行。
[0051]
1.2本实施例制备得到的aaelns表征
[0052]
1.2.1将实施例1采用超高速离心后沉淀在离心管底部的aaelns进行拍照。
[0053]
1.2.2透射电子显微镜表征
[0054]
10μl aaelns加到碳涂层网格上，静置20min，pbs清洗，50μl 1％戊二醛液作用5min，双蒸水清洗2min(重复8次)，50μl乙酸双氧铀液作用5min，50μl甲基纤维素-乙酸双氧铀液作用10min。滤纸吸去多余液体，空气中干燥10min，80kv下拍摄电镜照片。
[0055]
由图1结果表明，明显看到沉淀在超离管底部，呈现米白色(黑色为记号笔标记)(图1a)。随后，利用透射电子显微镜对沉淀进行形貌观察(图1b)，aaelns呈茶杯托状结构(箭头所示)。表明本发明制备得到的aaelns具有类外泌体样纳米颗粒外形特点。
[0056]
1.2.3粒径和zeta电位表征
[0057]
用超纯水清洗样品池3～5次，aaelns与pbs按照1:1000(v/v)稀释，在室温下检测粒径和zeta电位。
[0058]
如图2a所示，样品粒径范围在78～220nm，平均粒径157.8nm，pdi指数0.211，囊泡数量6.5
×
10
12
particle/ml。表明aaelns具有较好的稳定性，符合elns的粒径大小分布。zeta电位的绝对值越高，表明体系越稳定，不易凝聚。aaelns的zeta电位为-23.07mv(图2b)，aaelns带负电荷，溶液体系相对稳定。
[0059]
1.2.4rnas表征
[0060]
1.2.4.1rnas提取
[0061]
参考trizol universal总rna提取试剂盒说明书，提取aaelns中的rnas。
[0062]
1.2.4.2琼脂糖凝胶电泳
[0063]
在超微量紫外分光光度计上测定rna浓度。选择上样量为1μg，设置aaelns组和加
入等体积rnase后的无rna组，琼脂糖凝胶浓度1％，电泳电压80v，电泳时间30min，显影成像。
[0064]
1.2.5蛋白质表征
[0065]
1.2.5.1蛋白提取
[0066]
操作均在冰上进行，4℃复溶aaelns，在4℃下10000g离心5min，用预冷pbs洗涤。加入等体积的ripa裂解液(ripa:pmsf:磷酸酶抑制剂＝100:1:1)，吹打混匀并置于冰上30min，每隔10min在漩涡混合仪上振荡30s。4℃条件下转速为12000g离心10min，将上清液转移到新的ep管中，即得aaelns总蛋白产物。
[0067]
1.2.5.2蛋白浓度测定
[0068]
按照bca法测定蛋白浓度。
[0069]
1.1.5.3sds-page
[0070]
(1)配胶
[0071]
根据sds-page凝胶试剂盒依次配置分离胶和浓缩胶。
[0072]
(2)sds-page电泳
[0073]
将样品在沸水浴中煮沸变性3～5min，80v恒压开始电泳，蛋白条带移至分离胶时，电压调至120v恒压，蛋白离开分离胶进入电泳液后停止电泳。
[0074]
(3)固定
[0075]
固定液配置：30ml无水乙醇和0.5ml戊二醛，双蒸水定容至100ml。将胶片放入固定液中30min。
[0076]
(4)染色
[0077]
染色液配置：准确称取1.25g考马斯亮蓝r-250，加入225ml甲醇和50ml冰醋酸，双蒸水定容至500ml。将胶片放入染色液中染色4h。
[0078]
(5)脱色
[0079]
脱色液配置：8ml乙酸和25ml甲醇，双蒸水定容至100ml。将胶片放入脱色液中，于脱色摇床脱色扩散，背景清晰后拍照。
[0080]
其中，样品提取得到的rna和蛋白浓度分别为6ng/μl和8.60μg/μl。囊泡数量(particles)与蛋白质或rna浓度的比值可以反应样品纯度，aaelns的两者比值分别为1.08
×
10
12
particles/μg rna和7.56
×
10
11
particles/μg蛋白质。而哺乳动物细胞elns的该值通常在109的范围内，较高颗粒与蛋白质比值表明本发明的aaelns可能比哺乳动物细胞衍生的elns每个囊泡含有更多的rnas和蛋白质。
[0081]
琼脂糖凝胶电泳结果表明，aaelns中存在小分子量的rna(图3a)。sds-page结果表明，样品蛋白的分子量在35kda以下(图3b)。综上，实施例1提取得到的样品具有外泌体的基本特征，可以确定为aaelns。
[0082]
1.3本实施例制备得到的aaelns的储存稳定性
[0083]
1.3.1时间对aaelns稳定性的影响
[0084]
将aaelns分别取10μl分装于多个ep管中，-80℃储存。aaelns与pbs按照1:1000(v/v)稀释，分别在第0、1、3、5、7、9、11、13、18、24、30d测定粒径的变化。
[0085]
1.3.2温度对aaelns稳定性的影响
[0086]
将aaelns，分别取10μl分装于多个ep管中，4℃和-80℃储存。aaelns与pbs按照1:
1000(v/v)稀释，在第0、3、6、9、12、15d测定不同温度下的粒径。
[0087]
结果如图4所示，在-80℃条件下，aaelns放置30d粒径未发生明显变化；在4℃条件下，0～6d内粒径没有显著变化，随着时间的增加，粒径出现不同程度的增加，可能有聚集现象，表明aaelns在-80℃条件下储存较稳定。综上，aaelns在4℃中短期(如6天内)保存，长期保存(如30d以上)需置于-80℃。
[0088]
1.3.3ph对aaelns稳定性的影响
[0089]
将aaelns取适量分装于ep管中，分别加入用蒸馏水、hcl和naoh配置的三种不同ph溶液(1.2，6.8和7.8)，放置于恒温震荡水浴锅中(37℃)，分别在第0和2h测定粒径。
[0090]
胃液、小肠液和结肠液的ph值分别约为1.2、6.8和7.8，探究aaelns在不同ph下的粒径稳定性，为aaelns口服递送提供参考数据。
[0091]
如图5所示，在0～2h内，aaelns在三种不同环境下粒径范围均有不同程度的增加。ph 1.2的酸性条件下，粒径基本不发生变化；在ph 6.8和ph 7.8的溶液中，粒径的跨度较明显。表明aaelns短时间内在酸性溶液中较稳定。
[0092]
1.4体外模拟消化本实施例制备得到的aaelns
[0093]
通过测定不同时间点在模拟胃液、小肠液和结肠液中的粒径变化评价aaelns在胃肠道中的稳定性。胃模拟液、小肠模拟液和结肠模拟液的配方如下：
[0094]
表2模拟消化液的名称及配方
[0095][0096]
口服给药时需要考虑胃肠道环境对植物elns稳定性的影响，如胃液的低ph，各种消化酶等。
[0097]
表3aaelns在模拟胃液、小肠液和结肠液中的粒径模拟胃液
[0098][0099][0100]
模拟小肠液
[0101][0102]
模拟结肠液
[0103][0104]
结果表明，在三种模拟液中，aaelns的粒径均呈现增长趋势(表3)。其中，在模拟胃液0～4h内，aaelns的粒径变化从170nm增长到了179nm；在模拟小肠液中，从初始的184.8
±
8.9nm，在孵育12h之后，粒径逐渐稳定在209nm；在模拟结肠液中，初始粒径为143.4
±
8.5nm，在孵育的第24、48和72h粒径分别为211.5
±
4.9nm，215.8
±
2.1nm和217.4
±
7.9nm，增幅逐渐减小。相较于模拟胃液、小肠液，aaelns在结肠液中粒径变化最大(图6)。因此，aaelns在通过模拟胃液中可能保持了完整性，可到达肠道。
[0105]
1.4.2体内荧光示踪
[0106]
dir标记aaelns：在2.2mg/ml的aaelns中加入终浓度为5μm的dir染料，37℃摇床孵育20min，离心60min(120000g，4℃)，弃上清，用pbs重悬。以上试验在避光条件下进行。
[0107]
活体成像：c57bl/6小鼠以40mg/只/200μl灌胃dir-aaelns，分别在3、6、9、12h麻醉小鼠，进行活体成像。
[0108]
器官成像：处死小鼠，取出心、肝脏、脾脏、肺、肾脏、结肠、脂肪组织成像。
[0109]
为了进一步确定aaelns是否可以到达肠道，通过荧光示踪aaelns的在体内的分布。
[0110]
如图7所示，通过x-ray活体成像小鼠，在3h时出现荧光信号，6h时逐渐积累荧光信号，而在9h和12h荧光信号逐渐减弱。选择aaelns在体内消化6h时(此时荧光强度最大)的小鼠解剖进行器官成像，结果显示，在小鼠的肝脏、肾脏和结肠存在荧光信号，其中在结肠中的荧光信号强度最大。综上，aaelns可以被c57bl/6小鼠吸收，主要分布于结肠组织。
[0111]
1.4.3小鼠粪便预处理
[0112]
选用spf级雌性6～8周龄c57bl/6小鼠(18～20g)，ivc系统中进行饲养，温度21℃～25℃，相对湿度(50
±
10％)，12h光照/黑暗循环。适应性喂养一周，收集结肠内粪便于无菌管中(4℃)。在厌氧工作站中，取小鼠结肠粪便样品用无菌pbs按照1:10(w/v)稀释，涡旋混匀5min，无菌纱布过滤获得肠菌液，保存于4℃并在30min内使用完毕。
[0113]
1.4.4粪便样品发酵
[0114]
配置粪便培养基(1l)：2.0g蛋白胨，2.0g酵母提取物，0.1g nacl，0.04g k2hpo4，0.04g kh2po4，0.01g mgso4·
7h2o，0.01g cacl2·
6h2o，2g nahco3，0.005g氯化血红素，0.5g l-半胱氨酸盐酸盐，0.5g猪胆盐，1mg刃天青(1％，m/v)，2.0ml tween-80，1.0ml维生素k1，蒸馏水。
[0115]
将培养基的ph调为7.0并进行高压灭菌(115℃，20min)，在厌氧产气袋中放置过夜(37.8℃)。调节培养基的ph为6.8，模拟结肠环境。定量分装培养基(13.5ml)在发酵管中，加入浓度为200μg/ml aaelns样品和1.5ml肠菌液，对照管加入等体积的pbs，每组3个平行。于恒温37℃，气体组分为85％n2，10％h2，5％co2的厌氧培养箱中培养48h。
[0116]
1.4.5ph测定
[0117]
在厌氧发酵第0、4、8、16、24、36、48h时，取样后于室温下放置10min，ph计测定，设
置3个平行。
[0118]
通过收集小鼠结肠粪便进行体外发酵，对发酵过程中发酵液的ph进行测定，如图8所示，两组的ph呈现整体下降趋势，且aaelns组的ph始终低于pbs组。酵解48h之后，两组的ph分别从初始7.13、7.19下降到6.74和6.58。综上，aaelns影响了结肠微生态的ph环境。
[0119]
1.4.6肠道菌群测定
[0120]
利用快速dna自旋提取试剂盒提取盲肠内容物中微生物基因组总dna。使用引物338f(5'-actcctacgggaggcagca-3'(seq id no.1))和806r(5'-ggactachvgggtwtctaat-3'(seq id no.2))扩增16s rrna基因v3～v4区。通过pcr扩增产物后制备测序文库，并在illumina miseq平台上进行测序。qiime(v1.8.0，http://qiime.org/)用于识别和消除问题序列。根据97％的序列相似性进行序列合并，并给出操作分类单元otu。基于α-多样性和β-多样性，对粪便微生态进行菌落组成分析，对比aaelns处理对门和属水平上的微生物的影响。
[0121]
1.4.6.1本实施例的aaelns对肠道菌群α-多样性的影响
[0122]
利用illuminamiseq平台分析aaelns对肠道菌群的影响。共确定1027752条序列，序列长度分布在400-500bp(图9)。采用qiime软件，通过chao1指数、simpson指数、shannon指数、faith-pd和observed-species指数分析确定样本的测序深度(表4)。
[0123]
表4小鼠肠道菌群群α-多样性分析
[0124][0125]
结果表明，相较于pbs组，aaelns组的chao1指数和observed-species显著高于pbs组(p《0.05)。通过对结肠粪便微生态α-多样性的分析，表明aaelns可能作为一个潜在的营养物质，改变肠道菌群多样性。
[0126]
1.4.6.2aaelns对肠道菌群β-多样性的影响
[0127]
基于物种水平的主成分分析结果如图10a所示，群落在第一主成分对检测结果贡献率79.7％，第二主成分的贡献率为17.5％，两者之和大于50％。基于unweighted unifrac距离来进行主坐标分析。如图10b所示。群落在第一主成分对检测结果贡献率29％，第二主成分的贡献率为21.6％。aaelns处理后小鼠粪便发酵液的肠道微生物群落能够与pbs组较好的区分，表明两组菌群组成具有差异性。综上，表明aaelns能够影响结肠微生物的群落结构。
[0128]
1.4.6.3aaelns对肠道菌群组成的影响
[0129]
如图11所示，当粪便微生物发酵48h后，在门水平上，两组的主要优势菌群为变形菌门(proteobacteria)和厚壁菌门(firmicutes)。与pbs组相比，aaelns组proteobacteria丰度显著降低(p《0.01)，而firmicutes丰度显著升高(p《0.01)。表明不同ph值的菌群结构不同。在属水平上(图12)，两组的主要优势菌群包括变形杆菌(proteus)和乳酸杆菌(lactobacillus)。aaelns干预后增加了不动杆菌属(acinetobacter)和lactobacillus的
相对丰度，降低了proteus、大肠杆菌属-志贺氏菌属(escherichia-shigella)和索氏梭菌(paeniclostridium)的丰度。丰度降低的proteus、escherichia-shigella和paeniclostridium均为肠道致病菌，在肠病患者的中丰度较高。丰度升高的acinetobacter具有产生短链脂肪酸改善结肠炎的作用。综上，aaelns改变了结肠肠道菌群的组成，促进了有益菌的丰度，抑制了有害菌的丰度。
[0130]
实施例2
[0131]
一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(actinidia arguta exosome-like nanoparticles，aaelns)的制备方法，步骤如下：
[0132]
选用新鲜的软枣猕猴桃成熟期果实，清洗干净后研磨成汁，取汁液于50ml离心管中，在3℃条件下依次进行3500g离心15min取上清液a、上清液a 6500g离心35min取上清液b、上清液b 9500g离心35min取上清液c、上清液c119000g离心75min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000g离心75min，小心弃干净上清得到沉淀2，用pbs缓冲液溶解沉淀2，吹打混匀后为aaelns。以上操作均在无菌条件下进行。
[0133]
实施例3
[0134]
一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒(actinidia arguta exosome-like nanoparticles，aaelns)的制备方法，步骤如下：
[0135]
选用新鲜的软枣猕猴桃成熟期果实，清洗干净后研磨成汁，取汁液于50ml离心管中，在6℃条件下依次进行4500g离心5min取上清液a、上清液a 7500g离心25min取上清液b、上清液b 10500g离心25min取上清液c、上清液c121000g离心65min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1121000g离心65min，小心弃干净上清得到沉淀2，用pbs缓冲液溶解沉淀2，吹打混匀后为aaelns。以上操作均在无菌条件下进行。
[0136]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备改善肠道菌群产品中的应用，其特征在于，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：将软枣猕猴桃果实的汁液进行3500～4500g离心5～15min取上清液a、上清液a6500～7500g离心15～25min取上清液b、上清液b9500～10500g离心25～35min取上清液c、上清液c119000～121000g离心65～75min取沉淀1，将沉淀1用无菌pbs缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000～121000g离心65～75min得到沉淀2，pbs缓冲液重悬沉淀2，即得软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述离心的温度为2～6℃。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述软枣猕猴桃果实的汁液的制备包括将软枣猕猴桃果实研磨得到。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒使乳酸杆菌、不动杆菌的丰度增加，使变形杆菌、大肠杆菌-志贺氏菌和索氏梭菌丰度降低。5.根据权利要求1所述的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备促进益生菌生长产品中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述益生菌包括乳酸杆菌。7.根据权利要求1所述的软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备抑制有害菌生长产品中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述有害菌包括变形杆菌、大肠杆菌-志贺氏菌和索氏梭菌中的一种或多种。

技术总结
本发明提供了一种软枣猕猴桃类外泌体样纳米颗粒在制备改善肠道菌群产品中的应用，属于生物制备技术领域，包括将软枣猕猴桃果实的汁液进行3500～4500g离心5～15min取上清液a、上清液a6500～7500g离心15～25min取上清液b、上清液b9500～10500g离心25～35min取上清液c、上清液c119000～121000g离心65～75min取沉淀1，将沉淀1用无菌PBS缓冲液吹打重悬得到重悬液1，重悬液1119000～121000g离心65～75min得到沉淀2，PBS缓冲液重悬沉淀2，即得。本发明制备得到的AAELNs具有改善肠道菌群的作用。制备得到的AAELNs具有改善肠道菌群的作用。制备得到的AAELNs具有改善肠道菌群的作用。


技术研发人员：徐红艳 夏广军
受保护的技术使用者：延边大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/9