青蒿水提取物在抑制青枯病菌中的应用

1.本发明属于病害防治技术领域，具体涉及一种青蒿水提取物在抑制青枯病菌中的应用。


背景技术：

2.青枯病是一种导致全株萎蔫的细菌性病害，病原为青枯病菌。青枯病菌通过雨水、灌溉水、地下害虫、操作工具等传播，多从寄主根部或茎基部皮孔和伤口侵入。前期属于潜伏状态，条件适宜时。即可在维管束内迅速繁殖。并沿导管向上扩展。致使导管堵塞，进一步侵入邻近的薄壁细胞组织，使整个输导组织被破坏而失去功能。茎、叶因得不到水分的供应而萎蔫。南方及多雨年份发生普遍而严重。发病严重时造成植株青枯死亡，导致严重减产甚至绝收。
3.目前，中草药杀菌剂因为其对环境无污染和无毒副作用等优点得到了大量研究。现推广使用的中草药杀菌剂种类繁多，效果参差不齐，还存在施用剂量大，杀菌范围窄和杀菌效果不显著等缺点，因此为了保证人们的身体健康和环境质量的提高，农业生产和蔬果种植方面亟需一种高效、无公害和环境友好的抑制剂。
4.cn108200919a公开了一种防治青枯病的植物源农药，将1-2%体积的海藻糖、0.1-0.6%体积的壳聚糖和和余量的中药组分均匀混合，制成含中药活性混合培养基，再将复合微生物菌株接种到含中药活性混合培养基进行发酵培养，直至微生物的浓度达到40亿株/ml，即得到防治青枯病的植物源农药，该中药组分包括苦参、青蒿、白花地胆草、金银花、穿心莲、白藓皮和地肤子。该发明能够无公害地有效防治青枯病。
5.cn102731201a公开了一种防治烟草青枯病的复合制剂及方法，该复合制剂包括纯植物源药剂、微生物肥，奇农素3种药剂，其中纯植物源药剂以青蒿为主要成分。该发明的技术方案具有病指低，药效持续时间长的特点，适用于作物病虫害技术领域。
6.cn105145195a公开了一种番茄青枯病的综合防治方法，该发明在番茄开始成熟前一个月施用中药微量肥，其中中药微量肥由麦饭石粉60-80份，银杏叶提取物3-5份，青蒿提取物6-8份，艾叶提取物5-6份，金银花提取物2-3份，板蓝根提取物4-6份，百部提取物2-3份和仙鹤草提取物4-5份组成。
7.青蒿分布于我国南北各地，生于旷野、山坡、路边、河岸等处，主要含青蒿素、萜类、黄酮类、挥发油等成分，具有抗菌、抗病毒、抗疟等作用。综上所述，现在关于防治青枯病菌的中草药杀菌剂多为复配型农药，组成较多而且配置复杂，并且大部分适用的植物范围窄，因此需要对现有的中草药杀菌剂进行进一步的改进。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种青蒿水提取物在抑制青枯病菌中的应用。
9.本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种青蒿水提取物在制备青枯病菌抑制剂中的应用。
10.在一些实例中，所述青蒿水提取物的制备方法为：将青蒿烘干粉碎过筛，加入水混合进行多次抽滤，最后合并滤液，浓缩即得到所述青蒿水提取物。
11.在一些实例中，所述每次抽滤前，水加入量为青蒿或前一步抽滤所得到的滤渣的体积的4.9～5.1倍。
12.在一些实例中，所述抽滤次数为4～6次。
13.在一些实例中，所述抽滤温度为40～50℃。
14.在一些实例中，所述抽滤时间为1.4～1.6h。
15.在一些实例中，所述浓缩温度为45～50℃。
16.在一些实例中，所述青蒿水提取物的制备方法为：将青蒿烘干粉碎过筛，加入青蒿4.9～5.1倍的水混合在40～50℃抽滤1.4～1.6h，重复4～6次，每次抽滤补充的水量为滤渣体积的4.9～5.1倍，最后合并滤液，45～50℃浓缩即得到所述青蒿水提取物。
17.在一些实例中，所述抑制剂为水乳制剂或微乳制剂。
18.另外一个方面，本发明提供一种植物青枯病的防治方法，包括使用青蒿水提取物接触种植植物的土壤和/或植株的茎叶。
19.在一些实例中，在植物栽种前使用青蒿水提取物处理土壤。
20.在一些实例中，在植物栽种使用青蒿水提取物浇灌植株。
21.在一些实例中，在植物发芽后2～4周时，使用青蒿水提取物喷洒在所述植物的地上部分。
22.在一些实例中，所述植物为番茄、土豆、甜椒、茄子、烟草、辣椒、紫苏、萝卜、草莓、香蕉、雏菊、菊花或向日葵中的任意一种。
23.本发明的有益效果是：本发明的青蒿水提取物用水提取而非有机溶剂，真正做到无公害、环境友好，而且原料易得、成本低，用生物农药取代化学农药，符合生物源农药开发方向，对于发展有机农业和绿色农业意义重大，减少了环境污染和三废排放。
附图说明
24.图1为浓度为14.8g/ml的青蒿水提取物抑菌实验结果图。
25.图2为浓度为11.84g/ml的青蒿水提取物抑菌实验结果图。
26.图3为浓度为7.4g/ml的青蒿水提取物抑菌实验结果图。
27.图4为浓度为3.7g/ml的青蒿水提取物抑菌实验结果图。
28.图5为浓度为1.85g/ml的青蒿水提取物抑菌实验结果图。
29.图6为浓度为7.40g/ml的青蒿乙醇提取物抑菌实验结果图。
30.图7为浓度为3.70g/ml的青蒿乙醇提取物抑菌实验结果图。
31.图8为浓度为1.85g/ml的青蒿乙醇提取物抑菌实验结果图。
32.图9为浓度为0.74g/ml的青蒿乙醇提取物抑菌实验结果图。
33.图10为浓度为0.37g/ml的青蒿乙醇提取物抑菌实验结果图。
34.其中，图1～图5中，左侧抑菌圈均为提取物产生的抑菌圈，右侧抑菌圈均为水产生的抑菌圈；图6～图10中，1为提取液产生的抑菌圈，2为纯水产生的抑菌圈，3为溶剂产生的
抑菌圈，4为链霉素产生的抑菌圈。
具体实施方式
35.下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
36.在本发明实施例中，所述青蒿水提取物的制备方法为：将青蒿烘干粉碎过筛，加入水混合进行多次抽滤，最后合并滤液，浓缩即得到所述青蒿水提取物。
37.在本发明实施例中，所述每次抽滤前，水加入量为青蒿或前一步抽滤所得到的滤渣的体积的4.9～5.1倍。
38.在本发明实施例中，所述抽滤次数为4～6次。
39.在本发明实施例中，所述抽滤温度为48～52℃。
40.在本发明实施例中，所述抽滤时间为1.4～1.6h。
41.在本发明实施例中，所述浓缩温度为48～52℃。
42.针对传统化学农药毒性强、残留高、病菌对药剂抗药性不断增强，大田受化肥、高毒农药污染严重，同类生物产品成本高，药效单一的问题，本发明以青蒿为主体，减少由虫害或者病菌带来的进一步伤口侵染，营造利于植株生长的根部微环境，促进植株韧皮部、维管束及根系等吸收和积累营养能力，以增强植株对病害的抵抗能力，利于提高植物产质量。
43.实施例1）青蒿水提取物制备青蒿水提取物采用冷浸法，将青蒿烘干，用粉碎机粉碎后过60目筛。称取青蒿37g。将称好的植物材料混合加入5倍体积的水，超声（温度50℃）振荡1.5h后，进行抽滤，将滤渣再次加入5倍体积的水进行提取，3次后合并滤液。把滤液用旋转蒸发仪在50℃进行浓缩，完全旋干后，用2.5ml水进行溶解，将溶液保存在4℃冰箱中待用，溶液浓度为14.8g/ml。
44.2）药剂配制青蒿浓度配制：将青蒿水提取物配置成浓度为14.8g/ml、11.87g/ml、7.4g/ml、3.7g/ml、1.85g/ml。
45.配制方法如下：14.8g/ml:母液浓度为14.8g/ml；11.84g/ml:取400μl母液加入100μl水；7.4g/ml：取250μl母液加入250μl水；3.7g/ml：取100μl母液加入300μl水；1.85g/ml：取100μl母液加入700μl水；溶剂浓度：为水。
46.3）抑菌实验供试病原菌青枯菌为毒性较强的茄科劳尔氏菌（r.solanacearum）。培养好的青枯菌与 50%的甘油 1:1 混合贮存于-80 ℃冰箱内。
47.培养基包括cpg琼脂培养基和cpg液体培养基，分别高压灭菌处理20min，具体组成如下：cpg琼脂培养基：细菌学蛋白胨10 g/l，葡萄糖10 g/l，酪蛋白水解物1 g/l，琼脂粉 18 g/l；
cpg液体培养基：细菌学蛋白胨10 g/l，葡萄糖10 g/l，酪蛋白水解物1 g/l。
48.取10mlcpg液体培养基倒入离心管中，将保存在-80℃冰箱中的青枯菌解冻后取200μl加入倒好的液体培养基中，28℃ 220rmp摇床过夜培养。取过夜培养的菌液200μl加入液体培养基中28℃ 220rmp摇床培养12小时，放入4℃冰箱待用。
49.在超净工作台上进行无菌操作，cpg培养基凉至约50℃时与青枯菌（终浓度为od
600
=0.05）混合倒于培养皿中，待培养基全部凝固，用直径0.5cm的打孔器在cpg培养基上打孔，在孔中依次加入不同浓度的40μl青蒿水提取物、40μl水（每个处理3个重复）。4℃预扩散2h后置于28℃环境条件下培养至长满培养基。
50.观察抑菌圈大小并用十字交叉法对抑菌圈直径进行测量求直径平均，3个菌落再次取平均，抑菌圈大小即为抗菌活性大小，分为4个等级：无抑菌圈
“‑”
，抑菌圈直径小于1.0cm为“+”，抑菌圈直径1.1-1.5cm为“++”，抑菌圈直径大于1.5cm为“+++”。
51.抑菌圈大小=实际测量抑菌圈直径-0.5cm。
52.4）实验结果采用单层平板法测定提取液抑菌效果，实验结果如表1以及图1～图5所示。
53.表1
54.从表1以及图1～图5中可以看出当青蒿水提取物浓度为14.80g/ml时，抑菌圈最大为2.44cm；当浓度为11.84g/ml时，抑菌圈直径为1.84cm，仅次于14.80g/ml。整体呈现出随着浓度降低抑菌圈直径逐渐减小的趋势，ec50值为1.07 g/ml。水处理不产生抑菌圈，符合实验预期。
55.对比例1）青蒿乙醇提取物制备青蒿乙醇提取物采用冷浸法，将青蒿烘干，用粉碎机粉碎后过60目筛。称取青蒿37g。将称好的植物材料混合加入5倍体积的95%的乙醇，超声（温度40℃）振荡1.5h后，进行抽滤，将滤渣再次加入5倍体积的乙醇进行提取，3次后合并滤液。把滤液用旋转蒸发仪在45℃进行浓缩，完全旋干后，用5ml 95%乙醇进行溶解，将溶液保存在4℃冰箱中待用，溶液浓度为7.4g/ml。
56.2）药剂配制将青蒿乙醇提取物配置成浓度为7.4g/ml、3.7g/ml、1.85g/ml、0.74g/ml、0.37g/ml。
57.3）抑菌实验
供试病原菌青枯菌为毒性较强的茄科劳尔氏菌（r.solanacearum）。培养好的青枯菌与 50%的甘油 1:1 混合贮存于-80 ℃冰箱内。
58.培养基包括cpg琼脂培养基和cpg液体培养基，分别高压灭菌处理20min，具体组成如下：cpg琼脂培养基：细菌学蛋白胨10 g/l，葡萄糖10 g/l，酪蛋白水解物1 g/l，琼脂粉 18 g/l；cpg液体培养基：细菌学蛋白胨10 g/l，葡萄糖10 g/l，酪蛋白水解物1 g/l。
59.取10mlcpg液体培养基倒入离心管中，将保存在-80℃冰箱中的青枯菌解冻后取200μl加入倒好的液体培养基中，28℃ 220rmp摇床过夜培养。取过夜培养的菌液200μl加入液体培养基中28℃ 220rmp摇床培养12小时，放入4℃冰箱待用。
60.采用的是单层平板法将灭菌好的cpg培养基取20ml加入到培养皿中，待其全部凝固后向其中加入100μl青枯菌液（od
600
=0.1）均匀涂布。晾干后用0.5cm的打孔器打孔，在cpg培养基上以正方形的形状打孔，在孔中依次加入不同等浓度的40μl青蒿乙醇提取物、40μl不同浓度的溶剂、40μl纯水、40μl链霉素（每个处理3个重复）。4℃预扩散2h后置于28℃环境条件下培养直至细菌长满。观察抑菌圈大小并用十字交叉法对抑菌圈直径进行测量2次求直径平均，3个菌落再次取平均，抑菌圈大小即为抗菌活性大小，分为4个等级：无抑菌圈
“‑”
，抑菌圈直径小于1.0cm为“+”，抑菌圈直径1.1-1.5cm为“++”，抑菌圈直径大于1.5cm为“+++”。
61.抑菌圈大小=实际测量抑菌圈直径-0.5cm。
62.4）实验结果采用单层平板法测定提取液抑菌效果，实验结果如表2以及图6～图10所示。
63.表2
64.从表2以及图6～图10中可以看出当青蒿乙醇提取物浓度为7.40g/ml时，抑菌圈直径为1.80
±
0.05cm效果最好；浓度为3.70g/ml时次之，抑菌圈直径为1.00
±
0.01cm；浓度为1.85g/ml时，抑菌圈最小为0.77
±
0.03cm。其他浓度没有抑菌圈。抑菌圈直径整体随着处理浓度降低而降低。纯水都没有抑菌圈，符合实验预期。对照组链霉素由于他在培养皿中扩散效果不佳，没有接触到青枯菌，导致他没有产生抑菌圈。
65.以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.青蒿水提取物在制备青枯病菌抑制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述青蒿水提取物的制备方法为：将青蒿烘干粉碎过筛，加入水混合进行多次抽滤，最后合并滤液，浓缩即得到所述青蒿水提取物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述每次抽滤前，水加入量为青蒿或前一步抽滤所得到的滤渣的体积的4.9～5.1倍。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抽滤次数为4～6次。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抽滤温度为40～50℃。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抽滤时间为1.4～1.6h。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述浓缩温度为45～50℃。8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述青蒿水提取物的制备方法为：将青蒿烘干粉碎过筛，加入青蒿4.9～5.1倍的水混合在40～50℃抽滤1.4～1.6h，重复4～6次，每次抽滤补充的水量为滤渣体积的4.9～5.1倍，最后合并滤液，45～50℃浓缩即得到所述青蒿水提取物。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为水乳制剂或微乳制剂。10.一种植物青枯病的防治方法，其特征在于，包括使用青蒿水提取物接触植物的土壤和/或植株的茎叶。

技术总结
本发明公开了青蒿水提取物在抑制青枯病菌中的应用，该青蒿水提取物的制备方法为：将青蒿烘干粉碎过筛，加入纯水混合进行多次抽滤，最后合并滤液浓缩即得到所述青蒿水提取物。该方法针对传统化学农药毒性强、残留高、病菌对药剂抗药性不断增强，大田受化肥、高毒农药污染严重，同类生物产品成本高，药效单一的问题，以青蒿为主体，用生物农药取代化学农药，符合生物源农药开发方向，而且原料易得、成本低，对于发展有机农业和绿色农业意义重大，减少了环境污染和三废排放。少了环境污染和三废排放。少了环境污染和三废排放。


技术研发人员：冯远娇 杜甜甜 诸卫平 张晨宁 舒迎花 王建武
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/8/9