一种利用废弃玉米浆发酵生产灵菌红素的方法与流程

sq, et al. mutant breeding of serratia marcescens strain for enhancing prodigiosin production and application to textiles. prep biochem biotechnol,2013, 43 (3) : 271-284.）。另一方面，现有灵菌红素生产菌株普遍具有底物耐受性差的特点，在高浓度底物下的生物活性急剧降低，制约了其产率的进一步提高。
4.此外还有研究发现，灵菌红素在紫外线照射会严重影响其稳定性，且这种稳定性同时受到ph的影响较大，ph值越高，影响也就越大，在ph为3时色素较稳定，在紫外线的照射下1ｈ后色素含量仍能保持原来的83％左右，而碱性条件下紫外照射后含量显著降低。另外发现色素经室外直射光照射后，吸光度会急剧下降。在照射7ｈ时，色素的损失率已高达92％，这一发现说明该色素在直射光下不稳定，可能是因为红色素吡咯环中的双键被破坏。粘质沙雷氏菌具有条件致病性，且遗传操作工具尚不成熟，基因改造的周期较长且效果可能并不显著，传统诱变筛选具有突变率高、成本低及菌株稳定性高等优势，是目前筛选非模式微生物最为有效的方式。
5.经过前期研究，我们以serratia marcescens nrrl b-1481（购自atcc）作为出发菌株，通过artp和紫外诱变的手段对其进行复合诱变，并通过提高底物浓度、培养ph及光照强度进一步对突变后菌株进行筛选，获得一株耐受高底物浓度且光耐受的灵菌红素高产菌株，即serratia marcescens zn86。并提供了应用该发酵菌株进行发酵的方法。
6.然而该发酵方法中使用的发酵培养基是以胰蛋白胨、黄豆饼粉等为氮源，成本高昂，不利于降低灵菌红素的生产成本。
7.玉米浆是生产玉米淀粉的副产物，原料为玉米糁、水、玉米汁。制造玉米淀粉须将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩即制成黄褐色的液体，即为玉米浆，含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大约40%～50%固体物质。味道微咸，是微生物生长很普遍应用的有机氮源，它还能促进青霉素等抗生素的生物合成。玉米浆是一种优质的发酵原料，是湿法工艺生产玉米淀粉时产生的酸性黏稠液体副产物，其成本低廉且富含多种氨基酸、蛋白质和可溶性糖类等，是目前氨基酸工业中最为常用的廉价氮源。
8.但将玉米浆作为灵菌红素发酵培养基进行发酵生产的技术方案尚未见报道。目前仍然不清楚降低灵菌红素生产成本的有效途径。


技术实现要素：

9.为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种灵菌红素新的发酵生产工艺，以提高产品的转化率、降低灵菌红素生产成本。
10.在第一方面，本发明提供一种用于生产灵菌红素的发酵培养基，包含：氮源、花生饼粉2.5～4 g/l、cacl2 2.5～4.0 g/l、氯化钠 5.0 g/l、蔗糖5～7.5 g/l、甘氨酸0.5～1 g/l，脯氨酸0.5～1 g/l，消泡剂1 ml/l；其特征在于：所述氮源由玉米浆干粉和胰蛋白胨组成，二者的比例为16:4～8:12。
11.玉米浆干粉可由商业渠道常规获得，其是由生产玉米淀粉过程中的废弃浸泡液浓缩干燥制备得到，因而成本极为低廉。
12.作为优选，所述玉米浆干粉和胰蛋白胨的浓度总和在16～24 g/l的范围。
13.作为优选，所述玉米浆干粉的浓度为8～16 g/l，所述胰蛋白胨的浓度为4～12 g/l。
14.其中，玉米浆干粉的浓度可以独立地为8 g/l、9 g/l、10 g/l、11 g/l、12 g/l、13 g/l、14 g/l、15 g/l、16 g/l，胰蛋白胨的浓度可以独立地为4 g/l、5 g/l、6 g/l、7 g/l、8 g/l、9 g/l、10 g/l、11 g/l、12 g/l。
15.在第二方面，本发明提供一种灵菌红素发酵生产方法，其特征在于应用如上所述的培养基发酵粘质沙雷氏菌以生产灵菌红素。
16.作为优选，所述粘质沙雷氏菌为serratia marcescens pg-zeno-001菌株，已于2023年3月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2023361，保藏单位地址： 中国 北京。
17.作为进一步优选，所述灵菌红素发酵生产方法包括如下步骤：（1）发酵菌株的选择：菌株为粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)pg-zeno-001：（2）发酵培养基配制：玉米浆干粉 16 g/l，胰蛋白胨4 g/l、花生饼粉2.5～4 g/l、cacl2 2.5～4.0 g/l、氯化钠 5.0 g/l、蔗糖5～7.5 g/l、甘氨酸0.5～1 g/l，脯氨酸0.5～1 g/l，消泡剂1 ml/l，使用盐酸将培养基ph 调至 6.0；121℃湿热灭菌20分钟后备用；（3）补料培养基配制：玉米浆干粉 300 g/l、花生饼粉50 g/l、蔗糖300 g/l、脯氨酸10 g/l，不调ph，121℃湿热灭菌20分钟后备用；（4）斜面制备：将上述发酵菌株甘油管接种lb斜面进行活化培养，25～30℃恒温培养 24～48 h，制得斜面，斜面冷藏待用；（5）摇瓶种子培养：将步骤(4)得到的斜面菌株接种于以灭菌的装有摇瓶lb种子培养基的摇瓶中，200 rpm，在25～30℃培养8 h左右：（6）一级种子培养：将步骤（5）培养好的摇瓶种子按 1%体积比接种于已灭菌的装有5 l的lb培养基的10 l一级种子罐，开始培养，培养条件：通气量 0.3～1.5 vvm，罐压0.1 mpa， 温度25～30
°
c，溶解氧 1%～80%饱和度，培养时间 10 h；（7）发酵罐发酵：将步骤（6）培养好的一级种子按 5%～10%体积比接种于已灭菌的装有50 l发酵培养基的100 l发酵罐，开始培养；培养条件：初始通气量 0.3 vvm，罐压0.1 mpa，温度25～30
°
c，培养时间 48～96小时；溶氧控制方案为：0-12 h初始转速为200 rpm，随着溶氧的降低缓慢提高转速至350 rpm，随后通过搅拌与溶氧关联控制溶解氧30%；12～36 h通过溶氧与补料关联控制溶解氧15%，36 h～发酵最后降低搅拌转速至200 rpm，通过溶氧与补料关联控制溶解氧10%。
18.基于以上的技术方案，本发明能够取得如下的有益效果：
19.1. 创新性地使用废弃玉米浆原料作为灵菌红素大规模生产的氮源，重塑灵菌红素低成本大规模生产的新工艺，并在此过程中惊讶地发现，与其他氮源相比，废弃玉米浆对胰蛋白胨具有最佳的替代效果，有望构建淀粉工业环保生产的新闭环。
20.2. 经过成分优化后的发酵培养基，用于发酵生产灵菌红素，在100l发酵罐的大规模发酵中，于48 h的灵菌红素产量可达10.68 g/l。
附图说明
21.图1为本发明大规模发酵生产中灵菌红素产量的变化；
实施方式
22.下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步说明。
23.实施例1 发酵生产的氮源筛选
24.为了确定灵菌红素发酵的最适氮源，我们分别选取20 g/l的玉米浆干粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛奶蛋白胨、明胶蛋白胨、胰蛋白胨（以上备选氮源购自上海生工）作为备选氮源，进行摇瓶实验。操作步骤如下：（1）发酵菌株的准备：菌株为粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)pg-zeno-001，保存于甘油管中；（2）斜面制备：将上述发酵菌株从甘油管中接种至lb斜面进行活化培养，25～30℃恒温培养 24～48小时，制得斜面，将斜面冷藏待用；（3）试管种子培养：将步骤（2）得到的斜面菌株接种于以灭菌的装有5 ml lb种子培养基的试管中，在25～30℃培养8 h左右；（4）发酵培养基配制：氮源母液、花生饼粉2.5～4 g/l、cacl
2 2.5～4.0 g/l、氯化钠 5.0 g/l、蔗糖5～7.5 g/l、甘氨酸0.5～1 g/l，脯氨酸0.5～1 g/l，消泡剂1 ml/l，使用盐酸将培养基ph 调至 6.0；根据实验要求，改变氮源母液的浓度，实验组氮源母液如表1（第1-6组）所示。
25.（5）发酵培养：将步骤（3）培养好的试管种子按 1%体积比接种于已灭菌的装有100 ml的发酵培养基的500 ml摇瓶，开始培养，培养条件：温度25～130℃，200 rpm，培养48 小时后检测最终的发酵液的菌体湿重和灵菌红素单位产量，各组结果如表1所示。
26.表1、不同氮源摇瓶实验结果
27.首先对比了不同种类的单一氮源，即20 g/l玉米浆干粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛奶蛋白胨、明胶蛋白胨、胰蛋白胨，结果如表1所示。最终确定了胰蛋白胨是生产效果最好的单一氮源，最终的菌体湿重最高达到20.1 g/l，灵菌红素含量最高为3.1 g/l。值得注意的是，使用几乎零成本的玉米浆干粉作为氮源的实验组，灵菌红素产量也可达到1.5 g/l，其菌体湿重高于同浓度的大豆蛋白胨和牛奶蛋白胨，表明其有非常大的灵菌红素生产潜力。
28.虽然胰蛋白胨的发酵产量最高，但是由于其成本较高，限制了大规模的生产应用，因此以玉米浆干粉按不同比例替代胰蛋白胨，在保证产量的同时维持生产成本的经济性，通过改变玉米浆干粉和胰蛋白胨的配比（如表1第7-12组所示），我们惊讶地发现，在胰蛋白胨部分地由玉米浆干粉替代后，灵菌红素的产量并未明显下降（例如第9-12组），在玉米浆干粉与胰蛋白胨1:1投加时，菌体湿重甚至高于以胰蛋白胨为单一氮源的培养条件。由此确定了最佳的生产氮源为玉米浆干粉:胰蛋白胨浓度比例在16:4至8:12的范围内。
29.虽然以较高的胰蛋白胨浓度可以提高灵菌红素产量，但是出于生产的低碳经济性考虑，最终确定的最佳的培养基配方为：玉米浆干粉 16 g/l，胰蛋白胨4 g/l、花生饼粉2.5～4 g/l、cacl
2 2.5～4.0 g/l、氯化钠 5.0 g/l、蔗糖5～7.5 g/l、甘氨酸0.5～1 g/l，脯氨酸0.5～1 g/l，消泡剂1 ml/l，使用盐酸将培养基ph 调至 6.0。
30.实施例2 发酵液中灵菌红素含量的检测方法
31.取1 ml混匀的粘质沙雷氏菌发酵液，加4 ml酸性甲醇母液，超声破胞15-20 min，低温离心去沉淀，将上清液稀释5倍，之后再按梯度稀释不同倍数，各取200μl加入96孔板中测535 nm吸光度；所述酸性甲醇的ph约为3.0。
32.实施例3 100l发酵罐上灵菌红素的大规模生产
33.按照实施案例1所确定的灵菌红素生产的最终发酵培养基配比，验证其在100l规模的发酵罐中生产灵菌红素的产率。
34.（1）发酵菌株的选择：菌株为粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)pg-zeno-001：（2）发酵培养基配制：玉米浆干粉 16 g/l，胰蛋白胨4 g/l、花生饼粉2.5～4 g/l、cacl
2 2.5～4.0 g/l、氯化钠 5.0 g/l、蔗糖5～7.5 g/l、甘氨酸0.5～1 g/l，脯氨酸0.5～1 g/l，消泡剂1 ml/l，使用盐酸将培养基ph 调至 6.0；121℃湿热灭菌20分钟后备用；（3）补料培养基配制：玉米浆干粉 300 g/l、花生饼粉50 g/l、蔗糖300 g/l、脯氨酸10 g/l，不调ph，121℃湿热灭菌20分钟后备用；（4）斜面制备：将上述发酵菌株甘油管接种lb斜面进行活化培养，25～30℃恒温培养 24～48 h，制得斜面，斜面冷藏待用；（5）摇瓶种子培养：将步骤(4)得到的斜面菌株接种于以灭菌的装有摇瓶lb种子培养基的摇瓶中，200 rpm，在25～30℃培养8 h左右：（6）一级种子培养：将步骤（5）培养好的摇瓶种子按 1%体积比接种于已灭菌的装有5 l的lb培养基的10 l一级种子罐，开始培养，培养条件：通气量 0.3～1.5 vvm，罐压0.1 mpa， 温度25～30
°
c，溶解氧 1%～80%饱和度，培养时间 10 h；（7）发酵罐发酵：将步骤（6）培养好的一级种子按 5%～10%体积比接种于已灭菌的装有50 l发酵培养基的100 l发酵罐，开始培养；培养条件：初始通气量 0.3 vvm，罐压0.1 mpa，温度25～30
°
c，培养时间 48～96小时。溶氧控制方案为：0-12 h初始转速为200 rpm，
随着溶氧的降低缓慢提高转速至350 rpm，随后通过搅拌与溶氧关联控制溶解氧30%；12～36 h通过溶氧与补料关联控制溶解氧15%，36 h～发酵最后降低搅拌转速至200 rpm，通过溶氧与补料关联控制溶解氧10%。
35.（8）每4小时取发酵液样品以实施例2的方法测定灵菌红素浓度，结果如图1所示。发酵第48 h的灵菌红素产量可达10.68 g/l。
36.上述实施例的具体描述不能理解为对本发明保护范围的限定，本领域的技术人员根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种灵菌红素发酵生产方法，应用发酵培养基发酵粘质沙雷氏菌以生产灵菌红素，其特征在于：所述发酵培养基包含：氮源、花生饼粉2.5～4 g/l、cacl2 2.5～4.0 g/l、氯化钠 5.0 g/l、蔗糖5～7.5 g/l、甘氨酸0.5～1 g/l，脯氨酸0.5～1 g/l，消泡剂1 ml/l；所述氮源由玉米浆干粉和胰蛋白胨组成，二者的比例为16:4～8:12；所述粘质沙雷氏菌为serratia marcescens pg-zeno-001菌株，已于2023年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2023361。2.根据权利要求1所述的灵菌红素发酵生产方法，其特征在于：所述玉米浆干粉和胰蛋白胨的浓度总和在16～24 g/l的范围。3.根据权利要求1所述的灵菌红素发酵生产方法，其特征在于：所述玉米浆干粉的浓度为8～16 g/l，所述胰蛋白胨的浓度为4～12 g/l。4.根据权利要求1-3中任一项所述的灵菌红素发酵生产方法，其特征在于包括如下步骤：（1）发酵菌株的选择：菌株为粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)pg-zeno-001：（2）发酵培养基配制：玉米浆干粉16 g/l，胰蛋白胨4 g/l、花生饼粉2.5～4 g/l、cacl2 2.5～4.0 g/l、氯化钠 5.0 g/l、蔗糖5～7.5 g/l、甘氨酸0.5～1 g/l，脯氨酸0.5～1 g/l，消泡剂1 ml/l，使用盐酸将培养基ph 调至 6.0；121℃湿热灭菌20分钟后备用；（3）补料培养基配制：玉米浆干粉 300 g/l、花生饼粉50 g/l、蔗糖300 g/l、脯氨酸10 g/l，不调ph，121℃湿热灭菌20分钟后备用；（4）斜面制备：将上述发酵菌株甘油管接种lb斜面进行活化培养，25～30℃恒温培养 24～48 h，制得斜面，斜面冷藏待用；（5）摇瓶种子培养：将步骤（4）得到的斜面菌株接种于以灭菌的装有摇瓶lb种子培养基的摇瓶中，200 rpm，在25～30℃培养8 h左右：（6）一级种子培养：将步骤（5）培养好的摇瓶种子按 1%体积比接种于已灭菌的装有5 l的lb培养基的10 l一级种子罐，开始培养，培养条件：通气量 0.3～1.5 vvm，罐压0.1 mpa， 温度25～30
°
c，溶解氧 1%～80%饱和度，培养时间 10 h；（7）发酵罐发酵：将步骤（6）培养好的一级种子按 5%～10%体积比接种于已灭菌的装有50 l发酵培养基的100 l发酵罐，开始培养；培养条件：初始通气量 0.3 vvm，罐压0.1 mpa，温度25～30
°
c，培养时间 48～96小时；溶氧控制方案为：0-12 h初始转速为200 rpm，随着溶氧的降低缓慢提高转速至350 rpm，随后通过搅拌与溶氧关联控制溶解氧30%；12～36 h通过溶氧与补料关联控制溶解氧15%，36 h～发酵最后降低搅拌转速至200 rpm，通过溶氧与补料关联控制溶解氧10%。

技术总结
本发明公开了利用废弃玉米浆发酵生产灵菌红素的方法。一方面通过优化发酵培养基配方，将淀粉工业的副产物玉米浆干粉部分替代胰蛋白胨作为氮源；另一方面，还提供了应用上述发酵培养基进行发酵生产灵菌红素的方法，在100L发酵罐的大规模发酵中，于48 h的灵菌红素产量可达10.68 g/L。本发明可以大大降低灵菌红素发酵生产的成本，有望构建淀粉工业环保生产的新闭环。产的新闭环。产的新闭环。


技术研发人员：朱天择 季立豪
受保护的技术使用者：芝诺（苏州）生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/9