一种成团泛菌及其应用

1.本发明属于植物保护技术领域，具体地说，涉及一种适用于植物真菌病害防治的生防菌成团泛菌及其应用。


背景技术：

2.小麦茎基腐病(wheat crown rot，wcr)又被称作旱地脚腐病、镰孢根腐病和镰孢茎基腐病等，是一种世界性的小麦土传病害。该病害在各个国家均有发生，如：大洋洲(澳大利亚、新西兰)，北美洲(加拿大、美国)，南美洲(阿根廷)，中国，中东(叙利亚、伊拉克、伊朗、土耳其)，北非(突尼斯、埃及、摩洛哥)南非等地区。据报道，引起小麦茎基腐病的病原菌主要包括假禾谷镰孢(fusarium pseudograminearum)、禾谷镰孢(fusarium graminearum)和黄色镰孢(fusariumcu lmorum)。此外，亚洲镰孢(fusarium asiaticum)、燕麦镰孢(fusarium avenaceum)、锐顶镰孢(fusarium acuminatum)、早熟禾镰孢(fusa rium poae)、尖孢镰孢(fusarium oxysporum)、木贼镰孢(fusarium equiseti)，以及根腐离蠕孢(bipolaris sorokiniana)、雪霉叶枯病菌(microdochium nivale)等多种病原菌也可引起小麦茎基腐病。其中，假禾谷镰孢是在我国黄淮麦区新发现的小麦茎基腐病的优势病原菌，目前已逐渐蔓延到我国山东、江苏、河北、陕西、甘肃、宁夏、新疆等地。
3.小麦茎基腐病从种子至成株期均可以发生危害，不同时期症状表现不同，小麦生长前期受到病原物侵染后，会发生种子腐烂和苗期枯萎；苗期受到侵染后，发病植株茎基部叶鞘和茎秆变褐，严重时会发生根部变褐腐烂现象。成株期小麦茎节变为褐色或深褐色。田间湿度大时茎节处可见由分生孢子座形成的粉红色霉层。严重病株的麦穗会发生白穗症状，壳内无籽或发生不同程度的秕籽。小麦茎基腐病对小麦的产量和品质造成了严重影响。美国西北部的产量损失估计表明，小麦茎基腐病可导致小麦产量减35％。在澳大利亚，由假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病通常会造成谷物10％以上的产量损失。近年来，我国小麦茎基腐病蔓延迅速，其中河南、山东等地区病害发生日益严重，小麦产量损失可达38％-61％。此外，假禾谷镰孢产生的脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol，don)、雪腐镰孢菌烯醇(nivalenol，niv)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，zea)等单端孢霉烯族毒素会严重污染小麦籽粒，当人畜摄入污染的谷物达到一定剂量时会发生呕吐、腹泻、出血甚至死亡，严重威胁人畜健康。
4.成团肠杆菌(enterobacter agglomerans)最早是1888年从植物体表面或内部分离出的一类可以产生黄色素的革兰氏阴性肠杆菌。beijerink等人对此菌群进行研究时发现虽然ent erobacter agglomerans、erwinia herbicola、e.milletiae等菌株在表型上有差异，但是它们的基因型的相似性却高达90％以上，因此他们认为是分类方式的不同导致了这3个异名同种菌的出现。成团泛菌有许多有益作用，如：它可以进行脱卤素反应，降解四氯乙烯、三氯乙烯等；降解三硝酸甘油酯这类在自然界中不易降解并且对环境有污染化学物质将甘油通过氧化还原作用分解成1,3-丙二醇(1,3-ppd)，可用于合成多种可生物降解的聚合物；它们作为非致病性内生菌或附生生物可以在植物的表面和内部进行定植并通过
产生植物生长激素或固氮以促进植物生长，一些菌株还可以通过防止各种细菌和真菌的生长而预防采后果实腐烂；有些菌株能够溶解无机磷酸盐和克服磷石膏弃土场或磷石膏改良土壤中植物生长困难的问题等。生物防治是最具前景的可以替代合成杀菌剂的杀菌方法，本发明将有助于实现小麦茎基腐病及其他小麦病害的绿色防控。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种高效防治植物真菌病尤其是小麦茎基腐病且能够有效促进植物生长的菌株。
6.技术方案
7.为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：
8.本发明的成团泛菌(pantoea agglomerans)lh-01是一种从麦玉轮作田中分离到的对假禾谷镰孢菌具有拮抗作用且对小麦生长具有促进作用的生防菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctcc no:m 20221998，保藏日期为2022年12月23日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
9.上述成团泛菌(p.agglomerans)中，所述的成团泛菌(p.agglomerans)的最佳发酵条件为：采用lb培养基进行振荡培养，振荡培养速度为180r/min～220r/min，培养温度为28℃，初始ph为6～7，发酵时间为24～60h。
10.本发明的一个方面，本发明还提供了包含所述成团泛菌菌株的微生物菌剂。优选所述菌剂为液体、冻干粉菌剂、固定化菌剂。所述液体菌剂中包含成团泛菌lh-01(pantoea agglo merans lh-01)的发酵液或代谢产物；液体菌剂可以制备为油剂、混悬剂，乳液等形式；冻干粉也是微生物菌剂的一种常用形式，其易于保存、运输和使用，在使用前与液体复溶调整浓度即可使用。固定剂是以多孔载体吸附微生物而形成的，常用的多孔载体包括多孔二氧化硅、活性炭、硅藻土等。
11.本发明的一个方面，本发明提供了成团泛菌在防治植物真菌疾病中的应用，所述真菌疾病包括包括假禾谷镰孢菌(fusarium pseudograminearum)、禾谷镰孢菌(fusarium gramine arum)、苹果黑腐皮壳菌(valsa mali)、核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、禾谷丝核菌(rhizoctonia zeae)、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、灰葡萄孢(botrytis cinerea)中的一种或多种病菌所引起的疾病。优选的，所述疾病是小麦茎基腐病。
12.本发明的一个方面，本发明还提供了所述成团泛菌氏菌株及其代谢产物在促进植物生长中的应用。
13.可选的，在植物生长期间，对所述植物根部施用成团泛菌菌剂，优选施用团泛菌lh-01的菌液。在本发明中植物生长主要涉及地下和地上部分，可用根长和叶长指标来衡量。
14.本发明的一个方面，由于本发明成团泛菌lh-01光谱性的抗菌作用，其还可以用于多种其他的植物包括水稻、玉米、苹果、棉花、大麦中的一种或多种的真菌疾病的防治。
15.本发明的成团泛菌lh-01及其代谢产物对假禾谷镰孢菌(f.pseudograminearum)等具有较高的拮抗作用，因此能高效防治小麦茎基腐病，并不是所有的成团泛菌对假禾谷镰孢菌有很好的拮抗效果。
16.3、有益效果
17.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
18.(1)成团泛菌(p.agglomerans)lh-01为促生土壤细菌的一种，对假禾谷镰孢菌抑制作用强，同时对多种病原真菌具有拮抗作用，在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用，对病原菌的拮抗作用具有广谱性；还具有促进植物的生长等优点，尤其是对小麦茎基腐病的防治具有重要意义。
19.(2)成团泛菌(p.agglomerans)lh-01能够人工培养、培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
20.图1为实施例1中菌株筛选及对峙培养图；图中：a：小麦根际土壤细菌分离，b：成团泛菌lh-01划线培养，c：成团泛菌lh-01与假禾谷镰孢菌对峙培养正面，d：成团泛菌lh-01与假禾谷镰孢菌对峙培养反面。
21.图2为本发明中基于msla基因构建成团泛菌属种分类单元的最大似然(ml)树，本研究分离菌株成团泛菌lh-01的分类单元用蓝色表示。
22.图3为实施例2中为成团泛菌lh-01生物学特性结果图。
23.图4为实施例3中为成团泛菌lh-01具有广谱抑菌效果。
24.图5为实施例4中为成团泛菌lh-01对小麦幼苗生长影响的结果图；图中：a：清水ck；b：5ml lh-01菌液；c：10ml lh-01菌液；d：15ml lh-01菌液；e：20ml lh-01菌液。
25.图6为实施例4中成团泛菌lh-01对小麦茎基腐病室内防效结果图：
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
27.供试材料如下：
28.(1)菌种
29.供试小麦茎基腐病的病原菌(假禾谷镰孢菌f.pseudograminearum)由安徽农业大学植物保护学院菌种库提供。
30.(2)主要试剂
31.琼脂、酵母提取物yeast extract、胰蛋白胨tryptone、氯化钠、葡萄糖、蔗糖、95％乙醇、硝酸铵、羧甲基纤维素钠、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏。
32.(3)培养基
33.cmc培养基、lb培养基、pda培养基、蒙金娜有机磷培养基、无机磷培养基(pko)、解钾培养基、阿须贝氏固氮培养基、cas蓝色检测液。
34.实施例1
35.假禾谷镰孢菌拮抗菌的筛选与鉴定
36.从安徽蒙城玉米-小麦轮作区，玉米季土壤中采集表层土壤(10cm-15cm处土壤)。过2mm不锈钢筛后，称取10g土壤样品，放入盛有90ml灭菌水的锥形瓶，28℃，200r/min震荡1h，制成土壤悬液。吸取1ml土壤悬液，采用灭菌水梯度稀释10
1-107倍。随后，分别吸取各稀释度土悬液0.1ml，均匀涂布于lb固体培养基平板上，28℃恒温培养12h～72h。待菌落长出
后，连续划线培养获得纯培养物，20％甘油于-80℃保存。挑取细菌接lb液体培养基中，置于28℃、180r/min的摇床中培养36h，用于后续筛选。
37.将菌种库中的假禾谷镰孢菌活化，接种于pda平板中心位置，置于25℃的培养箱中，培养2d后，在菌落边缘打取新鲜菌丝块转接于干净的pda平板中心位置，在菌块四周2.5cm放置四片无菌滤纸片(φ＝6mm)，吸取2μl待筛选的菌液至滤纸片上，以滴加2μl无菌水空白对照，置于25℃培养箱中培养。待对照组菌丝接近满板时，测量菌落直径，每组试验重复3次，计算抑菌率。
38.小麦根系土壤成团泛菌对假禾谷镰孢菌的抑制率计算公式：
[0039][0040]
式中：a是指对照组病原菌菌落的直径；
[0041]
b是指处理组病原菌菌落的直径；
[0042]
实验分离筛选获得一株菌株，编号lh-01。经过平板对峙实验lh-01对假禾谷镰孢菌有明显拮抗作用，对假禾谷镰孢菌的抑制率达到72.89％，菌株筛选及对峙培养结果如图1。本发明将lh-01的16s rdna序列和7个保守的管家基因序列进行序列分析，这7个保守基因分别是fusa，gyrb，leus，pyrg，rplb，rpob。采用最大似然(ml)法和多位点序列分析(multiocus sequence analysis，msla)，构建lh-01系统发育树，结果显示lh-01与pantoea agglomerans聚在一起，其中pantoea agglomerans lmg 1286
t
属于模式菌株。证实了lh-01属于成团泛菌(pantoea agglomerans)。将筛选获得的团泛菌菌株pantoea agglomerans lh-01，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctcc no:m 20221998，保藏日期为2022年12月23日，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
[0043]
实施例2
[0044]
成团泛菌lh-01生物学特性研究
[0045]
(1)解磷菌的筛选及能力测定
[0046]
将从小麦根际土壤中分离、纯化出来的细菌菌株接种于lb固体培养基上进行活化，培养1-2d后，挑取单个细菌接lb液体培养基中，置于28℃、180r/min的摇床中培养36h。在解磷培养基上呈三角放置三片无菌滤纸片(φ＝6mm)，吸取2μl菌液至滤纸片上，以滴加2μl无菌水空白对照，每组设置3个重复，倒置在28℃恒温培养箱中培养5-7d，观察菌落周围有无溶磷透明圈出现，若出现透明溶磷圈，则初步说明该菌株具有溶磷能力。用尺子分别测量菌落直径(d)和溶磷圈直径(d)，并计算d/d值，d/d值越大，则说明该菌株溶磷能力越强。
[0047]
(2)解钾菌的筛选及能力测定
[0048]
将活化后的菌株分别点接于解钾培养基中，每组设置3个重复，倒置在28℃恒温培养箱中培养5-7d，观察菌落周围油滴状物质出现，若出现油滴状物质，则初步说明该菌株具有解钾能力。
[0049]
(3)固氮菌的筛选及能力测定
[0050]
取在lb培养基平坝上活化的菌株，接种于阿须贝氏固氮培养基上，28℃培养5-7天，如菌株能正常生长，再挑选少量菌体接种到相同培养基上，连续转接3次，若菌株仍能正常生长，则表示该菌株有固氮能力。
[0051]
(4)嗜铁菌的筛选及能力测定
[0052]
将活化后的菌株分别点接于cas检测培养基中，每组设置3个重复，倒置于28℃恒温培养箱中培养5-7d，观察菌落周围有无明显的橙黄色晕圈产生，若出现橙黄色晕圈，则初步说明该菌株具有分泌铁载体的能力，计算方法如(1)。
[0053]
由表1可知，成团泛菌lh-01具有解磷、解钾和固氮能力，没有嗜铁能力，并且解有机磷的能力要强于解无机磷的能力，能产生解钾和固氮的油滴状物质。
[0054]
表1成团泛菌lh-01的生物学功能
[0055]
生物学特性d(透明圈直径)d(菌落直径)d/d解无机磷能力2.170.782.78解有机磷能力2.400.832.89解钾能力//有解钾能力固氮能力//有固氮能力嗜铁能力//无
[0056]
实施例3
[0057]
成团泛菌lh-01具有广谱抑菌效果
[0058]
挑取活化好的成团泛菌lh-01新鲜单菌落接入lb培养基中，28℃、180r/min的摇床中培养36h，在真菌菌落边缘打取新鲜菌丝块转接于干净的pda平板中心位置，在菌块四周2.5cm放置四片无菌滤纸片(φ＝6mm)，吸取2μl菌液至滤纸片上，以滴加2μl无菌水空白对照，置于25℃培养箱中培养。待对照组菌丝接近满板时，测量菌落直径，每组试验重复3次，计算抑菌率。成团泛菌lh-01对立枯丝核菌的抑菌率为64.5％、对苹果黑腐皮壳菌的拮抗效果为87.86％、核盘菌的拮抗效果为74.34％、对尖孢镰刀菌的拮抗效果为35.41％、对灰葡萄孢的拮抗效果为76.8％、对假禾谷镰孢菌的拮抗效果为72.89％、对禾谷镰孢菌的拮抗效果为67.63％、对禾谷丝核菌的拮抗效果为74.75％。
[0059]
实施例4
[0060]
成团泛菌lh-01对小麦幼苗生长作用研究
[0061]
挑取成团泛菌lh-01单菌落接种到lb培养基中，挑取活化好的成团泛菌lh-01新鲜单菌落接入lb培养基中，28℃、180r/min的摇床中培养36h，随后将菌悬液分装到离心管中，放入低温高速离心机(4℃、8000r/min、5min)，去上清留菌体沉淀并用无菌水重悬至菌悬液浓度为1
×
109cfu/ml(波长600nm，od≈1)在每个250ml的三角瓶内装入100mllb液体培养基，高温灭菌后按要求接种20ml lh-01菌悬液，于37℃160r/min培养2-3d，即得菌株接种剂。
[0062]
小麦消毒催芽后种植，待麦苗出芽3d，将成团泛菌lh-01接种剂浇灌于小麦的根部，对照组浇灌无菌水。
[0063]
对小麦株高的影响：实验结果显示，菌液不同的用量较对照组对小麦幼苗均有促生作用。对小麦幼苗的株高、根长、鲜重和干重等生物量进行测定，各组处理对小麦幼苗各项生物量的促生效果见上表。从各组处理对小麦幼苗株高的影响来看，相较于对照组，小麦幼苗增加11.24％-20.44％，其中10ml菌液处理对小麦幼苗株高的促生影响最为明显，对比各组处理对小麦幼苗株高的促生效果发现，并不是菌液用量越高对小麦幼苗株高的促生效果最好，菌液用量超过一定值时会有抑制作用。
[0064]
对小麦根长的影响：从表2中各组处理对小麦幼苗根长的影响来看，除20ml菌液用
量以外其它各组处理下小麦幼苗的根长相较于对照组都有较为明显的增加。其中，根长生长量最大的是菌液用量为10ml处理下的小麦幼苗，相较于对照组其根长增加了18.76％。根长生长量较对照组减小的是20ml菌液处理组。对比其他处理组小麦幼苗的根长生长量后发现，并不是菌液用量越多对小麦幼苗根长的促生效果最好。其中菌液用量为10ml时对小麦幼苗的株高和根长的促生效果达到最好。
[0065]
经过试验结果表明，各组处理下小麦幼苗的鲜重和干重相较于对照组都有不同程度的增加。其中，10ml菌液处理下小麦幼苗的鲜重和过干重的增长量最大，相较于对照组，该组幼苗的鲜重增长量为17.97％，干重增长量为18.92％。其次是5ml菌液处理组，鲜重增加了12.63％，干重增加了9.77％。小麦幼苗鲜重和干重增长量最小的是20ml菌液处理组，分别增加了10.67％和6.98％。通过对比各处理组小麦幼苗的鲜重增长量，其中5ml和10ml处理组的促生效果更好。由此可知，不同菌液用量的处理组，其对小麦幼苗鲜重和干重的促生效果都表现出不同的差异。
[0066]
表2成团泛菌lh-01对小麦苗生长影响
[0067]
处理根长/cm株高/cm鲜重/g干重/gck16.6000
±
3.01552bc34.1800
±
6.16546c12.5500
±
0.19454c1.080
±
0.3521b5ml19.2600
±
2.97404ab42.8600
±
3.94383ab13.2000
±
0.43461b1.330
±
0.2946a10ml20.4700
±
3.37937a42.9600
±
2.17010a14.8000
±
0.63246a1.480
±
0.2860a15ml17.6700
±
1.03392b38.7900
±
5.41878b13.4000
±
0.36818b1.310
±
0.3143a20ml14.0900
±
1.18176c38.5100
±
3.85384b12.2700
±
0.72732c1.290
±
0.2025a
[0068]
注：表中数据后不同字母表示经最小显著差异法检验在p《0.05水平差异显著。
[0069]
实施例5
[0070]
成团泛菌lh-01对小麦茎基腐病的室内防效研究
[0071]
供试小麦种系为ak58，以防治效果和对小麦的促生效果为指标，挑取供试菌株的单菌落接种到lb培养基中，于28℃、180r/min的摇床中培养36h，取假禾谷镰孢菌在pda培养基上活化。离体试验采用菌液涂抹的形式，将培养了36h的菌液用灭菌棉签均匀涂抹在小麦叶片上，静止一天后接种假禾谷镰孢菌菌饼，并设置不同时间段，观察小麦叶片的发病时间，以及发病后病斑面积的大小。活体试验和盆栽试验以小麦的促生效果为指标，接种10ml菌液后等待菌液在小麦体内定植10d后，活体试验接种假禾谷镰孢菌菌饼，同离体试验一样，设置不同时间段观察小麦叶片发病情况，盆栽试验接种假禾谷镰孢菌孢子，以上三种接种方式均以未作菌液处理只接种假禾谷镰孢菌的小麦为对照。对应图6的离体试验和活体试验，在小麦苗发病后记录发病情况并拍照。
[0072]
病情指数＝∑(各病情分级
×
该病级的发病株数)/分级标准中最高级别数
×
调查总株数
×
100；
[0073]
防治效果＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数
×
100％
[0074]
如表3和图6所示，成团泛菌lh-01的离体试验和活体试验防效分别达55.01％和66.67％，而泛菌(pantoea.sp)gn-25的防效分别为30.82％和36.68％，说明成团泛菌lh-01具有较好的生防潜能。
[0075]
表3成团泛菌lh-01对小麦茎基腐病的防治效果
[0076][0077]
*表示与gn-25相比存在显著的差异，p《0.05
[0078]
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

技术特征：
1.一种成团泛菌，其特征在于，所述的成团泛菌的拉丁学分类名为pantoea agglomerans，lh-01，2022年12月23日保存于中国典型培养物保藏中心，地址，中国武汉，武汉大学，保藏号为cctcc no: m 20221998。2.一种成团泛菌菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述的成团泛菌或其代谢产物。3.根据权利要求1所述的成团泛菌在制备防治植物真菌疾病的菌剂中的应用。4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂、粉末制剂、固定化菌剂中一种。5.根据权利要求1所述的成团泛菌在防治植物真菌疾病中的应用，其特征在于：所述真菌疾病包括包括假禾谷镰孢菌（fusarium pseudograminearum）、禾谷镰孢菌（fusarium graminearum）、苹果黑腐皮壳菌（valsa mali）、核盘菌（sclerotinia sclerotiorum）、尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）、禾谷丝核菌（rhizoctonia zeae）、立枯丝核菌（rhizoctonia solani）、灰葡萄孢（botrytis cinerea）中的一种或多种病菌所引起的疾病。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述真菌疾病为小麦茎基腐病菌所引起的疾病。7.一种植物促生长剂，其特征在于，所述促生长剂包括权利要求1所述的成团泛菌或其代谢产物。8.权利要求1所述的成团泛菌或其代谢产物在制备促植物生长剂中的应用。9.根据权利要求3或权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物包括小麦、水稻、玉米、苹果、棉花、大麦中的一种或多种。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物包括小麦、水稻、玉米、苹果、棉花、大麦中的一种或多种。

技术总结
本发明公开了一种适用于植物病害的生防菌成团泛菌及其应用，所述的分类命名为成团泛菌（pantoea agglomerans）LH-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址，中国武汉，武汉大学，其保藏编号是：CCTCC NO:M 20221998，保藏日期：2022年12月23日。本发明还公开了上述成团泛菌首次在防治小麦茎基腐病中的应用和在促进小麦生长中的应用。本发明还提供了一种防治小麦茎基腐病的杀菌剂，即将LH-01接种于培养基中发酵培养所得。本发明的LH-01菌株对假禾谷镰孢菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，可用于多种植物进行真菌防治和促生长，且培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。具有良好的开发应用前景。具有良好的开发应用前景。


技术研发人员：潘月敏 陈飞飞 段红雁 魏源旭 张津萌 赵瑞变 杨国锋 胡如意
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/8/9