一种靶向GPC3阻断免疫抑制信号的CAR-巨噬细胞及其制备方法与应用

一种靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞及其制备方法与应用。


背景技术：

2.嵌合抗原受体巨噬细胞(car-巨噬细胞)疗法是利用基因编辑技术修饰患者的巨噬细胞，赋予其肿瘤细胞特异性清除能力的新型治疗方法。相较于已经投入临床恶性血液肿瘤治疗的嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法，car-巨噬细胞在实体瘤治疗上具有其独特的优势，包括良好的穿透浸润能力、可呈递抗原激活细胞免疫等，具有更为广阔的发展前景。然而，肿瘤细胞通常高度表达cd47、pd-l1、b2m、cd24等抗吞噬分子，通过与巨噬细胞表面相应受体结合传递“别吞我”信号，最终抑制巨噬细胞吞噬活性进而实现免疫逃逸，这也严重限制了car-巨噬细胞疗法的抗肿瘤效果；而多项研究已证明阻断“别吞我”信号通路可解除免疫抑制，显著提高巨噬细胞吞噬能力和抗肿瘤效果。
3.肝癌组织普遍高度表达glypican-3(gpc3)，而正常肝脏组织几乎不表达，因此，gpc3可以作为肝癌的特异性标志物以及car-巨噬细胞识别肝癌细胞的靶标抗原，构建靶向gpc3的car-巨噬细胞将实现对肝癌细胞的精准识别和吞噬、并通过抗原递呈作用激活抗肿瘤免疫应答。此外，与正常肝脏组织相比，肝癌组织中cd24表达量显著上调，并与肝癌患者预后不良相关。cd24通过结合巨噬细胞表面的siglec-g受体，引起其胞内段免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)磷酸化，进而传递抗吞噬信号与抑炎信号，阻碍巨噬细胞行使肿瘤吞噬清除使命。因此，itim是“别吞我”信号通路的关键传导中枢，缺少itim的siglec-g受体(siglec-gδitims)保留识别和结合cd24的能力，却无法传导抑制信号；同时，siglec-gδitims的表达将干扰cd24与正常siglec-g受体的结合，进而阻断该信号通路，解除cd24对巨噬细胞的吞噬抑制，进一步增强car-巨噬细胞肿瘤吞噬效果。
4.相较于质粒dna，mrna在细胞质内与核糖体结合即可完成编码蛋白的翻译，无需进入细胞核、插入基因组，具有更高的翻译效率和安全性。因此，本技术方案采用lnp共递送car mrna与siglec-gδitims mrna，在体编辑巨噬细胞原位生成表达siglec-gδitims的car-巨噬细胞，省略了繁琐的工程细胞体外制备过程，并规避了免疫细胞系统回输引发的潜在全身毒副作用。siglec-gδitims阻断cd24-siglec-g信号通路，解除“别吞我”信号对car-巨噬细胞的免疫抑制，放大car-巨噬细胞对肝癌细胞的杀伤效应。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞及其制备方法与应用。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明第一方面提供了一种靶向肝癌的gpc3特异性car，包括胞外结构域、跨膜区
和胞内结构域；所述胞外结构域包括前端信号肽段，单链抗体片段(scfv)，myc标签基因以及铰链区。
8.所述前端信号肽段为cd8α前端信号肽；所述单链抗体片段(scfv)为特异性抗肝癌细胞gpc3单克隆抗体g15；所述铰链区选自ighg1、cd8α或cd28的铰链区；所述跨膜区选自cd3ζ、cd28、cd8或cd4的跨膜区；所述胞内结构域选自fcεriγ或cd3ζ的胞内结构域。
9.根据本发明优选的，所述铰链区为cd8α的铰链区；所述跨膜区为cd8的跨膜区；所述胞内结构域为cd3ζ的胞内结构域。
10.进一步优选的，所述靶向肝癌的gpc3特异性car的氨基酸序列如seq id no.1所示。
11.本发明第二方面提供了一种编码上述靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna，所述mrna包括包含5’帽子、5’非编码区、car序列、3’非编码区和3’polya尾巴，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
12.根据本发明优选的，所述编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna按照dna模板t7转录酶法制备得到。
13.进一步优选的，所述mrna为环状rna或线性rna。
14.一种重组表达载体，所述重组表达载体含有编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna。
15.本发明第三方面提供了一种阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims，所述阻断剂siglec-gδitims为缺少胞内段itim并含有his标签基因的siglec-g受体，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
16.进一步优选的，所述免疫抑制信号包括但不限于cd47、pd-l1、b2m、cd24；
17.最优选的，所述免疫抑制信号为cd24。所述siglec-gδitims可与siglec-g竞争性结合cd24，但不传递传导吞噬抑制信号；而cd24与正常siglec-g的结合受到干扰，可有效减轻cd24引起的巨噬细胞吞噬活性抑制，增强car-巨噬细胞对肝癌细胞的清除。
18.本发明第四方面提供了编码上述阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna，所述mrna包括包含5’帽子、5’非编码区、siglec-gδitims序列、3’非编码区和3’polya尾巴，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
19.根据本发明优选的，所述编码阻断剂siglec-gδitims的mrna按照dna模板t7转录酶法制备得到。
20.进一步优选的，所述mrna为环状rna或线性rna。
21.一种重组表达载体，所述重组表达载体含有阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna。
22.本发明第五方面提供了一种靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞，所述巨噬细胞含有靶向肝癌的gpc3特异性car和阻断剂siglec-gδitims。
23.根据本发明优选的，所述car-巨噬细胞同时表达靶向肝癌的gpc3特异性car和阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims。
24.根据本发明优选的，所述靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞按照如下方法制备：将含有编码靶向肝癌的gpc3特异性car的重组表达载体和含有阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的重组表达载体导入巨噬细胞中获得。
25.进一步优选的，所述导入方式包括但不限于电穿孔、病毒转染、非病毒载体递送。
26.本发明第六方面提供了一种共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)，包括编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna、编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna和递送载体。
27.根据本发明优选的，所述共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)制备方法，包括如下步骤：
28.(1)将car mrna和siglec-gδitims mrna溶于邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液中，得到mrna混合液；
29.(2)将可电离脂质p2to、胆固醇、dmg-peg
2000
和dope溶于乙醇中，得到混合脂质溶液；
30.(3)向微流控设备中加入mrna混合液和混合脂质溶液，通过微流控法制备得到共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)。
31.根据本发明优选的，步骤(1)中，所述car mrna和siglec-gδitims mrna质量比为1：2；所述mrna混合液中car mrna的浓度为0.05～0.06mg/ml，siglec-gδitims mrna的浓度为0.11～0.12mg/ml。
32.根据本发明优选的，步骤(2)中，所述可电离脂质p2to的结构如下式所示：
[0033][0034]
进一步优选的，所述可电离脂质p2to的制备方法如下：
[0035]
向叔丁基二甲基氯硅烷、三羟甲基氨基甲烷和催化剂咪唑的混合物中加入无水dmf，25℃下反应12h得到tris-tbs；使tris-tbs与4-甲基-1-哌嗪乙酸在dcm中混合，在催化剂edci、hobt存在下，以tea作为缚酸剂，冰浴转室温反应24h得p2t-tbs；将p2t-tbs、tbaf
·
3h2o溶于四氢呋喃中，冰浴搅拌下向p2t-tbs溶液中滴加tbaf
·
3h2o的四氢呋喃溶液，反应3h，将反应液经旋转蒸发仪旋干；冰浴搅拌、氮气存在下加入无水dcm、三乙胺，随后滴加油酰氯；转室温反应24h，得到可电离脂质p2to。
[0036]
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述可电离脂质p2to、dope、胆固醇、dmg-peg
2000
的摩尔比为36.5：30.5：2.5：30.5；所述质纳米粒溶液中可电离脂质p2to浓度为4～6mg/ml。
[0037]
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述mrna混合液中的mrna和混合脂质溶液中的可电离脂质p2to的质量比为1:10。
[0038]
本发明第七方面提供了上述靶向肝癌的gpc3特异性car、含有编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna的重组表达载体、阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims、含有编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的重组表达载体、靶向gpc3阻
断免疫抑制信号的car-巨噬细胞或共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0039]
根据本发明优选的，所述肿瘤为肝癌。
[0040]
本发明第八方面还提供了一种治疗肿瘤的药物，所述药物中含有编码car的mrna和编码阻断剂siglec-gδitims的mrna、或者已插入编码car的mrna和编码阻断剂siglec-gδitims的mrna的重组表达载体、或者靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞、或者共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)。
[0041]
本发明的技术特点及优点：
[0042]
1、本发明提供一种靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞，该car-巨噬细胞能够特定靶向gpc3靶点，同时还能阻断“别吞我”的itim信号通路，实现了car-巨噬细胞疗法与信号阻断疗法的联合，通过表达siglec-gδitims解除cd24等抗吞噬分子的免疫抑制，发挥并放大car-巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，再通过抗原递呈激活抗肿瘤免疫应答，从而获得高效、持久的抗肿瘤效应。
[0043]
2、本发明提供了一种共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)，该脂质纳米粒通过高生物相容性lnp递送系统成功递送了编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna，既可用于巨噬细胞体外编辑，也可用于在体编辑巨噬细胞，简化工程免疫细胞治疗过程、有效规避脱靶风险和全身毒副作用。
附图说明
[0044]
图1为本技术实施例1中嵌合抗原受体(car)的结构示意图。
[0045]
图2为本技术实施例2中siglec-gδitims与正常siglec-g受体的对比示意图。
[0046]
图3为本技术实施例3中可电离脂质p2to的合成路线图。
[0047]
图4为本技术实施例3中可电离脂质p2to的核磁表征结果。
[0048]
图5为本技术实施例4中car&siglec-gδitims lnp的理化性质表征。
[0049]
图6为本技术实施例5中car&siglec-gδitimslnp对巨噬细胞活力影响测定结果。
[0050]
图7为本技术实施例6中car&siglec-gδitimslnp对巨噬细胞的转染效率测定结果。
[0051]
图8为本技术实施例7中巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力测定结果。
[0052]
图9为本技术实施例8中car&siglec-gδitimslnp在原位肝癌小鼠中的体内药效结果图。
[0053]
图10为本技术实施例9中car&siglec-gδitims lnp的体内安全性表征结果图。
具体实施方式
[0054]
实施例1、构建靶向肝癌的gpc3特异性car
[0055]
以肝癌特异性标识物glypican 3(gpc3)作为特异性抗原设计car细胞外结构域。
[0056]
如图1所示，所述嵌合抗原受体包含cd8前端信号肽、特异性抗肝癌细胞gpc3单克隆抗体g15(anti-gpc3-scfv)、myc标签基因、cd8α铰链区、cd8跨膜区、cd3ζ胞内结构域。
[0057]
具体构建过程如下：通过ncbi寻找各个元件的氨基酸序列，将序列进行优化，随后对序列进行串联，串联顺序为cd8前端信号肽、anti-gpc3-scfv、myc标签基因、cd8α铰链区、cd8跨膜区、cd3ζ胞内结构域，构建得到靶向肝癌的gpc3特异性car，其氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示，由上海吉荧生物技术有限公司合成该car的mrna。
[0058]
实施例2、构建阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims
[0059]
根据ncbi数据库所示siglec-g序列(ncbi id：np_766488.2)，设计缺乏胞内itims段的siglec-g受体(siglec-gδitims)，并在胞内段插入his标签基因，siglec-gδitims具体结构如图2所示，其氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.4所示，，由上海吉荧生物技术有限公司合成该siglec-gδitims的mrna。
[0060]
实施例3、制备可电离脂质p2to
[0061]
如图3所示，向6.715g叔丁基二甲基氯硅烷、1.54g三羟甲基氨基甲烷和6.304g催化剂咪唑的混合物中加入5ml无水dmf，25℃下反应12h得到tris-tbs。使3.000g tris-tbs与1.500g 4-甲基-1-哌嗪乙酸在10ml dcm中混合，在催化剂1.800g edci、1.260g hobt存在下，以7.200mltea作为缚酸剂，冰浴转室温反应24h得p2t-tbs。将0.500g p2t-tbs、0.862g tbaf
·
3h2o溶于5ml四氢呋喃中，冰浴搅拌下向p2t-tbs溶液中滴加上述tbaf
·
3h2o的四氢呋喃溶液，反应3h，将反应液经旋转蒸发仪旋干；冰浴搅拌、氮气存在下加入5ml无水dcm、380μl三乙胺，随后缓慢滴加0.821mg油酰氯；转室温反应24h，得目标产物p2to。
[0062]
对本实施例制备的p2to进行核磁表征，核磁结果如图4所示。
[0063]
由图4可知，可电离脂质p2to合成成功，结构如下式所示：
[0064][0065]
实施例4、car&siglec-gδitims lnp的制备及表征
[0066]
一种共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)的制备方法，包括如下步骤：
[0067]
(1)将13.36μl car mrna(1mg/ml)和26.72μl siglec-gδitims mrna(1mg/ml)混合均匀，使用ph＝4的邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液稀释至240μl，得到mrna混合液；
[0068]
(2)将5mg可电离脂质p2to、1.6mg胆固醇、0.8mg dmg-peg
2000
和3mg dope溶于1ml乙醇中，得到混合脂质溶液；
[0069]
(3)向微流控设备中加入240μl mrna混合液和80μl混合脂质溶液，所述mrna混合液中的mrna和混合脂质溶液中的可电离脂质p2to的质量比为1:10，通过微流控法制备得到共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδ
itims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)。
[0070]
使用ribogreen试剂盒测定car&siglec-gδitims lnp的包封率，并通过马尔文粒径仪测定其水合粒径与表面电位，结果如图5所示。
[0071]
由图5可知，car&siglec-gδitims lnp可高效包载mrna，包封率为74.7
±
5.37％；car&siglec-gδitims lnp水合粒径为118.8
±
4.0nm，粒径均一，呈电中性。
[0072]
实施例5、car&siglec-gδitims lnp的细胞毒性考察
[0073]
1、骨髓来源巨噬细胞(bmdms)的提取、分离和培养
[0074]
将c57bl/6小鼠安乐死后取股骨和胫骨，冲洗骨髓，过70μm细胞滤网后离心收集细胞。使用含有10ng/ml m-csf的dmem培养基培养七天诱导其分化为巨噬细胞。
[0075]
2、car&siglec-gδitims lnp的细胞毒性考察
[0076]
将bmdms接种于96孔板(5
×
103细胞/孔)，培养过夜使其贴壁后加入car&siglec-gδitims lnp培养基溶液(1000ng/ml，以mrna计)，在共孵育不同时间点检测bmdms细胞活力，结果如图6所示。
[0077]
由图6可知，car&siglec-gδitims lnp没有明显的细胞毒性，安全性良好。
[0078]
实施例6、car&siglec-gδitims lnp的体外巨噬细胞转染实验
[0079]
将bmdms接种于24孔板(6
×
104细胞/孔)，24小时后分为两组，分别加入car&siglec-gδitims lnp(60ng/孔，以mrna计)和等体积pbs溶液，共孵育12小时后收集细胞，检测转染效率，结果如图7所示。
[0080]
由图7可知，经car&siglec-gδitims lnp处理的bmdms中同时表达car蛋白与siglec-gδitims蛋白的bmdms可达30％，说明car&siglec-gδitims lnp可成功共递送两种mrna，car&siglec-gδitims lnp可以用于构建靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞。
[0081]
实施例7、car&siglec-gδitims lnp的体外肿瘤吞噬能力考察
[0082]
1、按照实施例4和实施例6所述的方法分别制备得到负载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna的脂质纳米粒(car lnp)和负载编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(siglec-gδitims lnp)。
[0083]
2、将cfse标记的bmdms接种于24孔板(6
×
104细胞/孔)，24小时后分为四组，分别加入pbs、car lnp、car&siglec-gδitims lnp、siglec-gδitims lnp(60ng/孔，以mrna计)，共孵育12小时后加入mcherry hepa 1-6细胞(6
×
104细胞/孔)，继续培养12小时。收集细胞，使用流式细胞仪测定各组bmdms对hepa 1-6细胞的吞噬情况，结果如图8所示。
[0084]
由图8可知，car&siglec-gδitims lnp呈现最高的吞噬效率，说明car&siglec-gδitims lnp进一步诱导巨噬细胞清除肿瘤，具有强大的去除肿瘤作用。
[0085]
实施例8、car&siglec-gδitims lnp的体内药效学评价
[0086]
消化处于对数生长期的hepa 1-6细胞，并通过向c57bl/6雄鼠脾脏注射hepa 1-6细胞构建原位肝癌小鼠模型。14日后随机分为四组(n＝10)，分别尾静脉注射pbs、car lnp、car&siglec-gδitims lnp、siglec-gδitims lnp(0.3mg/kg，以mrna计),每三天给药一次，给药三次，每天监测小鼠自造模之日后80天内生存状况，绘制生存曲线，结果如图9所示。
[0087]
由图9可知，car&siglec-gδitims lnp呈现最佳的生存期改善效果，80天内生存
率可达40％。
[0088]
实施例9、car&siglec-gδitims lnp的体内安全性评价
[0089]
将c57bl/6雄鼠随机分为四组，别尾静脉注射pbs、car&siglec-gδitims lnp(0.3mg/kg，以mrna计),每三天给药一次，给药三次。第三次给药后次日收集小鼠外周血，测定激酶水平，结果如图10所示。
[0090]
由图10可知，相较于pbs组，car&siglec-gδitims lnp组激酶水平无明显差异且均处于正常范围，证明其生物安全性良好(图10)。
[0091]
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的任何修改、等同替换或改进，均应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞含有靶向肝癌的gpc3特异性car和阻断免疫抑制信号的阻断剂。2.如权利要求1所述的car-巨噬细胞，其特征在于，所述靶向肝癌的gpc3特异性car包括胞外结构域、跨膜区和胞内结构域；所述胞外结构域包括前端信号肽段，单链抗体片段(scfv)，myc标签基因以及铰链区；所述前端信号肽段为cd8α前端信号肽；所述单链抗体片段(scfv)为特异性抗肝癌细胞gpc3单克隆抗体g15；所述铰链区选自ighg1、cd8α或cd28的铰链区；所述跨膜区选自cd3ζ、cd28、cd8或cd4的跨膜区；所述胞内结构域选自fcεriγ或cd3ζ的胞内结构域；进一步优选的，所述铰链区为cd8α的铰链区；所述跨膜区为cd8的跨膜区；所述胞内结构域为cd3ζ的胞内结构域；所述靶向肝癌的gpc3特异性car的氨基酸序列如seq id no.1所示。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna，该mrna的核苷酸序列如seq id no.2所示；进一步优选的，所述mrna为环状rna或线性rna。4.如权利要求1所述的car-巨噬细胞，其特征在于，所述阻断免疫抑制信号的阻断剂为siglec-gδitims；所述siglec-gδitims为缺少胞内段itim并含有his标签基因的siglec-g受体，其氨基酸序列如seq id no.3所示；进一步优选的，所述免疫抑制信号为cd47、pd-l1、b2m或cd24；最优选的，所述免疫抑制信号为cd24。5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna，该mrna的核苷酸序列如seq id no.4所示；进一步优选的，所述mrna为环状rna或线性rna。6.权利要求1所述靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞的制备方法，其特征在于，将权利要求3和权利要求5所述的重组表达载体导入巨噬细胞中；进一步优选的，所述导入方式包括电穿孔、病毒转染和非病毒载体递送。7.一种共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)，其特征在于，包括编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna、编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna和递送载体。8.权利要求7所述共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)将car mrna和siglec-gδitims mrna溶于邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液中，得到mrna混合液；其中，所述car mrna和siglec-gδitims mrna的质量比为1：2；所述mrna混合液中car mrna的浓度为0.05～0.06mg/ml，siglec-gδitims mrna的浓度为0.11～0.12mg/ml；(2)将可电离脂质p2to、胆固醇、dmg-peg
2000
和dope溶于乙醇中，得到混合脂质溶液；其中，所述可电离脂质p2to的结构如下式所示：
所述可电离脂质p2to、dope、胆固醇、dmg-peg
2000
的摩尔比为36.5：30.5：2.5：30.5；所述质纳米粒溶液中可电离脂质p2to浓度为4～6mg/ml；(3)向微流控设备中加入mrna混合液和混合脂质溶液，通过微流控法制备得到共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)；其中，所述mrna混合液中的mrna和混合脂质溶液中的可电离脂质p2to的质量比为1:10。9.权利要求1所述的靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞、或权利要求3所述的重组表达载体、或权利要求5所述的重组表达载体、或权利要求7所述的共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)在制备治疗肿瘤药物中的应用；进一步优选的，所述肿瘤为肝癌。10.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物中含有权利要求1所述的靶向gpc3阻断免疫抑制信号的car-巨噬细胞、或权利要求3所述的重组表达载体和权利要求5所述的重组表达载体、或权利要求7所述的共载编码靶向肝癌的gpc3特异性car的mrna和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂siglec-gδitims的mrna的脂质纳米粒(car&siglec-gδitims lnp)。

技术总结
本发明涉及一种靶向GPC3阻断免疫抑制信号的CAR-巨噬细胞及其制备方法与应用。所述巨噬细胞含有靶向肝癌的GPC3特异性CAR和阻断免疫抑制信号的阻断剂。该CAR-巨噬细胞特定靶向GPC3靶点，还能阻断“别吞我”的ITIM信号通路，实现了CAR-巨噬细胞疗法与信号阻断疗法的联合，解除CD24的免疫抑制，发挥并放大CAR-巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，再通过抗原递呈激活抗肿瘤免疫应答，从而获得高效、持久的抗肿瘤效应。本发明还提供了一种共载编码靶向肝癌的GPC3特异性CAR的mRNA和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂Siglec-GΔITIMs的mRNA的脂质纳米粒(CAR&Siglec-GΔITIMs LNP)，该脂质纳米粒成功递送了编码靶向肝癌的GPC3特异性CAR的mRNA和编码阻断免疫抑制信号的阻断剂Siglec-GΔITIMs的mRNA，有效规避脱靶风险和全身毒副作用。作用。


技术研发人员：姜新义 杨贞梅 高晋昕
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/9