一种快速建立HPLC梯度洗脱程序的方法

一种快速建立hplc梯度洗脱程序的方法
技术领域
1.本发明涉及hplc检测技术领域，具体涉及一种快速建立hplc梯度洗脱程序的方法。


背景技术：

2.hplc已成为药学、化学、医学、公卫、生物、农学、商检、法检等学科领域的通用分离分析仪器设备，其主要用于化合物的定性和定量。不同厂家的hplc仪器和工作站操作均不相同，但只需做几次即可熟练掌握仪器和工作站操作。然而hplc分析最关键最难掌握的是分析方法的建立，特别是诸如中药之类的复杂样品，往往有10个以上的化学成分，要想将其完全分开有一定难度，对于含有未知样品或无分析文献报道的样品检测，往往茫无头绪，不知该如何入手。很多hplc初学者只会参考文献条件，但多数情况下我们现有的色谱柱与文献不一致，特别是中华人民共和国药典(以下简称中国药典)，绝大多数没有提供色谱柱填料详细信息。从而造成我们参考文献或中国药典色谱条件往往难以重现，这时就需要重建色谱条件。很多学生或初学者经常消耗大量时间在摸索hplc的分析条件上，特别是其梯度洗脱程序的建立，尤为费时费力。


技术实现要素：

3.针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，以解决现有技术梯度洗脱程序建立困难的技术问题。
4.本发明采用的技术方案如下：
5.一种快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，采用全谱-展开-加节点三步法，具体步骤如下：
6.(1)全谱：以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相，在20min内，乙腈比例由5％线性升到100％；得到的全谱图用于快速获取样品的所有色谱峰信息，同时确定后续展开分析的展开时间、初始比例和终止比例；
7.(2)展开：
8.a.初始比例：在步骤(1)所得全谱图中，在设定波长下，将除溶剂峰以外第一个肉眼可见色谱峰的保留时间往前推3～5min，在全谱梯度图上对应的比例定为初始比例；
9.b.终止比例：在步骤(1)所得全谱图中，在设定波长下，将除流动相波动峰以外最后一个肉眼可见色谱峰的保留时间往前推3～5min，在全谱梯度图上对应的比例定为终止比例；
10.再根据色谱峰数量和疏密选择15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、60min中的一个作为展开时间，得到的展开图用于确定后续加节点的位置；
11.(3)加节点：
12.a.提高色谱峰分离度：对于步骤(2)所得的展开图，若前面部分色谱峰密集或分离度较低，后面部分色谱峰相对稀疏，在原梯度线上方适宜位置加一节点，将前面部分梯度线
坡度降低，后面部分梯度线坡度升高，同时初始比例、终止比例和展开时间保持不变；若是后面部分色谱峰密集或分离度较低，前面部分色谱峰相对稀疏，在原梯度线下方适宜位置加一节点，将后面部分梯度线坡度降低，前面部分梯度线坡度升高，同时初始比例、终止比例和展开时间保持不变；如果前后色谱峰均较多且密集，则不用添加节点，初始比例和终止比例保持不变，直接增加展开时间即可；
13.b.缩短分析时间：对于步骤(2)所得的展开图，若前面部分色谱峰分离较好，而后面部分色谱峰相对稀疏，在前面部分分离较好的最后一个色谱峰前0～4min内，在其对应的梯度线上添加一节点，前面部分梯度线保持不变，保持终止比例不变或乙腈增加5％，缩短洗脱时间即可；若色谱峰分离较好，但中间有超过10min的间隔，则在前面部分的最后一个色谱峰前0～4min内，在其对应的梯度线上添加一节点，前面部分梯度线保持不变，中间部分在1～5min内快速提高梯度线坡度，直至后面部分的第一个峰前推3～5min对应的比例为止，再添加一节点，保持终止比例不变或乙腈增加5％，缩短洗脱时间即可；
14.c.冲出杂质峰：若乙腈终止比例不够，样品洗脱后还有杂质峰，当杂质峰对后续样品有干扰时，则在原梯度后面追加节点，在1～15min内乙腈比例提高至90％～100％，保持4～5min，再在1min内返回初始比例平衡4～5min。
15.作为优选地，hplc所用色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的常规高效液相色谱柱，内径为4.6mm，长度为250mm。
16.作为优选地，步骤(1)中，若样品在20min后还有色谱峰或20min仍未出峰，则采用100％乙腈继续洗脱5～10min。
17.作为优选地，步骤(2)中关于初始比例的设置，以全谱图中除溶剂峰以外第一个肉眼可见色谱峰为依据：第一个肉眼可见色谱峰在10min以内，前推5min；第一个肉眼可见色谱峰在10～15min，前推4～5min，趋近10min取5，趋近15min取4；第一个肉眼可见色谱峰在15～20min，前推3～4min，趋近15min取4，趋近20min取3，在全谱梯度图上对应的比例作为初始比例，乙腈比例取值舍入为最接近的5的倍数。
18.作为优选地，步骤(2)中关于终止比例的设置，以全谱图中除流动相波动峰以外最后一个肉眼可见色谱峰为依据：最后一个肉眼可见色谱峰在5～10min以内，前推5min；最后一个肉眼可见色谱峰在10～15min以内，前推4～5min，趋近10min取5，趋近15min取4；最后一个肉眼可见色谱峰在15～20min以内，前推3～4min，趋近15min取4，趋近20min取3，在全谱梯度图上对应的比例作为终止比例，乙腈比例取值舍入为最接近的5的倍数；最后一个肉眼可见需要分离的色谱峰在20～25min以内，乙腈终止比例设90％～100％。
19.作为优选地，步骤(3)中，如果需要微移色谱峰或需要精确控制色谱峰的出峰时间，则继续微调初始比例或终止比例，以及进一步微调节点位置和比例或追加节点。
20.综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
21.1.本发明适合快速建立中药样品、复杂样品或未知样品的hplc梯度洗脱程序和色谱条件，也可快速获取西药类简单成分样品的等度比例，在hplc分析方法开发领域具有广泛的应用价值和教学价值。
22.2.本发明通过三步法即可快速初步确定比较理想的hplc梯度洗脱程序，部分样品甚至只需一步或两步即可获得相对理想的hplc梯度洗脱程序和色谱条件。
23.3.本发明不涉及复杂计算，只需绘出excel网格线，再配合直线工具即可快速确定
hplc梯度洗脱程序。
24.4.通过和中国药典法色谱条件的对比发现，三步法建立的色谱条件更加简洁明了，其比药典条件具有明显的优势，三步法可用于后续中国药典法色谱条件的重建和简化，为后期中国药典色谱条件的改进和优化提供了参考。
附图说明
25.图1为实施例1中银黄含片hplc分析三步法色谱图及其梯度图；其中，图左为色谱图，图右为流动相体积比例-时间梯度图(以下简称梯度图)，a表示全谱，b表示展开，c表示加节点，提高分离度；
26.图2为实施例2中小儿金翘颗粒hplc分析三步法色谱图及其梯度图；其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示全谱，b表示展开，c表示加节点，缩短分析时间；
27.图3为实施例3中白苞蒿hplc分析不同波长的全谱图以及主要色谱峰的紫外吸收光谱图；其中，图左为色谱图，图右为紫外吸收光谱图；
28.图4为实施例3中白苞蒿hplc分析三步法色谱图及其梯度图；其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示全谱，b表示30℃柱温展开，c表示40℃柱温展开；d表示加节点，冲出杂质峰；
29.图5为实施例4中常春藤hplc分析不同波长的全谱图以及主要色谱峰的紫外吸收光谱图；其中，图左为色谱图，图右为紫外吸收光谱图；
30.图6为实施例4中常春藤hplc分析三步法色谱图及其梯度图；其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示全谱，b表示展开，c表示首次加节点；d表示二次加节点；
31.图7为实施例5中布洛芬胶囊hplc分析三步法色谱图及其梯度图；其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示全谱，b表示首次等度，c表示二次等度；
32.图8为实施例6中氯霉素滴眼液hplc全谱色谱图及其梯度图；
33.图9为验证例1中氯霉素滴眼液hplc展开图谱及其梯度图(根据20min全谱)，用于确定全谱20min的终止比例和前推时间；
34.图10为验证例1中氯霉素滴眼液hplc展开图谱及其梯度图(根据15min全谱)，用于确定全谱15min的终止比例和前推时间；
35.图11为验证例1中氯霉素滴眼液hplc不同终止比例的展开图谱及其梯度图，示不同终止比例对分离的影响；
36.图12为验证例2中验证三步法在不同仪器和相同色谱柱上的适用性，采用安捷伦1260和同一根lubex kromasil色谱柱，分析白苞蒿的三步法色谱图及其梯度图；其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示全谱，b表示展开(柱温30℃)，c表示展开(柱温40℃)；
37.图13为验证例2中验证三步法在不同仪器和相同填料不同批次色谱柱上的适用性，采用安捷伦1260和另一批次的lubex kromasil色谱柱，分析白苞蒿的三步法色谱图及其梯度图；其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示展开(柱温30℃)，b表示更改终止比例(柱温30℃)，c表示全谱，d表示更改终止比例(柱温40℃)；
38.图14为验证例3中验证中国药典法检测和三步法检测银黄含片比较图，其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示中国药典法，b表示采用实施例1中的三步法加节点的比例，c表示三步法比例微调；
39.图15为验证例3中验证中国药典法检测和三步法检测山银花比较图，其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示中国药典法，b表示三步法；
40.图16为验证例3中验证中国药典法检测和三步法检测金银花比较图，其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示中国药典法，b表示采用山银花色谱条件的三步法，c表示当只测金银花，不对比检测山银花中的皂苷时的三步法；
41.图17为验证例3中验证中国药典法检测和三步法检测桑叶比较图，其中，图左为色谱图，图右为梯度图，a表示中国药典法，b表示三步法，1为芦丁，2为异槲皮苷，3为芦丁+异槲皮苷；
42.图18为验证例4中金银花等度干扰图。
具体实施方式
43.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图以及各实施例和验证例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例和验证例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
44.在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本法实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明公开的内容。
45.除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明中的其它未特别注明的原材料、试剂、试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常使用的原材料和试剂，以及通常采用的实验方法和技术手段。
46.以下各实施例使用的仪器的试剂如下所述：
47.dionex p680高效液相色谱仪(美国戴安公司)；agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。色谱柱：lubex kromasil，akzonobel kromasil，dikma diamonsil(2)，dikma inspire(所有色谱柱均为c
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柱，250mm
×
4.6mm，5μm，后文略)。mettler toledo ms105du电子天平(瑞士梅特勒托利多公司，1/10万)。as7240a超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司，240w，40khz)。milli-qiq 7010超纯水仪(美国密理博公司)。
48.白苞蒿、常春藤、桑叶于2020年10月采自四川泸州，经作者鉴定分别为菊科蒿属白苞蒿artemisia lactflora wall.、五加科植物常春藤hedera helix l.、桑科植物桑morus alba l.的新鲜叶。山银花、金银花为市售，经作者鉴定分别为忍冬科植物灰毡毛忍冬lonicera macranthoides hand.和忍冬lonicera japonica thunb.的干燥花蕾。中药材均经60℃烘干，粉碎，过四号筛，备用。
49.银黄含片、小儿金翘颗粒，布洛芬胶囊、氯霉素滴眼液均为市售。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
50.其中，基准色谱条件的选择遵循以下规则：
51.任何样品的hplc色谱条件的建立均应先确定一基准色谱条件，然后在此基础上逐步调整。hplc色谱条件一般由色谱柱、流动相、测定波长、柱温和流速构成。
52.色谱柱：色谱柱可选择一根现有或常用色谱柱，也可先根据化合物性质选择合适
或针对性填料的色谱柱，最后若分离不佳再考虑换柱。若成分极性相对较强，即使采用95％比例的水相，其色谱峰也会趋近溶剂峰或与溶剂峰重合，这时考虑采用水性柱，并继续降低有机相比例，或采用100％水相。如果部分需分离色谱峰展开时间延长到30～60min都无法分开，改变柱温也无法分开，那就应考虑改变流动相组分或更换其他填料的色谱柱。
53.流动相：反相色谱的流动相一般由有机相和水相构成，加减有机相控制色谱峰保留时间(通用规律：有机相比例增加，色谱峰往前移，有机相比例降低，色谱峰往后移)，添加不同改性剂的水相控制峰形。有机相一般为甲醇、乙腈。相同条件下乙腈所出色谱峰一般比甲醇理论塔板数更高，色谱峰更尖锐，梯度变化引起的基线漂移更小，故不考虑价格因素，优先考虑用乙腈。另外，甲醇乙腈的选择也可根据成分来定，如芦丁和异槲皮苷，用甲醇二者往往会重合，乙腈却可很好的分离。部分色谱柱，绿原酸和隐绿原酸用乙腈分离度不好，也可适当引入甲醇或改为甲醇，其分离度会有一定提升。而水相，趋近中性的化合物如部分黄酮类一般可用超纯水。但不论分析弱酸、弱碱还是中性化合物，均可加入一定改性剂防止拖尾，一般可加弱酸。甲酸、乙酸有刺激性气味，冰乙酸冬天易结冰，取用麻烦，而且低波长有紫外吸收，故优先考虑磷酸作改性剂，一般用0.1％磷酸水溶液作水相。虽然磷酸浓度越大，抑制色谱峰拖尾越明显，但磷酸的浓度如无必要，无需加大到0.5％，其ph值趋近绝大多数色谱柱耐受极限，0.1％磷酸水溶液往往已足够，其ph值约为2.2，绝大多数色谱柱均可耐受。另外若是摸索液质联用的色谱条件可采用甲酸或乙酸。若分离生物碱还可以加入二乙胺、三乙胺或引入磷酸调ph到弱酸性。若峰形不理想，水相还可以根据需要采用缓冲盐、无机盐或离子对试剂。但应注意三乙胺、缓冲盐、无机盐、离子对试剂等用多了对色谱柱或仪器有一定伤害，容易造成色谱柱或仪器管道的堵塞，特别是缓冲液调ph值耗时，而且冲柱时间较长，能不用就尽量不用。流动相比例确定好后，若样品成分趋近中性，可将磷酸水溶液替换为超纯水，若拖尾因子在0.8～1.2之间，水相即可确定用超纯水，以减少冲柱时间。如果是5～15min左右的色谱峰出现前沿、分叉、肩峰、双峰等分离不理想情况，注意有机相初始比例是否较低，而配制样品的有机溶剂如甲醇浓度是否较高，若是这样，那可能是溶剂效应造成。这时不应调流动相，用水适当稀释样品溶液即可。若样品溶液加水后产生浑浊，可适当超声，进样后随着有机相浓度升高，会自动溶解。
54.测定波长：若样品主要成分已明确，则设其最大吸收波长为测定波长。若样品所含成分未知，不清楚选哪个波长，若无二极管阵列检测器，可先设210nm或205nm，因为绝大部分成分在低波长均有一定紫外吸收。即使是通常采用蒸发光散射检测器检测的皂苷类，大部分皂苷还是有一定的末端吸收，故部分皂苷类在210nm或205nm一般还是可以出峰。样品测定波长尽量不低于205nm，低波长杂质峰太多，干扰太大。若有多波长紫外检测器，可按一定间隔设置多个波长，如350nm、325nm、300nm、275nm、250nm、225nm、210nm等。若有二极管阵列检测器，可在全谱时扫描各高峰或待测成分的紫外吸收，查看其最大吸收波长，若有多个吸收峰，尽量选高波长的。在展开时，设置测定波长为各待测成分或主要成分的最大吸收，根据色谱峰出峰情况采用变波长检测或多波长检测。
55.柱温：一般设30℃、35℃或40℃。柱温的通用规律：柱温增加，色谱峰往前移，柱温降低，色谱峰往后移，成分性质不一致，前后移动多少不一致。部分相邻色谱峰，只要其紫外吸收光谱不一致，说明为不同类别化合物，即可利用此性质通过改变柱温提高分离度。注意部分柱温箱无主动降温功能，故为了更好的通用性，柱温设置一般不低于25℃，可设为高于
室温，如30℃、35℃或40℃。
56.流速：常规4.6mm内径色谱柱一般设1ml/min。流速的通用规律：流速增加，色谱峰整体往前移，反之整体往后移，一般不调流速。
57.实施例1
58.本实施例采用三步法检测银黄含片，银黄含片主要由金银花提取物和黄芩提取物组成，主要成分为绿原酸类和黄芩苷类，前者在327nm有最大吸收，而黄芩苷在277nm和316nm有吸收峰，在327nm也有一定吸收，故测定波长可先设327nm。其操作如下：
59.1.银黄含片全谱
60.色谱条件：仪器：dionex p680；色谱柱：lubex kromasil c
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(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20min，5％～100％a，(20～21min，100％～5％a，21～25min，5％a，此部分为回初始比例平衡系统部分，对分析无实质影响，后续色谱条件中均省略，梯度图中以虚线标识)；测定波长：327nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。色谱图及梯度图见图1。
61.从图1中的a线可见，银黄含片第一个色谱峰在6min左右，在梯度图上前推约5min即1min对应的流动相比例约为10∶90，以此作为银黄含片分析的初始比例。最后一个峰在14min左右，在梯度图上前推4min即10min对应的流动相比例约为50∶50(一般取相近的5的倍数，暂时不用精确到具体数值或小数，后续有需要再微调)，以此作为银黄含片分析的终止比例。注意全谱色谱图中，3～4min左右的色谱峰为溶剂峰(不同仪器，不同色谱柱，不同流动相溶剂峰保留时间和峰形不一致)，23.5min左右的色谱峰为流动相比例波动引起的峰，这些均不是样品所含成分引起的有效色谱峰，故不予考虑。
62.2.银黄含片展开
63.从银黄含片全谱可见，其色谱峰并不是很多，也不是特别密集，故展开时间初步定为20min。以下列色谱条件展开银黄含片。
64.色谱条件：流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20min，10％～50％a；其余色谱条件同全谱，结果见图1中的b线。
65.从图1中的b线可见，银黄含片色谱图中分离度较差的主要是3，4号色谱峰，即绿原酸和隐绿原酸，其分离度只有1.47。另外11，12号色谱峰分离也不佳，分离度为1.09。中药hplc含量测定分析中，部分色谱峰若无相应对照品，即使分离不佳，也可暂不考虑其分离度。故银黄含片只需将3，4号色谱峰分离开即可。注意，这里若采用其他色谱柱，如akzonobel kromasil c
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，只需相同条件展开即可让所有色谱峰分离良好，不同色谱柱分离性能不一致，在没有其他色谱柱前提下应根据自己现有色谱柱筛选色谱条件。
66.3.银黄含片加节点
67.图1中的b线中，3，4号色谱峰在7～8min之间出峰。那么尝试在前面6～8min之间，在展开梯度线以上加一节点，减小梯度线坡度。比如在8min加一节点，比例为15∶85。如果11，12号色谱峰不考虑，终止比例时间定在20min。若要考虑11，12号色谱峰的分离，终止比例时间往后适当延长或更换色谱柱即可。
68.以下列色谱条件分离银黄含片。
69.色谱条件：流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～8min，10％～15％a，8min～20min，15％～50％a；其余略。结果见图1中的c线。
70.由图1中的c线可见，加一节点后，3，4号色谱峰分离度由原来的1.47提升到2.68，分离明显提高。此色谱条件可作为银黄含片的最终色谱条件。当然，也可以进一步微调乙腈初始比例，适当增加2～3％，让2号色谱峰更靠前。4号色谱峰在10min左右出峰，那么节点可加在其前面4min，即6min。节点由8min移到6min，其梯度线坡度自动增加。节点还可根据需要适当下移一点，在保证3，4号色谱峰分离度大于1.5的同时，让其峰宽更窄，与后续色谱峰相近，这样整体会更美观。另外，4号和6号色谱峰之间距离太宽，超过5min，也可在10min左右再加一节点，让乙腈比例快速升到25％(这个比例由6号色谱峰全谱梯度图前推5min对应比例确定，前推时间同终止比例的确定)，再将终止比例的时间提前，即可缩短这段空缺。若无需刻意精益求精，也就没有必要去微调。一般这种空缺只要不超过10min均不用考虑。另外，即使采用相同梯度条件，当换成其他填料的c
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色谱柱，所有色谱峰保留时间均会有一定差异，故一般在建色谱条件时，没有必要将各峰保留时间卡得太死，以便留有一定的扩展性去适应其他色谱柱。
71.在加节点时，在图1中的c线，梯度图灰色区域添加任意一点均可。节点越靠上，梯度线坡度越小，3，4号色谱峰分离度越大，但其峰宽也会增加。在加节点后4号峰保留时间会延迟，为保险起见，加节点的时间应在4号峰加节点后的保留时间往前0～4min，尽量不超过5min，不然容易失控。即4号色谱峰应保证由节点前的梯度线控制，若4号色谱峰落在节点后5min以上，那控制4号色谱峰的比例是由节点后一段梯度线控制。虽然这样也能分离，但若遇到梯度线快速变陡，这样有时会失控，很难达到预期分离效果，特别是峰宽快速窄。一般展开时，该峰在什么时候出峰，那么节点定在该位置前面1～2min比较合适。若加节点的直线与原展开直线之间的夹角α越大，说明节点梯度线坡度越小，待分离色谱峰会往后移多一点，此时节点位置应适当往后靠。当夹角α越小，说明节点梯度线坡度降低不多，待分离色谱峰会往后移也不多，此时节点位置可往前靠。
72.实施例2
73.本实施例采用三步法检测小儿金翘颗粒，小儿金翘颗粒主要由金银花、连翘、葛根、大青叶、山豆根、柴胡、甘草组成，常规液相检测的主要成分为绿原酸类和连翘酯苷a，前者在327nm有最大吸收，而连翘酯苷a在328nm有最大吸收，故测定波长可设327nm。其操作如下：
74.1.小儿金翘颗粒全谱
75.色谱条件：仪器：dionex p680；色谱柱：lubex kromasil c
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(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20min，5％～100％a；测定波长：327nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。色谱图及梯度图见图2。
76.从图2中的a线可见，小儿金翘颗粒第一个色谱峰在6min左右，在梯度图上前推5min即1min对应的流动相比例约为10∶90，以此作为小儿金翘颗粒分析的初始比例。最后一个峰在10.3min左右，在梯度图上前推5min即5.3min对应的流动相比例约为30∶70，以此作为小儿金翘颗粒分析的终止比例。
77.2.小儿金翘颗粒展开
78.从小儿金翘颗粒全谱可见，其色谱峰并不是很多，也不是特别密集，故展开时间初步定为20min。以下列色谱条件展开小儿金翘颗粒。
79.色谱条件：流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20min，10％～
30％a；其余色谱条件同全谱，结果见图2中的b线。
80.从图2中的b线可见，只需“全谱-展开”两步，小儿金翘颗粒即可获得比较理想的分离条件。由于10min以前色谱峰分离比较理想，而10min以后的色谱峰比较稀疏，梯度线坡度前面可以保持不变，后面增加梯度线坡度或展开时间变到15min，即可缩短分离时间。
81.3.小儿金翘颗粒加节点
82.要使0～10min的色谱峰保持不变，又要缩短10min以后色谱峰的分析时间，可在2号色谱峰出峰前4min，即5min左右加一节点(15∶85)，再将展开时间由20min改为15min即可。这里的加节点不是为了提高色谱峰分离度，是为了缩短分析时间。
83.色谱条件：流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～5min，10％～15％a，5～15min，15％～30％a；其余略。结果见图2中的c线。虽然1，2号色谱峰分离度有2.22，但挨得太近，若有需要可将节点往后移到6min或7min，或将节点上移到87％，延缓前面一段梯度线坡度，其分离度可以提高到2.5以上，肉眼看上去就会分得更开。
84.绝大部分样品，只要色谱峰分布稀疏，均可将终止比例往前移，以缩短分析时间。但应注意，乙腈以终止比例30％分别展开到20min和15min，最后一个峰一个在20min左侧，一个在15min右侧，这是因为展开到15min时，保留时间提前后，乙腈终止比例不够造成，若要将最后一个色谱峰控制到15min之前，只需提高乙腈终止比例即可。一般让最后一个峰落在平衡时间更好，其分离度更大。但换其他色谱柱，最后一个峰有可能会失控，超出分析时间，导致不出峰。
85.实施例3
86.本实施例采用三步法检测白苞蒿，国内文献对白苞蒿研究不多，故hplc分析报道较少，部分文献本身分离不好，对待测样品的分离往往并无参考价值，白苞蒿的分离可作为未知成分对待，先用210nm拉全谱。
87.1.全谱
88.色谱条件：仪器：dionex p680；色谱柱：lubex kromasil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20min，5％～100％a；测定波长：210nm；其余略。结果见图3和图4中的a线。
89.在图3中，查看各个高峰的紫外吸收光谱，1号色谱峰在210nm有最大吸收，2～5号色谱峰在327nm均有一定吸收，根据其紫外吸收光谱和文献报道，怀疑1～5号色谱峰为富马酸、绿原酸及其异构体，以及黄酮类和异牡荆苷，故以210nm测定前面的富马酸，以327nm测定后面的成分。
90.从图4中的a线可见，白苞蒿第一个色谱高峰在5.4min左右，在梯度图上前推约5min即0.4min对应的流动相比例约为5∶95，以此作为白苞蒿分析的初始比例。当高峰或需要检测色谱峰在5～7min左右出峰，一般直接以全谱的初始比例5∶95作展开的初始比例。210nm下，在20min左右还有些小峰，由于无对照品，这部分色谱峰均可不考虑，不用检测也就不用分离。327nm下，最后一个小峰在10.4min左右，在梯度线上前推5min左右对应的比例为30∶70，以此作为白苞蒿分析的终止比例。
91.2.展开
92.从图3白苞蒿全谱可见，其色谱峰较多且密集，故展开时间初步定为30min。以下列色谱条件展开白苞蒿。
93.色谱条件：流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～30min，10％～30％a；测定波长：210nm，327nm；其余略。结果见图4中的b线。
94.从图4中的b线可见，像白苞蒿这种鲜有报道的中草药，参考文献较少，但往往也只需全谱-展开两步即可获得比较理想的分离条件。23min左右的2个色谱峰，分离度为1.76，满足大于1.5的要求。如果要继续提高这2个色谱峰分离度，可根据图3紫外吸收光谱(3，4号色谱峰)，由于二者紫外吸收光谱不同，说明为不同类别化合物，故除了改变展开时间外，还可尝试改变柱温，柱温由30℃升高到40℃，二者分离度为2.45，见图4中的c线。
95.3.加节点
96.白苞蒿210nm的全谱，15min后有杂质峰，产地不同，其峰高不一。由于白苞蒿的分析前面一段时间采用210nm检测其中一个高峰，若不将后面的杂质峰冲出，有可能会干扰后续进样分析。可根据需要在分析结束后，添加节点，增加有机相比例将其冲出来。即30min后，乙腈用1min升到95％或100％，平衡约4min，再利用1min回到初始比例，再平衡4min即可，见图4中的d线。若需要后续色谱峰对应图谱又无需精细分离，乙腈比例提升速率可缓一点，可用10～15min升到95％或100％，再利用1min回到初始比例，再平衡4min即可。这里的加节点不是为了提高色谱峰分离度，而是为了冲出后面的杂质峰，以避免对后续样品干扰。
97.实施例4
98.本实施例采用三步法检测常春藤，文献报道常春藤主要含酚酸类、黄酮类和皂苷类，故先用327nm和210nm同时检测。
99.1.全谱
100.色谱条件：仪器：dionex p680；色谱柱：lubex kromasil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20min，5％～100％a；测定波长：210nm、327nm；其余略。结果见图5。
101.在全谱中，查看各高峰的紫外吸收光谱，根据其紫外吸收光谱和文献报道，怀疑1号色谱峰为绿原酸。2，3号色谱峰为典型的黄酮类，4，5号色谱峰为皂苷类。可在后续检测追加各高峰的最大吸收256nm，265nm，355nm等测定波长。
102.从图5可见，常春藤第一个色谱峰在6.2min左右，在梯度图上前推约5min即1min对应的流动相比例约为10∶90，以此作为常春藤分析的初始比例。最后一个峰在16.8min左右，在梯度图上前推4min即13min对应的流动相比例约为65∶35，以此作为常春藤分析的终止比例，见图6中的a线。20min以后还有一些色谱峰，但乙腈比例需接近100％才能出峰，而且流动相乙腈的终止比例不够，一般在后续进样无法冲出这些杂质峰，也就对后续分离几乎无影响，故这类成分若无标准品均可不作考虑。
103.2.展开
104.由于常春藤色谱峰较多，极性差异较大，流动相比例变化大，展开时间可定为40min。以下列色谱条件展开常春藤。
105.色谱条件：流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～40min，10％～65％a；测定波长：210nm、327nm，其余略。结果见图6中的b线。
106.3.加节点
107.从图6中的b线可见，前面部分色谱峰密集，后面稀疏，可在20min左右增加一节点，比例为25∶75。
108.色谱条件：流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20min，10％～25％ a，20～40min，25％～65％ a。结果见图6中的c线。
109.从图6中的c线可见，10min和28min左右的色谱峰分离度不佳，可分别在8min和30min再加一节点，降低梯度线坡度，改善其分离。
110.色谱条件：流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～8min，10％～15％a，8～20min，15％～25％a，20～30min，25％～40％a，30～40min，40％～65％a。结果见图6中的d线。可见，通过2次加节点，常春藤即可获得相对理想的色谱条件。流动相比例确定后，即可设置不同的时间段分别采用各成分最大吸收波长检测或直接采用多波长检测。
111.实施例5
112.本实施例采用三步法检测单一组分布洛芬，以210nm拉全谱。若不清楚供试品配制，直接以一粒0.3554g稀释到25ml甲醇中，超声助溶，并过滤即可。
113.1.全谱
114.色谱条件：仪器：dionex p680；色谱柱：lubex kromasil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20min，5％～100％ a；测定波长：210nm，其余略。结果见图7中的a线。经二极管阵列检测器检测，布洛芬在219nm有最大吸收，263nm也有一定吸收，但219nm的峰高是263nm的29倍，为提高检测灵敏度，后续测定波长设为219nm。中国药典布洛芬检测波长采用263nm，其灵敏度较低，主要是由于流动相采用醋酸钠-醋酸缓冲液，在低波长下有背景吸收。另外中国药典法违背了能不用就尽量不用缓冲液原则。
115.从图7中的a线可见，布洛芬全谱时出峰时间为18.7min，在梯度图上前推3min，梯度图对应比例约为80∶20，由于西药一般只有一个峰，故无需梯度，以此作为等度比例。另外，样品浓度太高，先稀释5倍。
116.2.等度
117.色谱条件：流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液(80∶20)；测定波长：219nm，其余略。结果见图7中的b线。
118.从图7中的b线可见，布洛芬等度出峰时间为5min，若觉得和溶剂峰太靠近，也可以适当降低乙腈比例为(75∶25)，相当于前推4min对应的比例，其保留时间延后到6min。布洛芬稀释5倍后，色谱峰还是很高，接近3000，可再稀释1～10倍，控制色谱峰峰高在100～1500以内，见图7中的c线。
119.可见，对于部分单一组分的西药样品，即使不参考任何文献，采用三步法也可快速获取其等度比例，测定波长和供试品配制浓度等。
120.实施例6
121.本实施例采用三步法检测非单一组分氯霉素滴眼液，由于西药成分较少，全谱时间并不需要走20min，15min或10min往往也足够。
122.1.全谱
123.色谱条件：仪器：dionex p680；色谱柱：lubex kromasil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20/15/10min，5％～100％a；测定波长：210nm；其余略。结果见图8。
124.经检测，氯霉素滴眼液中的三个成分最大吸收分别为273nm、278nm、257nm，1和3号
峰，在278nm也具有一定吸收，故在摸索色谱条件时其测定波长可先设为278nm，也可同时设置257nm，273nm和278nm三个波长，最后确定色谱条件后再采用变波长检测或多波长检测。
125.从图8可见，氯霉素之类含多个成分的西药，全谱时间采用10或15min的图谱往往可以直接采用。若嫌乙腈终止比例过高，全谱时终止比例可改为95∶5即可。即多组分西药，往往只需全谱一步即可走出比较理想的色谱条件，当然也可以根据需要采用三步法继续优化流动相比例及色谱条件。
126.验证例1
127.本验证例主要探讨三步法中前推时间和初始比例、终止比例的确定。
128.1.初始比例的确定
129.初始比例控制最前面部分色谱峰，任何时候都应先确定好初始比例。否则，后面的色谱峰即使分的再好，前面的色谱峰没有分离理想，只要初始比例改变，后面的色谱峰也会跟随变化，其分离也会受到一定影响。
130.若全谱时5～7min之间有待检测色谱峰，或前面部分有待分离相邻色谱峰(如展开后5～10min左右有两个或多个色谱峰分离度较低需提高分离度)，预测其初始比例应前推多一点，尽量降低有机相的初始比例，如直接以5∶95作初始比例。若化学成分极性较强，在4～5min之间出峰，紧随溶剂峰，采用5∶95都无法分离，可尝试水性柱，并进一步降低乙腈比例或将乙腈改为甲醇，尽量延长其保留时间并避开溶剂峰。一般控制第一个有意义的色谱峰在5～10min之间出峰。
131.若前面部分全是没有意义无需检测的小峰，那么预测初始比例时前推时间可以小一点，有机相比例也就多一点，使这些小峰尽量靠前，控制其在4～6min之间出峰，接近溶剂峰或与溶剂峰重合均可。
132.另外，部分含量检测其待测成分在全谱图的后面部分色谱峰，若无需分离前面部分色谱峰，有机相初始比例还可根据需要继续提高，让前面部分色谱峰与溶剂峰重合或紧随溶剂峰，只需细分后面部分待测成分及其周围色谱峰即可，这样可以节约分析时间。
133.2.终止比例的确定
134.终止比例是控制最后面的色谱峰的出峰比例，影响样品分离最关键的也是终止比例和展开时间，只要终止比例确定好了，展开到合适的时间，样品即可获得相对理想的分离。然而，仪器不同、色谱柱填料不同、色谱柱批次不同、色谱柱长短不同、全谱时间或展开时间不同，均会导致前推时间和终止比例不一致，但二者均可自行测定。
135.(1)全谱20min终止比例和前推时间的确定
136.从图8可见，氯霉素滴眼液全谱20min时，最后一个峰保留时间为13.9min，若要控制最后一个峰展开时刚好在20min，先大概前推4min，乙腈对应的终止比例50％和55％之间，那么流动相终止比例分别设为55∶45和50∶50，展开到20min，结果见图9。从图9可见，终止比例为55∶45和50∶50时，最后一个峰分别落在20min左右。将这段时间细分为5份，20min对应的比例约为47.5％，而47.5％在梯度图上对应的保留时间是10min。即该台仪器，同一色谱柱，在检测其他样品时，若全谱采用20min，最后一个峰在14min左右，展开时，前推约4min对应的比例作为终止比例。
137.若先确定前推时间，可用公式计算终止比例：
138.终止比例＝95-4.75
×
(最后一个峰保留时间-前推时间)。例如全谱时最后一个峰
在14min，若已确定前推4min，则其对应的0.1％磷酸水溶液的比例是95-4.75
×
(14-4)＝47.5％。
139.若先确定终止比例，可用公式计算前推时间：
140.前推时间＝最后一个峰保留时间-(95-终止比例)/4.75。例如全谱时最后一个峰在14min，若0.1％磷酸水溶液的比例47.5％刚好让最后一个峰落在展开时间20min，则47.5％对应的前推时间为：14-(95-47.5)/4.75＝4min。
141.(2)全谱15min终止比例和前推时间的确定
142.从图8可见，氯霉素滴眼液全谱15min时，最后一个峰保留时间为11.9min，若要控制最后一个峰展开时刚好在15min，先大概前推3min(全谱20min前推4min，全谱15min则稍小，假设3min，否则对应的乙腈比例不够)对应的乙腈比例在60％和65％之间，那么以65∶35和60∶40作为终止比例，展开到15min，结果见图10。从图10可见，流动相终止比例为65∶35和60∶40时，最后一个峰分别落在15min左右，将这段时间细分为5份，15min对应的比例约为37％，而37％在梯度图上对应的保留时间约是9.2min。即该台仪器，同一色谱柱，全谱采用15min，最后一个峰在12min左右，展开时，前推约3min对应的比例作为终止比例。
143.若先确定前推时间，可用公式计算终止比例：
144.终止比例＝95-6.33
×
(最后一个峰保留时间-前推时间)。例如全谱时最后一个峰在12min，若已确定前推3min，则其对应的0.1％磷酸水溶液的比例是95-6.33
×
(12-3)＝38％。
145.若先确定终止比例，可用公式计算前推时间：
146.前推时间＝最后一个峰保留时间-(95-终止比例)/6.33，例如全谱时最后一个峰在12min，若0.1％磷酸水溶液的比例37％刚好让最后一个峰落在展开时间15min，37％对应的前推时间是12-(95-37)/6.33＝2.8min。
147.(3)前推时间的快速确定
148.前推时间和终止比例即使不采用氯霉素滴眼液之类的样品检测，只要展开时发现不合适，下一针根据最后一个峰的保留时间将乙腈比例
±
5％(乙腈+5％，峰往前移；乙腈-5％，峰往后移)，不合适再继续微调即可。找到合适的比例后，其对应的前推时间即可适用于该台仪器及对应的色谱柱，其他样品的检测时即可参考此前推时间，进而快速确定初始比例和终止比例。
149.另外，如果色谱柱长度不是250mm，内径不是4.6mm，或者仪器是超高效液相色谱或制备色谱，其前推时间是不一致的，可按相同原理根据实际情况检测前推时间、初始比例和终止比例。
150.(4)终止比例差异对分离的影响
151.终止比例并无严格要求，如果无需精确控制最后色谱峰的保留时间，若最后一个色谱峰全谱的保留时间12min，则前推0～5min对应的有机相比例50％～80％均可。以氯霉素滴眼液为例，只要最后一个峰落在展开时间周围5min以内，没有超过分析时间即可，见图11。前推时间越短，有机相比例越高，色谱峰越靠前，最后一个色谱峰将在拟定展开时间左侧出峰，并与展开时间之间间隔越大，流动相比例控制的保留时间越不精准。反之亦然，但前推时间尽量不超过5min，前推时间超过5min后，有机相比例往往不够，最后一个峰将落在拟定展开时间右侧出峰，平衡时间之后，甚至超过分析时间，这时终止比例也就无法控制到
最后一个峰。前面提及的不同时间段往前推3～5min仅是为了在摸索梯度程序时保留时间更精准可控，色谱峰分布更均匀更合理，图谱也会更加美观。另外，终止比例无需刻意追求一定要让最后一个峰落在某个时间点，由于液相色谱的特殊性，即使采用相同的仪器、相同的色谱柱、相同的色谱条件，但不同日期实验，其保留时间往往会有一定漂移。而相同填料不同批次的色谱柱其保留时间也会有一定差异，不同填料的c
18
色谱柱其保留时间差异将更大。可见，最后一个峰，即使这次刚好落在某个时间点，但下次检测往往又变了。故只要最后一个色谱峰落在拟定展开时间周围5min以内就非常理想，越接近拟定时间越好。也可看出，初始比例和终止比例取值一般设5的整倍数即可，这样易记易设，没有必要设小数。
152.在新建hplc分析方法时，如果样品检测不涉及重现性，只为发表论文，可稍微降低有机相终止比例，让最后一个峰适当超过一点拟定展开时间，落在平衡时间内，又不超过终止分析时间，让色谱峰分得更开，各峰之间分离度也就更大。若涉及不同单位的重现性，比如建立药典条件，这时应稍微提高有机相终止比例，让最后一个峰落在拟定时间左侧，展开时间也可延长，让其适应更多填料类型的c
18
色谱柱，从而有更大的扩展性，更好的重现性。不然其他科研人员参照药典条件当选用色谱柱不合适容易导致不出峰。另外，若仅作简单含量测定，不涉及论文和不同单位重现性，同样可提高有机相终止比例或缩短展开时间，以尽量缩短总分析时间，提高效率。
153.在采用文献或药典方法时，由于更换了仪器和色谱柱，经常遇到最后一个峰落在拟定展开时间右侧或超出分析时间导致没出峰。若比例允许微调，只需根据情况适当提高有机相终止比例约5％或10％即可，若要更精确就继续微调终止比例。若流动相比例不允许改变，那就逐步尝试不同填料色谱柱，这时往往需要购买不同填料的新色谱柱。
154.验证例2
155.本验证例针对更换仪器和色谱柱后对三步法的适用性进行验证。
156.1.不同仪器相同色谱柱对三步法的影响
157.实施例1～7均采用戴安p680检测，本验证例采用另一实验室的安捷伦1260进行验证，并采用同一根lubex kromasil c
18
色谱柱检测，以白苞蒿为例，进一步验证三步法的适用性，见图12。
158.实验发现，采用同一根色谱柱，更换不同的仪器，保留时间差异不大。全谱的第一个峰在5.8min出峰，虽然前推5min对应的流动相比例更接近10∶90，但该峰为待检测高峰，且落在4～7min之间，故直接以5∶95作初始比例，让其离溶剂峰稍远一些。而最后一个峰在10.8min，在梯度图上前推5min对应的终止比例是30∶70左右，若以10.2min的高峰定终止比例，在梯度图上前推5min对应的终止比例依然是30∶70。以该比例展开后，最后一个高峰落在29.6min，接近拟定展开时间30min，随后的小峰落在平衡时间。提高柱温后，依然能提高24min左右2个色谱峰分离度。
159.可见，采用同一根色谱柱，改变检测仪器后，前推时间、推测的初始比例和终止比例是基本一致的，三步法依然适用。
160.2.不同仪器不同色谱柱对三步法的影响
161.本验证例针对不同仪器不同色谱柱对同一样品的检测进行验证：
162.实验中在检测同一样品时，遇到更多的是不同仪器相同填料不同批次的色谱柱，或不同仪器不同填料色谱柱。本验证例采用安捷伦1260和另一批次的lubex kromasil c
18
色谱柱按实施例3展开色谱条件进行检测，结果见图13中的a线。
163.从图13中的a线可见，在更换仪器和不同批次色谱柱后，直接以原来的展开比例检测，最后一个高峰在32.8min，虽然在30min周围，但后面的部分小峰没有出来，而且27min左右2个色谱峰分离度为1.4。若比例允许微调，那么将乙腈终止比例直接由30％提高到35％，即可将最后一个高峰压在30min以内，后面的小峰落在平衡时间内，见图13中的b线。可见，即使更换仪器和色谱柱后，若分离不理想，往往适当调整终止比例，即可获得理想的分离。
164.当然，也可以按三步法重建色谱条件，由于更换了色谱柱，全谱保留时间往往就差异较大，见图13中的c线。第一个待检测高峰在5.9min出峰，落在4～7min之间，同理直接以5∶95作初始比例。最后一个峰在11.7min左右，前推5min对应的比例约为35∶65，这个比例与前面相差了5％。以此比例为终止比例展开到30min后，最后一个高峰在28.7min，同样接近拟定展开时间30min，随后小峰同样落在平衡时间，见图13中的b线。提高柱温，23min左右两个色谱峰同样能提高分离度，见图13中的d线。可见，影响hplc色谱条件重现性最关键的是色谱柱，其次是仪器。只要色谱柱不同，按三步法筛选的终止比例往往是不一致的。注意这里的终止比例只是保证最后一个峰落在拟定展开时间30min左侧一点，并不是说一定必须用这个比例。如图13中的a线，保持原比例，虽然最后一个峰在30min右侧，依然能用于测定。特别是升高柱温后，30min后的小峰能出来，但接近35min。27min左右2个色谱峰分离度也能大于1.5。另外，对于白苞蒿，虽然展开时间定在25min或20min，分离效果依然尚可，但对于中药材，批次之间，特别是不同产地之间，色谱峰数量，特别是小峰往往有一定差异，故展开时间定长一点，扩展性和适用性更大一点。当然，若各批次各峰之间分离度均较大，那么展开到25min甚至20min也是可以的。
165.可见，采用不同仪器和不同色谱柱，色谱峰若要保持相近的保留时间，前推时间和初始比例基本一致，而终止比例往往略有差异，若有节点，节点比例位置也会有一定差异。但采用三步法筛选的初始比例、终止比例和添加节点的方法和过程还是适用的。即三步法在更换仪器和色谱柱后同样适用。
166.验证例3
167.本验证例对中国药典法、三步法进行对比分析。
168.1、中国药典法、三步法对银黄含片检测的对比分析
169.1)中国药典法检测银黄含片
170.实验继续采用安捷伦1260，以另一批次的lubex kromasil c
18
色谱柱检测，进一步验证三步法的适用性，同时采用中国药典条件检测，并对比二者之间的差异。
171.中国药典2020年版并未收载银黄含片，但收载有银黄片、银黄颗粒、银黄丸、银黄口服液，其色谱条件均一致，故可作银黄含片参照。
172.色谱条件：仪器：安捷伦1260；色谱柱：lubex kromasil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.4％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～15min，5％～20％a，15～30min，20％～30％a，30～40min，30％a；测定波长：327nm；柱温30℃，其余略，结果见图14中的a线。
173.2)三步法检测银黄含片
174.在实施例1的基础上，更换仪器、色谱柱检测，结果见图14中的b线。由于是采用三步法快速筛选建立的色谱条件，故可根据实际情况还可进一步优化。如绿原酸和黄芩苷峰宽不匹配，为了让峰形更美观，可将加节点时间提前2min。由于更换色谱柱后导致最后一个
0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～15min，10％～25％a，15～25min，25％～40％a；测定波长：327nm、240nm、210nm；其余略。结果见图15中的b线。
185.3)对比分析
186.中国药典法初始比例为小数，若没有密集相邻色谱峰，流动相比例若无必要尽量不设小数，初始比例控制最前面的色谱峰，而山银花5min左右仅有1～2个小峰，而且非常稀疏，故初始比例多0.5％还是少0.5％相差不大，一般取5的倍数。当遇到色谱峰连续非常密集，需要进一步提高分离度时，再设其他整数微调。中国药典法检测山银花最大的问题是15～18min之间色谱峰过于密集，327nm下4，5号色谱峰分离度不及1.5。这是由于控制其出峰的有机相比例升得太快造成。传统梯度洗脱流动相比例建立均有一定误区，15～18min的色谱峰，不是由15～18min对应的梯度线控制，而是由10～13min左右的梯度线控制。从这段时间的色谱峰峰宽明显比10min的绿原酸窄即可看出其流动相比例变化很剧烈。而梯度图上，只有10～12min变化剧烈，也进一步印证15～18min的色谱峰是由10～13min左右的梯度线控制。中国药典法检测山银花中的皂苷类采用蒸发光散射检测器检测，其重现性较差，也受检测器限制。皂苷为末端吸收，末端吸收完全可采用210nm或205nm检测。目前的仪器在低波长下基线依然很稳定，没有必要用两套检测器，而且紫外检测器的配置率要比蒸发光散射检测器多得多。另外中国药典法，皂苷类在23min前就出峰了，后面都没有色谱峰，这段时间继续升高有机相的比例没有必要。而且没有回初始比例平衡，这对没有后运行的仪器若采用自动进样，仪器还没平衡好就进样会影响下一针的分离，也容易产生基线波动。若需改善，可在最后一个峰的前4min内即20min开始，利用1min回初始比例，再平衡系统到25min，其不影响皂苷类分离和20min以后的峰形。
187.三步法建立的色谱条件，由于流动相没有剧烈变化，中国药典法挤在一堆，分离不佳的色谱峰采用三步法获得良好的分离。皂苷类在25min左右出峰，而且控制皂苷出峰的梯度线坡度比中国药典法稍大，其理论塔板数及峰高比中国药典法稍高。而且三步法30min已回初始比例平衡好系统，而中国药典法到30min还没去平衡系统。
188.3、中国药典法、三步法对金银花检测的对比分析
189.1)中国药典法检测金银花
190.中国药典在检测金银花时色谱条件如下：
191.色谱条件：仪器：安捷伦1260；色谱柱：lubex kromasil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～8min，14％～19％a，8～14min，19％a，14～34min，19％～31％a，34～35min，31％～90％a，35～40min，90％a；测定波长：327nm、240nm、210nm；其余略。结果见图16中的a线。
192.2)三步法检测金银花:
193.建立中药指纹图谱的其中一个目的在于鉴别药材，中国药典金银花和山银花的指纹图谱条件完全不一致，即使按其中一个条件检测，那么市场上买到的银花究竟是金银花还是山银花，依然模棱两可，没有达到鉴别药材的目的。可见，容易混淆的中药材，要建对比性指纹图谱，那么就要采用同一色谱条件检测。故此，金银花的指纹图谱仍然采用山银花色谱条件检测，结果见图16中的b线。由于图15中的b线中，21min后出的色谱峰是山银花中的皂苷类，而金银花不含这几个皂苷，如果金银花不用同山银花对比，那么色谱条件改为：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～20min，10％～30％a，见图16中的c线。由于15min
以前其梯度线重合，而且这部分梯度线可控制到19～20min左右，故二者峰形基本无变化，仅3号色谱峰会稍微延后一点。
194.3)对比分析
195.采用akzonobel kromasil，dikma diamonsil(2)，dikma inspire等c
18
色谱柱按照金银花中国药典色谱条件检测时，若仅是采用327nm检测酚酸类，每根色谱柱分离均良好。但若要采用240nm检测环烯醚萜类或特征图谱，这几根色谱柱均难以有效分离1，2号色谱峰，换成lubex kromasil稍好，但不及中国药典提供图谱。可见，对于部分难分离的中药成分，中国药典最好提供一些推荐色谱柱，不然一根根试，却又分不开，且不及标准图谱，会非常麻烦。
196.中国药典法检测金银花，8～14min，乙腈保持水平目的是为了提高1，2号色谱峰分离度，然而色谱图上保留时间对应的流动相比例是成分流经检测器时比例阀的比例，真正决定二者分离的比例是在色谱柱里面，这是在其出峰时间前4～5min左右在梯度图上对应的比例。可见，中国药典法决定1，2号色谱峰分离的比例是在5～6min左右的梯度线，8～14min的比例已无法控制1，2号色谱峰。故此8～14min，乙腈比例保持水平是无意义的。34～35min，快速提高乙腈比例有可能是受到2015版中国药典法检测金银花有干扰的阴影，为了冲出后面的异绿原酸峰。然而，在金银花中3号色谱峰(异绿原酸c)即为最后一个色谱峰，其在29min就出峰了，后面再无明显色谱峰，更换多个批次和品种的金银花依然如此。可见，35min时提高乙腈比例到90％，是多余的。中国药典法同样没有回初始比例，而且终止比例和初始比例落差较大，这对于初学者若没有设置后运行时间，也没有回初始比例平衡系统，下一针基线开始位置往往会出现波动，而且峰形也有可能错乱。
197.为了同山银花对比，三步法建立的金银花色谱条件，柱温采用30℃，1，2号色谱峰虽然达到基线分离，但分离度只有1.6左右。若同中国药典法一样采用25℃，其分离度会提高到2.0以上。另外，240nm下，不同产地的金银花，小峰的数量和峰高有可能不一致，若20min分离欠佳，适当延长展开时间即可。三步法25min以内即可检测完毕并平衡好系统，而中国药典法包含平衡时间，至少需要45min，药典提供的图谱检测48min，三步法分析时间明显缩短。
198.4、中国药典法、三步法对桑叶检测的对比分析
199.1)中国药典法检测桑叶
200.中国药典在检测桑叶时色谱条件如下：
201.色谱条件：仪器：安捷伦1260；色谱柱：akzonobel kromasil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)，lubex kromasil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～5min，30％a，5～10min，30％～35％a，10～15min，35％～40％a，15～18min，40％～50％a；测定波长：358nm；其余略。结果见图17中的a线。
202.2)三步法检测桑叶
203.色谱条件：仪器：安捷伦1260；色谱柱：色谱柱：akzonobel kromasil c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)
–
0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱，0～8min，10％～14％a；8～25min，14％～30％a；检测波长：358nm，其余略。结果见图17中的b线。
204.3)对比分析
205.中国药典法在检测桑叶时，只要绘出其梯度图，就会发现10min这个节点的前后都
是在同一直线上，即10min这个节点是多余的，完全可删除。在传统hplc分析方法摸索中，若没有绘出梯度图，将会出现一些明显失误。另外，尝试多根色谱柱，在18min之前芦丁均无法出峰。若18min后提高终止比例或用终止比例保持至25min左右，采用akzonobel kromasil色谱柱，芦丁和最后一个峰分别在21.8min和25.1min左右出峰。而lubex kromasil色谱柱要在23.8min和28.1min出峰。若18min后直接或利用1～2min回初始比例，akzonobel kromasil色谱柱，芦丁虽然仍能在21.8min出峰，但芦丁后面两个色谱峰由于甲醇终止比例不够，无法出峰(这里进一步印证出峰时间前4～5min对应的比例才是控制色谱峰的出峰比例)。而若用lubex kromasil色谱柱，芦丁要近40min才出峰，已无意义。《中国药典》通则0512只规范了hplc等度洗脱的比例调整方法，药典并没有规定如何调整梯度洗脱比例。即使参照等度洗脱流动相比例调整方法，允许乙腈终止比例增加10％，但15～18min内芦丁依然不出峰，因为控制15～18min色谱峰的比例是在11～14min之间的梯度比例，这个比例是没有变的。按中国药典条件，18min停止分析，没出峰就说明桑叶样品里面没有芦丁？可见，在参照中国药典条件时，若没出峰，建议允许终止比例做10％以内的调整或沿终止比例梯度线延长5～10min，当然也可给出参考色谱柱。另外，桑叶中国药典法最大的问题在于芦丁和异槲皮苷色谱峰重合在一起(见图17中的a线)，这两个成分用甲醇作有机相很难分离。
206.桑叶采用三步法建立的色谱条件，芦丁和异槲皮苷分离度为6.5。异槲皮苷的峰面积是芦丁的3.5倍左右。可见，hplc检测不同于uv检测，不能以芦丁和异槲皮苷的混合峰代替芦丁峰，芦丁仅占混合峰的1/5左右。三步法色谱条件即使更换其它色谱柱，分离依然良好，芦丁依然能出峰。另外，三步法在与中国药典法相近的分析时间，分离色谱峰比中国药典法更多，每个色谱峰均分离良好，理论塔板数也明显比中国药典法高，这种色谱条件无论是作含量检测还是指纹图谱均绰绰有余，具有明显的优势。
207.验证例4
208.本验证例主要探讨全谱对检测的重要作用。
209.任何样品在建立hplc分析方法时，均应先拉一个全谱，不但可以确定初始比例和终止比例，还可以获取样品的所有色谱峰信息，特别是确定后续检测是否有其它色谱峰干扰。最为典型的是中国药典2015年版的金银花分析，其采用等度洗脱。即乙腈-0.4％磷酸水溶液(13∶87)，由于绝大部分常规色谱柱绿原酸均在10min左右出峰，通常检测15～20min，如果仅是测定1～3批样品，那不会存在任何问题。但采用乙腈-0.4％磷酸水溶液(13∶87)持续分析第一针样品，就会发现在68min和112min左右(色谱柱不同，该保留时间不同)，分别会出现2个色谱峰(分别为异绿原酸a和异绿原酸c)。若每针样品只走20min，当进第4针样品时，第一针样品本应在68min出的异绿原酸a色谱峰就会干扰第4针样品的图谱。若还要继续进样，随后每一针样品均会被连续干扰。从第6针样品开始，会受到第3针的异绿原酸a和第1针的异绿原酸c双重干扰，后续每一针均如此，很难继续分析下去，见图18。
210.另外，通常情况下等度洗脱并不适合绝大多数中药样品。如图18中的绿原酸峰，在中国药典规定的比例下部分色谱柱绿原酸是一个峰，但采用kromasil等填料的色谱柱会出现肩峰或拖尾，这是由于后面还有一个隐绿原酸造成，见图16。由于色谱柱分离性能不一致，部分色谱柱这个峰会包埋在绿原酸峰里面，造成肉眼看到是一个峰。即使采用二极管阵列检测器的纯度检测，由于二者紫外吸收接近，从而造成峰纯度因子依然很高，但实际是两个峰。这是由于等度洗脱时乙腈比例过高引起，降低乙腈比例即可将二者分开，但若继续采
用等度洗脱，保留时间会延长。这时就要用到梯度洗脱，即需要将二者分离，也需要缩短分析时间。
211.可见，任何样品，特别是中药类复杂样品必需先走全谱，除了可以确定初始比例和终止比例外，还可以确定样品色谱峰信息以及后面有无干扰峰，若有干扰峰则应增加有机相比例尽量将后面的色谱峰冲出。若需要这段时间的图谱，则有机相在5～15min缓慢提升。若不要干扰峰图谱，则在1～2min快速提升有机相比例，将后面的干扰峰快速冲出来后再回初始比例平衡系统。
212.以上所述实施例和验证例仅表达了本技术的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本技术保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。

技术特征：
1.一种快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，采用全谱-展开-加节点三步法，具体步骤如下：(1)全谱：以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相，在20min内，乙腈比例由5％线性升到100％；得到的全谱图用于快速获取样品的所有色谱峰信息，同时确定后续展开分析的展开时间、初始比例和终止比例；(2)展开：a.初始比例：在步骤(1)所得全谱图中，在设定波长下，将除溶剂峰以外第一个肉眼可见色谱峰的保留时间往前推3～5min，在全谱梯度图上对应的比例定为初始比例；b.终止比例：在步骤(1)所得全谱图中，在设定波长下，将除流动相波动峰以外最后一个肉眼可见色谱峰的保留时间往前推3～5min，在全谱梯度图上对应的比例定为终止比例；再根据色谱峰数量和疏密选择15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、60min中的一个作为展开时间，得到的展开图用于确定后续加节点的位置；(3)加节点：a.提高色谱峰分离度：对于步骤(2)所得的展开图，若前面部分色谱峰密集或分离度较低，后面部分色谱峰相对稀疏，在原梯度线上方适宜位置加一节点，将前面部分梯度线坡度降低，后面部分梯度线坡度升高，同时初始比例、终止比例和展开时间保持不变；若是后面部分色谱峰密集或分离度较低，前面部分色谱峰相对稀疏，在原梯度线下方适宜位置加一节点，将后面部分梯度线坡度降低，前面部分梯度线坡度升高，同时初始比例、终止比例和展开时间保持不变；如果前后色谱峰均较多且密集，则不用添加节点，初始比例和终止比例保持不变，直接增加展开时间即可；b.缩短分析时间：对于步骤(2)所得的展开图，若前面部分色谱峰分离较好，而后面部分色谱峰相对稀疏，在前面部分分离较好的最后一个色谱峰前0～4min内，在其对应的梯度线上添加一节点，前面部分梯度线保持不变，保持终止比例不变或乙腈增加5％，缩短洗脱时间即可；若色谱峰分离较好，但中间有超过10min的间隔，则在前面部分的最后一个色谱峰前0～4min内，在其对应的梯度线上添加一节点，前面部分梯度线保持不变，中间部分在1～5min内快速提高梯度线坡度，直至后面部分的第一个峰前推3～5min对应的比例为止，再添加一节点，保持终止比例不变或乙腈增加5％，缩短洗脱时间即可；c.冲出杂质峰：若乙腈终止比例不够，样品洗脱后还有杂质峰，当杂质峰对后续样品有干扰时，则在原梯度后面追加节点，在1～15min内乙腈比例提高至90％～100％，保持4～5min，再在1min内返回初始比例平衡4～5min。2.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，hplc所用色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的常规高效液相色谱柱，内径为4.6mm，长度为250mm。3.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，步骤(1)中，若样品在20min后还有色谱峰或20min仍未出峰，则采用100％乙腈继续洗脱5～10min。4.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，步骤(2)中关于初始比例的设置，以全谱图中除溶剂峰以外第一个肉眼可见色谱峰为依据：第一个肉眼可见色谱峰在10min以内，前推5min；第一个肉眼可见色谱峰在10～15min，前推4～5min，趋近10min取5，趋近15min取4；第一个肉眼可见色谱峰在15～20min，前推3～4min，趋近15min
取4，趋近20min取3，在全谱梯度图上对应的比例作为初始比例，乙腈比例取值舍入为最接近的5的倍数。5.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，步骤(2)中关于终止比例的设置，以全谱图中除流动相波动峰以外最后一个肉眼可见色谱峰为依据：最后一个肉眼可见色谱峰在5～10min以内，前推5min；最后一个肉眼可见色谱峰在10～15min以内，前推4～5min，趋近10min取5，趋近15min取4；最后一个肉眼可见色谱峰在15～20min以内，前推3～4min，趋近15min取4，趋近20min取3，在全谱梯度图上对应的比例作为终止比例，乙腈比例取值舍入为最接近的5的倍数；最后一个肉眼可见需要分离的色谱峰在20～25min以内，乙腈终止比例设90％～100％。6.如权利要求1所述的快速建立hplc梯度洗脱程序的方法，其特征在于，步骤(3)中，如果需要微移色谱峰或需要精确控制色谱峰的出峰时间，则继续微调初始比例或终止比例，以及进一步微调节点位置和比例或追加节点。

技术总结
本发明公开了一种快速建立HPLC梯度洗脱程序的方法，涉及HPLC检测技术领域。本发明采用全谱-展开-加节点三步法；第一步，通过拉全谱，在梯度图上快速确定初始比例和终止比例；第二步，利用初始比例和终止比例，将样品展开到合适分析时间；第三步，根据色谱峰的疏密加节点，进一步细分未分开的色谱峰。本发明适合快速建立中药样品、复杂样品或未知样品的HPLC梯度洗脱程序，也可快速获取简单成分样品的等度比例，具有广泛的应用价值和教学价值。具有广泛的应用价值和教学价值。具有广泛的应用价值和教学价值。


技术研发人员：杨世艳 何兵 何孟原
受保护的技术使用者：西南医科大学
技术研发日：2023.03.05
技术公布日：2023/8/9