一种用于尿酸检测的DNA片段、组合物、试剂盒以及尿酸检测方法和应用

一种用于尿酸检测的dna片段、组合物、试剂盒以及尿酸检测方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于尿酸检测的dna片段、组合物、试剂盒以及尿酸检测方法和应用。


背景技术：

2.尿酸(2,6,8-三羟基嘌呤，c5h
14
n4o3)是人体中嘌呤代谢的最终产物，主要经肾脏排出；正常人血液中尿酸浓度约为180～360μm，尿液中尿酸浓度约为1.4～4.4mm。在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血清中尿酸含量检查中，血清尿酸浓度男性高于420μm、女性高于360μm，便被诊断为高尿酸血症。血清尿酸浓度低于119μm则被认为患有低尿酸血症。高尿酸血症患者易发展为痛风，可出现反复发作的痛风性关节炎、间质性肾炎、关节畸形、尿酸性尿路结石等症状，患者常伴有肥胖、高血糖、高血脂和动脉硬化等症状。低尿酸血症是由一些罕见的嘌呤合成与分解代谢遗传性障碍，或者是由服用别嘌醇或肝脏疾病引起的获得性黄嘌呤氧化酶缺陷造成尿酸合成减少所致。
3.目前对血液及尿液中尿酸的检测方法包括酶法、化学发光法(主要为磷钨酸还原法)、伏安法、高效液相色谱法等。伏安法和高效液相色谱法的样品制备过程繁琐，需要昂贵的仪器设备和专业操作人员。化学发光法容易受到样品中其他发色团的干扰，尿酸酶法虽然具有良好的选择性，但其用酶量较大、价格高昂，限制了其应用。因此，如能开发一种快速便捷、高灵敏测定尿酸的方法，实现对高尿酸血症及低尿酸血症患者样本中尿酸含量准确测量，并将其应用于临床或居家患者血液尿酸及尿液尿酸的检测，将具有非常好的应用前景。


技术实现要素：

4.针对以上技术问题，本发明提供了一种用于尿酸检测的dna片段、组合物、试剂盒以及尿酸检测方法和应用，该试剂盒和检测方法利用尿酸操纵系统与可特异性结合dfhbi的适配体序列相结合所产生的荧光信号来检测尿酸，能够实现血液尿酸及尿液尿酸的快速、高灵敏检测。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.第一方面，本发明提供一种用于尿酸检测的dna片段，其序列包括t7启动子序列、尿酸阻遏蛋白结合位点序列、西兰花荧光响应适配体序列。
7.上述dna片段能够通过样品中的尿酸分子与相关操纵蛋白
–
调控序列间的相互作用而灵敏调控rna的合成，将rna生成量转化成荧光响应强度后，即可实现对尿酸的快速、高灵敏测定。
8.结合第一方面，该dna片段的序列如seq id no.1～seq id no.4任一项所示。
9.seq id no.1为：
10.cagcgacccaggtcgactctagataatacgactcactataggaggtcagtaggtagacatctaagtat
ccccacatactctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgtatgtgggtagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgatccccgggtaccaattcgcagcg；
11.seq id no.2为：
12.ataatacgactcactataggaggcagctcagtaggtagacatctaagtatcataccccacatactctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgtatgtgggtagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg；
13.seq id no.3为：
14.gataatacgactcactataggcatgtcagtaggtagacatctaagtatccccacatactctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgtatgtgggacgattagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgagc；
15.seq id no.4为：
16.gataatacgactcactataggcaccaaggtcagtaggtagacatctaagtatccccacatactctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgtatgtgggaacaatagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgacccag。
17.seq id no.1～seq id no.4只是作为该dna片段的具体实施方式的四段序列，并不代表该dna片段仅能以上述四种序列存在。凡是同时包含t7启动子序列、尿酸阻遏蛋白结合位点序列、西兰花荧光响应适配体序列且用于尿酸检测的的dna片段均在本发明的保护范围之内。
18.第二方面，本发明还提供一种用于尿酸检测的组合物，其原料包括上述dna片段，以及rntp、hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt(二硫苏糖醇)、亚精胺和nacl。
19.dfhbi是一种rna适配体特异性激活的荧光探针，可特异性地结合几种rna适配体并产生特定荧光。该组合利用尿酸操纵系统与可特异性结合dfhbi的适配体序列相结合所产生的荧光信号，能够基于转录调控来实现尿酸的快速、高灵敏检测。该组合物的工作原理示意图如图1所示。
20.该组合物中的hucr可选用已知的蛋白序列，也可选用经优化的蛋白序列。
21.优选地，所述组合物的制备方法为：将所述rntp、hucr、dna片段、t7rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl溶于缓冲溶液中，真空冷冻干燥，即得。
22.优选地，所述缓冲溶液为浓度10～100mm的tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、hepes缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液或磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。
23.优选地，所述缓冲溶液的ph为7.0～8.8。
24.第三方面，本发明还提供一种用于尿酸检测的试剂盒，所述试剂盒中包含上述dna片段或组合物。
25.第四方面，本发明还提供一种尿酸检测方法，用上述dna片段或组合物对尿酸进行检测。上述组合物通过与含有尿酸的溶液共同孵育后可合成rna，继而通过rna生成量与荧
光响应强度的正相关性即可实现对尿酸的快速、高灵敏测定。
26.优选地，所述尿酸检测方法具体包括以下操作：
27.s1、将rntp、hucr、dna片段、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl溶于缓冲溶液中，真空冷冻干燥，得到反应冻干粉；
28.s2、用含有dtt和nacl的缓冲溶液溶解所述反应冻干粉后，加入含尿酸的待测液体进行孵育，之后进行荧光检测，并根据荧光强度计算尿酸含量。
29.本发明将尿酸操纵系统与可特异性结合dfhbi的适配体序列进行结合，利用产生的荧光信号来达到尿酸的快速、高灵敏检测的目标。
30.优选地，所述缓冲溶液为浓度10～100mm的tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、hepes缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液或磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。
31.优选地，所述缓冲溶液的ph为7.0～8.8。
32.优选地，在s1的所述缓冲溶液中，所述rntp中四种核糖核苷三磷酸的浓度均为1～5mm，所述hucr的浓度为1.5～10μm，所述dna片段的浓度为30～300nm，所述t7 rna聚合酶的浓度为6～20ng/ml，所述焦磷酸酶的浓度为8～40u/ml，所述氯化镁的浓度为5～15mm，所述亚精胺的浓度为0.2～4mm，所述dfhbi的浓度为1.5～5mm，所述dtt的浓度为5～15mm，所述nacl的浓度为5～100mm。
33.优选地，在s2的所述缓冲溶液中，所述dtt的浓度为1～8mm、所述nacl的浓度为5～100mm。
34.优选地，所述荧光检测为激发波长为472nm，发射波长为507nm。
35.优选地，所述孵育的温度为30～50℃，孵育时间10～60min。
36.第五方面，本发明还提供上述dna片段、组合物、试剂盒或尿酸检测方法在检测生物样品或非生物样品中尿酸的应用，例如在检测尿液尿酸或血液尿酸中的应用。
附图说明
37.图1为本发明的用于尿酸检测的组合物基于转录调控实现尿酸灵敏检测示意图；
38.图2为本发明实施例10中对浓度分别为0μm、25μm、50μm的尿酸溶液处理后的溶液在紫外灯下的状态。
具体实施方式
39.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
40.实施例1
41.本发明实施例提供了一种用于尿酸检测的dna片段，其序列如seq id no.1所示。
42.实施例2
43.本发明实施例提供了一种用于尿酸检测的dna片段，其序列如seq id no.2所示。
44.实施例3
45.本发明实施例提供了一种用于尿酸检测的dna片段，其序列如seq id no.3所示。
46.实施例4
47.本发明实施例提供了一种用于尿酸检测的dna片段，其序列如seq id no.4所示。
48.实施例5
49.hucr的制备方法为：
50.将合成的hurr基因(核酸序列如seq id no.5所示)利用pcr法进行扩增。上引物序列为5
′‑
tgcatgccatgggccaccatcaccatcacc-3
′
，下引物序列为5
′‑
agcgcggatccttattacactccctgttcc-3
′
。
51.设置的pcr条件如下：
[0052][0053]
反应完成后，利用胶回收试剂盒对pcr产物进行回收，利用ncoi/xhoi对pcr产物以及pet-28a载体进行切割，利用t4 dna连接酶对切割后的pcr产物和pet-28a载体连接，获得重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞(dh5α，市售)扩增后，利用市售质粒提取试剂盒提取质粒、测序，将正确序列的重组质粒重新导入表达型大肠杆菌重组感受态细胞(bl21(de3)，市售)中，挑取单克隆菌落置于含50mg/l硫酸卡那霉素的5ml的lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，经121℃高压灭菌20min)的小试管中，在37℃，220rpm条件下在振荡培养箱中培养12h，作为一级种子。将一级种子按照1％接种量，接种于含有100ml无菌lb液体培养基的250ml培养瓶中，在37℃，220rpm条件下在振荡培养箱中培养12h，作为2级种子。将二级种子接种于含800ml无菌lb培养基的2l大培养瓶中，在37℃，220rpm条件下在振荡培养箱中培养至菌体od
600
达到0.8后，加入终浓度为0.1mm的诱导剂iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，在16℃，220rpm条件下在振荡培养箱中继续培养16h，收取菌体。菌体利用100ml缓冲液(50mm tris-hcl,100mm nacl，ph 8.0)重悬后，经高压细胞破碎仪破菌、离心、滤膜过滤、亲和层析、分子筛进一步纯化后，利用蛋白浓缩管对蛋白进行浓缩，并最终将蛋白保存至保存液中(50mm tris-hcl，100mm nacl，20％v/v甘油)，经bsa试剂盒测定蛋白浓度后，置于
–
80℃冷冻保存备用。
[0054]
实施例6
[0055]
hucr的制备方法为：
[0056]
将合成的hurr基因(核酸序列如seq id no.6所示)利用pcr法进行扩增。上引物序列为
[0057]5′‑
tgaggggaattccatatgcaccaccaccaccaccacatgagc-3
′
，下引物序列为5
′‑
agcgcggatccttattacactccctgttcc-3
′
。
[0058]
设置的pcr条件如下：
[0059][0060]
反应完成后，利用胶回收试剂盒对pcr产物进行回收，利用ncoi/xhoi对pcr产物以及pet-28a载体进行切割，利用t4 dna连接酶对切割后的pcr产物和pet-28a载体连接，获得重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞(dh5α，市售)扩增后，利用市售质粒提取试剂盒提取质粒、测序，将正确序列的重组质粒重新导入表达型大肠杆菌重组感受态细胞(bl21(de3)，市售)中，挑取单克隆菌落置于含50mg/l硫酸卡那霉素的5ml的lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，经121℃高压灭菌20min)的小试管中，在37℃，220rpm条件下在振荡培养箱中培养12h，作为一级种子。将一级种子按照1％接种量，接种于含有100ml无菌lb液体培养基的250ml培养瓶中，在37℃，220rpm条件下在振荡培养箱中培养12h，作为2级种子。将二级种子接种于含800ml无菌lb培养基的2l大培养瓶中，在37℃，220rpm条件下在振荡培养箱中培养至菌体od
600
达到0.8后，加入终浓度为0.1mm的诱导剂iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，在16℃，220rpm条件下在振荡培养箱中继续培养16h，收取菌体。菌体利用100ml缓冲液(50mm tris-hcl,100mm nacl，ph 8.0)重悬后，经高压细胞破碎仪破菌、离心、滤膜过滤、亲和层析、分子筛进一步纯化后，利用蛋白浓缩管对蛋白进行浓缩，并最终将蛋白保存至保存液中(50mm tris-hcl，100mm nacl，20％v/v甘油)，经bsa试剂盒测定蛋白浓度后，置于
–
80℃冷冻保存备用。
[0061]
实施例7
[0062]
hucr的制备方法为：
[0063]
将合成的hurr基因(核酸序列如seq id no.7所示)利用pcr法进行扩增。上引物序列为5
′‑
tgaggggaattccatatgcaccaccaccaccaccacatgagc-3
′
，下引物序列为5
′‑
agcgcggatccttattacactccctgttcc-3
′
。
[0064]
设置的pcr条件如下：
[0065]
[0066][0067]
反应完成后，利用胶回收试剂盒对pcr产物进行回收，利用ncoi/xhoi对pcr产物以及pet-28a载体进行切割，利用t4 dna连接酶对切割后的pcr产物和pet-28a载体连接，获得重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞(dh5α，市售)扩增后，利用市售质粒提取试剂盒提取质粒、测序，将正确序列的重组质粒重新导入表达型大肠杆菌重组感受态细胞(bl21(de3)，市售)中，挑取单克隆菌落置于含50mg/l硫酸卡那霉素的5ml的lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，经121℃高压灭菌20min)的小试管中，在37℃，220rpm条件下在振荡培养箱中培养12h，作为一级种子。将一级种子按照1％接种量，接种于含有100ml无菌lb液体培养基的250ml培养瓶中，在37℃，220rpm条件下在振荡培养箱中培养12h，作为2级种子。将二级种子接种于含800ml无菌lb培养基的2l大培养瓶中，在37℃，220rpm条件下在振荡培养箱中培养至菌体od
600
达到0.8后，加入终浓度为0.1mm的诱导剂iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，在16℃，220rpm条件下在振荡培养箱中继续培养16h，收取菌体。菌体利用100ml缓冲液(50mm tris-hcl,100mm nacl，ph 8.0)重悬后，经高压细胞破碎仪破菌、离心、滤膜过滤、亲和层析、分子筛进一步纯化后，利用蛋白浓缩管对蛋白进行浓缩，并最终将蛋白保存至保存液中(50mm tris-hcl，100mm nacl，20％v/v甘油)，经bsa试剂盒测定蛋白浓度后，置于
–
80℃冷冻保存备用。
[0068]
实施例8
[0069]
本发明实施例提供了一种用于尿酸检测的组合物，原料包括：
[0070]
(1)由seq id no.1所示的dna片段。
[0071]
(2)rntp、由实施例5制备的hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl和浓度为100mm，ph 7.0的pbs缓冲液。
[0072]
该组合物的制备方法为：
[0073]
将上述dna片段和rntp、由实施例5制备的hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl加入到浓度为100mm，ph 7.0的pbs缓冲液中，制成含1mm rntp(即ratp、rutp、rctp和rgtp四种核糖核苷三磷酸皆为1mm)、1.5μm hucr、30nm序列如seq id no.1所示的dna片段、20ng/ml t7 rna聚合酶、8u/ml焦磷酸酶、15mm氯化镁、4mm亚精胺、1.5mm dfhbi、5mm dtt和100mm nacl的缓冲液，将所得缓冲液置于ep管中，通过真空冷冻干燥机中干燥处理，即得。
[0074]
实施例9
[0075]
本发明实施例提供了一种用于尿酸检测的组合物，原料包括：
[0076]
(1)由seq id no.2所示的dna片段。
[0077]
(2)rntp、由实施例6制备的hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl和浓度为10mm，ph 8.8的tris-hcl缓冲液。
[0078]
所述缓冲溶液的ph为7.0～8.8。
[0079]
该组合物的制备方法为：
[0080]
将上述dna片段和rntp、由实施例6制备的hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl加入到浓度为10mm，ph 8.8的tris-hcl缓冲液中，制成含
5mm rntp(即ratp、rutp、rctp和rgtp四种核糖核苷三磷酸皆为5mm)、10μm hucr、300nm序列如seq id no.2所示的dna片段、6ng/ml t7 rna聚合酶、40u/ml焦磷酸酶、5mm氯化镁、0.2mm亚精胺、5mm dfhbi、15mm dtt、5mm nacl的缓冲液，将所得缓冲液置于ep管中，通过真空冷冻干燥机中干燥处理，即得。
[0081]
实施例10
[0082]
本发明实施例提供了一种用于尿酸检测的组合物，原料包括：
[0083]
(1)由seq id no.3所示的dna片段。
[0084]
(2)rntp、由实施例7制备的hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl和浓度50mm，ph 7.9的hepes缓冲液。
[0085]
该组合物的制备方法为：
[0086]
将上述dna片段和rntp、由实施例7制备的hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl加入到浓度50mm，ph 7.9的hepes缓冲液中，制成含2.5mm rntp(即ratp、rutp、rctp和rgtp四种核糖核苷三磷酸皆为2.5mm)、6μm hucr、150nm序列如seq id no.3所示的dna片段、14ng/ml t7 rna聚合酶、24u/ml焦磷酸酶、10mm氯化镁、2mm亚精胺、3mm dfhbi、10mm dtt、50mm nacl的缓冲液，将所得缓冲液置于ep管中，通过真空冷冻干燥机中干燥处理，即得。
[0087]
实施例11
[0088]
本发明实施例提供了一种用于尿酸检测的组合物，原料包括：
[0089]
(1)由seq id no.4所示的dna片段。
[0090]
(2)rntp、hucr、由实施例5制备的t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl和浓度25mm，ph 7.5的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液。
[0091]
该组合物的制备方法为：
[0092]
将上述dna片段和rntp、由实施例5制备的hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl加入到浓度25mm，ph 7.5的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液中，制成含3.5mm rntp(即ratp、rutp、rctp和rgtp四种核糖核苷三磷酸皆为3.5mm)、7μm hucr、200nm序列如seq id no.4所示的dna片段、16ng/ml t7 rna聚合酶、28u/ml焦磷酸酶、12mm氯化镁、3mm亚精胺、4mm dfhbi、12mm dtt、30mm nacl的缓冲液，将所得缓冲液置于ep管中，通过真空冷冻干燥机中干燥处理，即得。
[0093]
实施例12
[0094]
本发明实施例提供了一种用于尿酸检测的组合物，原料包括：
[0095]
(1)由seq id no.4所示的dna片段。
[0096]
(2)rntp、由实施例6制备的hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl和浓度40mm，ph 7.8的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。
[0097]
该组合物的制备方法为：
[0098]
将上述dna片段和rntp、由实施例6制备的hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl加入到浓度40mm，ph 7.8的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中，制成含4mm rntp(即ratp、rutp、rctp和rgtp四种核糖核苷三磷酸皆为4mm)、7.5μm hucr、240nm序列如seq id no.4所示的dna片段、14ng/ml t7 rna聚合酶、30u/ml焦磷酸酶、13mm氯化镁、3.2mm亚精胺、4.5mm dfhbi、11mm dtt、38mm nacl的缓冲液，将所得缓冲液置
于ep管中，通过真空冷冻干燥机中干燥处理，即得。
[0099]
实施例13
[0100]
本发明实施例提供了一种血清中尿酸含量的测定方法。
[0101]
1、不同浓度尿酸溶液的配制：首先将25.2mg的尿酸溶解于5ml的浓度为10mm的氢氧化钠溶液中，溶剂为无菌无rna酶纯净水，配置成浓度为30mm的尿酸溶液，作为母液。之后，将该母液分别用10mm的氢氧化钠溶液稀释，使样本中尿酸终浓度分别为3000μm、2000μm、1500μm、1000μm、750μm、500μm、400μm、300μm、200μm、100μm、80μm、60μm、50μm、35μm、25μm、15μm、10μm、5μm、0μm。
[0102]
2、尿酸测定标准曲线的制作：将30μl的含2mm dtt、20mm nacl、浓度100mm，ph 7.0的pbs缓冲液加入到含有实施例8的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后，向每个ep管中分别加入1.5μl上述配制的不同浓度的尿酸溶液，置于30℃水浴中孵育60min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。每种浓度设置3个重复样本，对每个浓度样本的测定数值取平均值。根据不同尿酸浓度及其对应的荧光值数据，绘制标准曲线并计算线性回归方程。
[0103]
根据上述方法，绘制出的线性方程如下：
[0104]
y＝0.15+0.042x
[0105]
其中，y为荧光数值，x为加入尿酸浓度(μm)。
[0106]
其中，对浓度分别为0μm、25μm、50μm的尿酸溶液处理后的溶液在紫外灯下的状态如图2所示。
[0107]
3、将30μl的含2mm dtt、20mm nacl、20mm tris-hcl，ph 7.4的缓冲液加入到含有实施例8的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后，向每个ep管中分别加入1.5μl人血清样本(来自高尿酸血症患者、健康人样本、低尿酸血症患者)，之后置于30℃水浴中孵育60min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。对每个样本进行3次平行测量，然后对其测定的荧光数值取平均数。最后根据本实施例中获得的标准曲线(y＝0.15+0.042x)，计算出血清样本中的尿酸含量。
[0108]
同时，将血清样本(编号1～3)利用市售尿酸测定试剂盒(磷钨酸法和尿酸酶法)进行测定，与本实施例所述方法进行比较。检测结果如表1所示：
[0109]
表1血清中尿酸含量检测结果
[0110][0111]
实施例14
[0112]
本发明实施例提供了一种血清中尿酸含量的测定方法。
[0113]
1、不同浓度尿酸溶液的配制：同实施例13。
[0114]
2、尿酸测定标准曲线的制作：将30μl的含2mm dtt、20mm nacl、10mm的ph 8.8的tris-hcl缓冲液加入到含有实施例9的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后向每个ep管中分别加入1.5μl上述配制的不同浓度的尿酸溶液，之后置于40℃水浴中孵育60min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。每种浓度设置3个重复样本，对每个浓度样本的测定数值取平均值。根据不同尿酸浓度及其对应的荧光值数据，绘制标准曲线并计算线性回归方程。
[0115]
根据上述方法，绘制出的线性方程如下：
[0116]
y＝0.21+0.028x
[0117]
其中，y为荧光数值，x为加入尿酸浓度(μm)。
[0118]
3、将30μl的含2mm dtt、20mm nacl、10mm的ph 8.8的tris-hcl缓冲液加入到含有实施例9的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后，向每个ep管中分别加入1.5μl人血清样本(来自高尿酸血症患者、健康人样本、低尿酸血症患者)，之后置于40℃水浴中孵育60min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。对每个样本进行3次平行测量，然后对其测定的荧光数值取平均数。最后根据本实施例中获得的标准曲线(y＝0.21+0.028x)，计算出血清样本中的尿酸含量。
[0119]
同时，将血清样本(编号4～6)利用市售尿酸测定试剂盒(磷钨酸法和尿酸酶法)进行测定，并与本实施例所述方法进行比较。检测结果如表2所示。
[0120]
表2血清中尿酸含量检测结果
[0121][0122]
实施例15
[0123]
本发明实施例提供了一种血清中尿酸含量的测定方法。
[0124]
1、不同浓度尿酸溶液的配制：同实施例13。
[0125]
2、尿酸测定标准曲线的制作：将30μl的含2mm dtt、20mm nacl、浓度50mm，ph 7.9的hepes缓冲液加入到含有实施例10的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后，向每个ep管中分别加入1.5μl上述配制的不同浓度的尿酸溶液，之后置于40℃水浴中孵育10min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。每种浓度设置3个重复样本，对每个浓度样本的测定数值取平均值。根据不同尿酸浓度及其对应的荧光值数据，绘制标准曲线并计算线性回归方程。
[0126]
根据上述方法，绘制出的线性方程如下：
[0127]
y＝0.03+0.27x
[0128]
其中，y为荧光数值，x为加入尿酸浓度(μm)。
[0129]
3、将30μl的含2mm dtt、20mm nacl、50mm，ph 7.9的hepes缓冲液加入到含有实施例10的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后，向每个ep管中分别加入1.5μl人血清样本(来自高尿酸血症患者、健康人样本、低尿酸血症患者)，之后置于40℃水浴中孵育10min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。对每个样本进行3次平行测量，然后对其测定的荧光数值取平均数。最后根据本实施例中的标准曲线(y＝0.03+0.27x)，计算出血清样本中的尿酸含量。
[0130]
同时，将血清样本(编号7～9)利用市售尿酸测定试剂盒(磷钨酸法和尿酸酶法)进行测定，并与本实施例所述方法进行比较。检测结果如表3所示。
[0131]
表3血清中尿酸含量检测结果
[0132][0133]
实施例16
[0134]
本发明实施例提供了一种尿液中尿酸含量的测定方法。
[0135]
1、不同浓度尿酸溶液的配制：同实施例13。
[0136]
2、尿酸测定标准曲线的制作：将30μl的含2mm dtt、浓度25mm，ph7.5的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液加入到含有实施例11的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后，向每个ep管中分别加入1.5μl上述配制的不同浓度的尿酸溶液，之后置于40℃水浴中孵育10min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。每种浓度设置3个重复样本，对每个浓度样本的测定数值取平均值。根据不同尿酸浓度及其对应的荧光值数据，绘制标准曲线并计算线性回归方程。
[0137]
根据上述方法，绘制出的线性方程如下：
[0138]
y＝0.06+0.29x
[0139]
其中，y为荧光数值，x为加入尿酸浓度(μm)。
[0140]
3、尿液稀释液的制备：按照尿液体积：纯水体积＝1:9的比例对尿液进行稀释。
[0141]
4、将30μl的含2mm dtt、20mm nacl、浓度25mm，ph 7.5的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液加入到含有实施例11的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后，向每个ep管中分别加入1.5μl尿液稀释液(来自高尿酸血症患者、健康人样本、低尿酸血症患者)，之后置于40℃水浴中孵育10min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。对每个样本进行3次平行测量，然后对其测定的荧光数值取平均数。根据尿液稀释倍数以及本实施例中的标准曲线(y＝0.06+0.29x)，计算出尿液样本中的尿酸含量。
[0142]
同时，将尿液样本(编号10～12)利用市售尿酸测定试剂盒(磷钨酸法和尿酸酶法)进行测定，并与本实施例所述方法进行比较。检测结果如表4所示。
[0143]
表4尿液中尿酸含量检测结果
[0144][0145]
实施例17
[0146]
本发明实施例提供了一种尿液中尿酸含量的测定方法。
[0147]
1、不同浓度尿酸溶液的配制：同实施例13。
[0148]
2、尿酸测定标准曲线的制作：将30μl的含2mm dtt、20mm nacl、浓度40mm，ph 7.8的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液加入到含有实施例12的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后，向每个ep管中分别加入1.5μl上述配制的不同浓度的尿酸溶液，之后置于40℃水浴中孵育10min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。每种浓度设置3个重复样本，对每个浓度样本的测定数值取平均值。根据不同尿酸浓度及其对应的荧光值数据，绘制标准曲线并计算线性回归方程。
[0149]
根据上述方法，绘制出的线性方程如下：
[0150]
y＝0.04+0.32x
[0151]
其中，y为荧光数值，x为加入尿酸浓度(μm)。
[0152]
3、尿液稀释液的制备：按照尿液体积：纯水体积＝1:9的比例对尿液进行稀释。
[0153]
4、将30μl的含2mm dtt、20mm nacl、浓度40mm，ph 7.8的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液加入到含有实施例12的用于尿酸检测的组合物的ep管中，混匀后，向每个ep管中分别加入1.5μl尿液稀释液(来自高尿酸血症患者、健康人样本、低尿酸血症患者)，之后置于40℃水浴中孵育10min。随后将ep管置于冰浴中终止反应，将反应液转移至384孔板中，并将孔板置于酶标仪中，设置激发波长472nm，发射波长507nm，测定荧光值。对每个样本进行3次平行测量，然后对其测定的荧光数值取平均数。根据尿液稀释倍数以及本实施例中的标准曲线(y＝0.04+0.32x)，计算出尿液样本中的尿酸含量。
[0154]
同时，将尿液样本(编号13～15)利用市售尿酸测定试剂盒(磷钨酸法和尿酸酶法)进行测定，并与本实施例所述方法进行比较。检测结果如表5所示。
[0155]
表4尿液中尿酸含量检测结果
[0156][0157]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于尿酸检测的dna片段，其特征在于，其序列包括t7启动子序列、尿酸阻遏蛋白结合位点序列、西兰花荧光响应适配体序列。2.根据权利要求1所述的用于尿酸检测的dna片段，其特征在于，其序列如seq id no.1～seq id no.4任一项所示。3.一种用于尿酸检测的组合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的dna片段，以及rntp、hucr、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺和nacl。4.根据权利要求3所述的用于尿酸检测的组合物，其特征在于，所述组合物的制备方法为：将所述rntp、hucr、dna片段、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl溶于缓冲溶液中，真空冷冻干燥，即得。5.根据权利要求4所述的用于尿酸检测的组合物，其特征在于，所述缓冲溶液为浓度10～100mm的tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、hepes缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液或磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液；和/或所述缓冲溶液的ph为7.0～8.8。6.一种用于尿酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1或2所述的dna片段或权利要求3～5任一项所述的组合物。7.一种尿酸检测方法，其特征在于，用权利要求1或2所述的dna片段或权利要求3所述的组合物对尿酸进行检测。8.根据权利要求7所述的尿酸检测方法，其特征在于，具体包括以下操作：s1、将rntp、hucr、dna片段、t7 rna聚合酶、焦磷酸酶、氯化镁、亚精胺、dfhbi、dtt、亚精胺、nacl溶于缓冲溶液中，真空冷冻干燥，得到反应冻干粉；s2、用含有dtt和nacl的缓冲溶液溶解所述反应冻干粉后，加入含尿酸的待测液体进行孵育，之后进行荧光检测，并根据荧光强度计算尿酸含量。9.根据权利要求8所述的尿酸检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液为浓度10～100mm的tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、hepes缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液或磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液；和/或所述缓冲溶液的ph为7.0～8.8；和/或在s1的所述缓冲溶液中，所述rntp中四种核糖核苷三磷酸的浓度均为1～5mm，所述hucr的浓度为1.5～10μm，所述dna片段的浓度为30～300nm，所述t7 rna聚合酶的浓度为6～20ng/ml，所述焦磷酸酶的浓度为8～40u/ml，所述氯化镁的浓度为5～15mm，所述亚精胺的浓度为0.2～4mm，所述dfhbi的浓度为1.5～5mm，所述dtt的浓度为5～15mm，所述nacl的浓度为5～100mm；和/或在s2的所述缓冲溶液中，所述dtt的浓度为1～8mm、所述nacl的浓度为5～100mm；和/或所述荧光检测为激发波长为472nm，发射波长为507nm；和/或所述孵育的温度为30～50℃，孵育时间10～60min。10.权利要求1或2所述的用于尿酸检测的dna片段、权利要求3～5任一项所述的用于尿酸检测的组合物、权利要求6所述的用于尿酸检测的试剂盒或权利要求7～9任一项所述的尿酸检测方法在检测生物样品或非生物样品中尿酸的应用。

技术总结
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于尿酸检测的DNA片段、组合物、试剂盒以及尿酸检测方法和应用。该DNA片段的序列包括T7启动子序列、尿酸阻遏蛋白结合位点序列、西兰花荧光响应适配体序列，该组合物和试剂盒含有该DNA片段以及DFHBI等物质，能够通过样品中的尿酸分子与相关操纵蛋白


技术研发人员：王跃飞 颜晓晖 张成玉 于卉娟 柴欣
受保护的技术使用者：天津中医药大学
技术研发日：2023.01.16
技术公布日：2023/8/9