一种栓菌半固态发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法

1.本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种栓菌半固态发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法。


背景技术：

2.漆酶(laccase,e.c.1.10.3.2)是一种含有铜离子的多酚氧化酶，该酶是能够降解以酚作为底物为特征的生物催化剂，其在催化降解酚类化合物时，会脱去羟基上的电子和质子，脱去的电子和质子会以氧分子为受体还原成水，并且底物特异性低，能够实现多种化合物的高效氧化。其在造纸生产、纺织加工、工业废水处理和食品加工等诸多领域中有着广泛的用途。
3.漆酶的传统发酵方式是深层液体发酵(submerged fermentation,smf)方法，即液态发酵。中国专利cn104745542b提供了一种液态发酵产漆酶的培养基和培养方法，该发酵所用培养基为葡萄糖、酪蛋白、酵母提取物、维生素b1等，采用摇床振荡培养，该培养基的不足之处是培养基成本较高，液态发酵所产生的废水较多。
4.中国专利cn106119215a提供了一种以柚皮粉、麸皮粉、豆粕、豆渣和葡萄糖等为成分的培养基，采用摇床振荡培养。该培养基虽然降低了漆酶发酵的培养基成本，但是由于采用液态深层发酵培养，其培养基中所含有的固体颗粒在发酵罐培养时，在高速搅拌的状态下，会对溶氧电极以及ph电极产生损伤，并且固体颗粒容易堵塞发酵的管道，该方法不适于发酵罐中大规模发酵产漆酶，同时该方法依然没有解决液态发酵所产废水较多的不足。
5.中国专利cn 103509764b提供了以山核桃蒲壳、菜籽粕粉为主要成分，采用固态发酵法(solid-state fermentation,ssf)培养产漆酶，固态发酵被定义为在没有自由水的固体基质表面培养菌的发酵过程。固态发酵能够有效地利用农林产品的副产物，减少发酵废水的排放；并且采用静置培养，降低了能源的消耗，但是由于固态发酵的基质中缺少自由流动的水，造成了营养物质的传递受到了限制，使得培养基成分利用不彻底，发酵效率较低。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提出一种栓菌半固态发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法，该培养基以及相关的培养方法能够低成本、规模化高效制备漆酶，应用前景广阔。
7.基于上述目的，本发明提供了一种栓菌半固态发酵产漆酶的培养基，所述的培养基配方：橙皮粉10-60g/l、木糖15-35g/l、蛋白胨10-30g/l、硫酸铜0.2-1.2g/l、氯化钠0.5-1g/l，培养基的初始ph值为4.0；所述的栓菌trametes sp.ls-10c，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：20150413，保藏号：cctcc no:m2015191。
8.优选的，所述的培养基配方为：橙皮粉50.4g/l、木糖26.26g/l、蛋白胨18.74g/l、硫酸铜0.76g/l、氯化钠1g/l，培养基的初始ph值为4.0。
9.本发明还提供了一种栓菌半固态发酵产漆酶的方法，包含了以下的步骤：
10.(1)将保藏号为cctcc no:m2015191的栓菌trametes sp.ls-10c接种于种子培养基，200rpm、30℃培养2d，得到发酵种子液；
11.(2)将步骤(1)中制得的发酵种子液接种于权利1或2所述的培养基中，250ml的三角瓶装液量为50ml，接入5ml的种子液，在30℃，静置培养8d，得到漆酶。
12.优选的，所述步骤(1)中种子培养基配方为：葡萄糖20g/l，酵母浸粉3g/l，蛋白胨5g/l，自然ph。
13.采用本发明优化后的培养基，漆酶总活力达到最大为335.55u，单位酶活3.36u/ml。
14.本发明的有益效果：本发明采用半固态发酵(smei-solid fermentation,ssf)法，通过增加水的含量来帮助微生物获得可溶性营养物质，促进其生长和代谢活动。本发明可以克服固态发酵漆酶的缺点，结合了液态和固态两种发酵方式的优点，既能够利用农副产品副产物，也能够做到营养物质的充分传递和利用，并且可以采用静置培养，有利于节约能源，发酵结束后培养中含水量较少，减少了废水的排放，酶的浓度高。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为不同固体基质对半固态发酵产漆酶的影响；
17.图2为橙皮粉含量对半固态发酵产漆酶的影响；
18.图3为碳源种类对半固态发酵产漆酶的影响；
19.图4为木糖浓度对半固态发酵产漆酶的影响；
20.图5为氮源种类对半固态发酵产漆酶的影响；
21.图6为蛋白胨浓度对半固态发酵产漆酶的影响；
22.图7为硫酸铜浓度对半固态发酵产漆酶的影响；
23.图8为接种量对半固态发酵产漆酶的影响；图9为栓菌trametes sp.ls-10c半固态发酵产漆酶的过程曲线。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
25.实施例1
26.单因素确定最佳培养基组分
27.(1)种子培养基和基础培养基配制
28.(a)种子培养基：葡萄糖20g/l，酵母浸粉3g/l，蛋白胨5g/l，自然ph；115℃，灭菌20min。
29.(b)基础培养基：固体基质5g/l(烘干粉碎后过40目筛)，葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉3g/l，硫酸铜0.025g/l，氯化钠1.0g/l、自来水50ml，自然ph。
30.(2)发酵种子液的制备:将栓菌trametes sp.ls-10c，菌种保藏号为：cctccno：m2013106，接种于种子培养基，250ml三角瓶装25ml种子培养基，在200rpm、30℃培养2d后得发酵种子液。
31.(3)不同单因素对半固态发酵产漆酶的影响
32.(a)不同固体基质及含量对半固态发酵产漆酶的影响：在250ml的三角瓶中加入50ml的自来水，然后分别称取不同固体基质的粉末(玉米秸秆、麸皮、柚皮、稻草、橙皮)1.0g，加入到基础培养基中30℃静止培养8d后测定各组漆酶的酶活；在获取最佳固体基质的基础上，称取不同量的橙皮粉分别加入到基础培养基中，使其在培养基中的含量分别为10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l灭菌冷却后接种，30℃静止培养8d后测定各组漆酶的酶活。
33.(b)不同碳源及浓度对半固态发酵产漆酶的影响：在250ml的三角瓶中加入50ml自来水，橙皮粉2.5g，分别加入0.5g的不同碳源(葡萄糖、淀粉、乳糖、蔗糖、糊精、木糖)，考察不同碳源对于发酵产酶的影响；在获取最佳碳源的基础上，添加不同量的最优碳源(木糖)，使其在培养基中的含量分别为15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l，考察其对发酵产漆酶的影响。
34.(c)不同氮源及浓度对半固态发酵产漆酶的影响：在250ml的三角瓶中加入50ml自来水，2.5g橙皮粉，1.25g木糖，分别加入0.04g的不同氮源(酵母粉、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、氯化铵)，考察不氮源对于发酵产酶的影响；在获取最佳氮源的基础上，添加不同量的最优氮源(蛋白胨)，使其在培养基中的含量分别为10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l，考察其对发酵产漆酶的影响。
35.(d)不同硫酸铜浓度对半固态发酵产漆酶的影响：在上述试验的基础上，添加不同的硫酸铜，使其在培养基中的含量分别为0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l、0.8g/l、1.0g/l、1.2g/l，灭菌冷却接种后30℃静止培养，测定各样品瓶中漆酶酶活，考察铜离子对发酵产漆酶的影响。
36.(e)不同接种量对半固态发酵产漆酶的影响：在250ml的三角瓶中加入50ml水，加入上述优化后所得的培养基成分，考察不同接种量4％、6％、8％、10％、12％、14％(v/v)等对发酵产漆酶的影响，30℃静止培养8d后测定各样品瓶中漆酶酶活。
37.(4)酶液的制备：在(a)、(b)、(c)、(d)、(e)条件下发酵结束后，在三角摇瓶中加入50ml的ph5.0的醋酸盐缓冲液，玻璃棒搅拌均匀后，放置在30℃、150r/min摇床中振荡2h后的培养基用8层纱布过滤，浸出液于5000r/min、4℃离心10min得上清液，即为粗酶液。
38.(5)漆酶酶活的测定：采用愈创木酚作为底物测定漆酶酶活。
39.实验方法具体如下，以0.8mmol/l的愈创木酚作为底物，将200μl的稀释合适倍数的漆酶酶液加入800μl的ph4.0的醋酸缓冲液，混匀后放置在40℃水浴锅中预热2min，之后加入1ml的愈创木酚溶液，继续在40℃水浴锅中反应10min，反应结束后，迅速将反应液放入冰水浴中终止其反应，并立即于465nm条件下测定其吸光度，其中以同上步骤但加入的是灭活的漆酶酶液作为空白对照组。
40.漆酶酶活力的定义：在40℃的水浴条件下，1个酶活力单位(u)以1min内1ml的漆酶酶液氧化1μmol的愈创木酚所需的酶量表示。
41.漆酶酶活力计算公式：
[0042][0043]
式中：
△
od465为反应液在465nm处的吸光度的变化；n为漆酶酶液被稀释的倍数；v总为整个反应液体积(ml)；v酶为加入稀释酶液的体积(ml)；ε为愈创木酚在465nm条件下氧化态的摩尔消光系数(1.21
×
104l
·
mol-1
·
cm-1)；t为反应时间(min)；l为比色皿直径(cm)。
[0044]
实验结果
[0045]
不同固体基质及含量对半固态发酵产漆酶的影响：如图1所示，以麸皮作为载体所产漆酶酶活最低，仅为0.37u/ml，而玉米秸秆、柚子皮、稻草和玉米芯对酶活影响差别不大。对比其他农林废弃物，以橙皮粉作为载体半固态发酵所产漆酶的酶活最高，达到1.11u/ml。
[0046]
橙皮粉含量对半固态发酵产漆酶的影响：如图2所示，添加2.5g的橙皮粉，即其在培养基中的含量为50g/l的时候为最佳，此时橙皮粉吸水膨胀，使固体颗粒粘合在一起，颗粒间含有少许流动的自由水，发酵产漆酶的酶活最高，达到1.19u/ml。
[0047]
碳源种类对半固态发酵产漆酶的影响：如图3所示，木糖为碳源，其漆酶酶活达到1.49u/ml，高于其他几种外加碳源。
[0048]
木糖浓度对半固态发酵产漆酶的影响：如图4所示，随着木糖浓度的升高，栓菌半固态发酵产漆酶酶活也在不断的提高，在木糖浓度达到25g/l时，所产漆酶酶活最高为1.57u/ml。
[0049]
氮源种类对半固态发酵产漆酶的影响：如图5所示，有机氮的效果好于无机氮，在有机氮源中以蛋白胨的效果最好，所产酶活达到1.65u/ml。
[0050]
蛋白胨浓度对半固态发酵产漆酶的影响：如图6所示，随着蛋白胨浓度的增加，漆酶的酶活也在增加，并在蛋白胨浓度为20g/l时达到最高酶活为1.68u/ml，但随着蛋白胨浓度进一步的升高，栓菌半固态发酵产漆酶酶活在下降。
[0051]
硫酸铜浓度对半固态发酵产漆酶的影响：如图7所示，随着硫酸铜浓度的升高，栓菌半固态发酵产漆酶酶活也在升高，在硫酸铜浓度达到0.8g/l的时候产漆酶酶活达到最高，为1.94u/ml。
[0052]
接种量对半固态发酵产漆酶的影响：如图8所示，表明随着接种量的不断升高，栓菌半固态发酵产漆酶酶活也在缓慢升高，在接种量达到8％时，产生漆酶酶活最高为2.07u/ml，之后随着接种量的增加栓菌半固态产漆酶酶活下降。
[0053]
实施例2
[0054]
响应面分析确定最佳培养基组成
[0055]
plackett-burnman实验设计筛选影响产酶因素
[0056]
选取接种量、橙皮粉、木糖、蛋白胨和硫酸铜等的含量进行pb实验显著性设计，利用design-expert创建n＝12的筛选实验。
[0057]
表1plackett-burnman实验中选取的各个因素水平
[0058][0059]
表2plackett-burnman实验设计及结果
[0060][0061]
通过对表2进行分析，得表3。模型r2＝0.9937，接种量p值为0.8871》0.05，不显著；木糖浓度和蛋白胨浓度p值分别为0.0422和0.0101均小于0.05，所以显著；橙子皮含量和硫酸铜浓度p值分别为0.0039和0.0006均小于0.01，极显著。故选取橙皮粉含量、木糖浓度、蛋白胨浓度和硫酸铜浓度做响应面优化。
[0062]
表3plackett-burnman实验的方差回归模型分析
[0063][0064]
表4box-behnken实验因素及其水平
[0065][0066]
表5box-behnken实验设计与结果
[0067]
[0068][0069]
表6回归方程方差分析
[0070]
[0071][0072]
对表5进行分析得表6，可以看出方程失拟项不显著(p＝0.2232》0.05)，表明模型合适，回归方程能够预测实验；方程模拟极显著(p《0.01)，表示实验结果与回归方程比较符合，可得二次模拟回归方程：y＝3.40-0.071a+0.30b-0.079c-0.051d+0.13ab-0.092ac-0.22ad+0.078bc-0.018bd+0.15cd-0.34a
2-0.58b
2-0.18c
2-0.26d2,p《0.0001。
[0073]
响应面分析预测得到培养基最佳值为：橙皮粉50.4g/l、木糖26.26g/l、蛋白胨18.74g/l、硫酸铜0.76g/l，预测得到漆酶酶活为3.45u/ml。
[0074]
最优培养基模型进行验证：经过响应面优化后的培养基，进行了三次验证试验，第8天累积产总漆酶活力平均值达到335.55u，单位酶活3.36u/ml。
[0075]
实施例3
[0076]
栓菌半固态发酵产漆酶的方法
[0077]
(1)种子液的制备
[0078]
菌种：栓菌trametes sp.ls-10c。
[0079]
种子培养基：葡萄糖20g/l，酵母浸粉3g/l，蛋白胨5g/l，自然ph；115℃，灭菌20min。
[0080]
种子液的制备
[0081]
250ml三角瓶装25ml种子培养基，从斜面接种后，在200rpm、30℃培养2d后得发酵种子液。
[0082]
(2)发酵培养
[0083]
根据响应面优化后的最优培养基：橙皮粉50.4g/l、木糖26.26g/l、蛋白胨18.74g/l、硫酸铜0.76g/l、氯化钠1g/l，培养基的初始ph值为4.0。250ml的三角瓶装液量为50ml，接入5ml上一步制得的发酵种子液，在30℃条件下静置培养8d产漆酶。栓菌trametes sp.ls-10c半固态发酵产漆酶的过程曲线如图9所示，发酵后的漆酶的总酶活为335.55u，单位酶活3.36u/ml，表明本半固态发酵工艺良好。
[0084]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0085]
本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种栓菌半固态发酵产漆酶的培养基，其特征在于，所述的培养基配方：橙皮粉10-60g/l、木糖15-35g/l、蛋白胨10-30g/l、硫酸铜0.2-1.2g/l、氯化钠0.5-1g/l，培养基的初始ph值为4.0；所述的栓菌trametes sp.ls-10c，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号：cctcc no:m2015191。2.根据权利要求1所述的栓菌半固态发酵产漆酶的培养基，其特征在于，所述的培养基配方为：橙皮粉50.4g/l、木糖26.26g/l、蛋白胨18.74g/l、硫酸铜0.76g/l、氯化钠1g/l，培养基的初始ph值为4.0。3.一种根据权利要求1-2任一项所述的栓菌半固态发酵产漆酶的培养基，其特征在于，包含了以下的步骤：(1)将保藏号为cctcc no:m2015191的栓菌trametes sp.ls-10c接种于种子培养基，200rpm、30℃培养2d，得到发酵种子液；(2)将步骤(1)中制得的发酵种子液接种于权利1或2所述的培养基中，250ml的三角瓶装液量为50ml，接入5ml的种子液，在30℃，静置培养8d，得到漆酶。4.根据权利要求3所述的栓菌半固态发酵产漆酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中种子培养基配方为：葡萄糖20g/l，酵母浸粉3g/l，蛋白胨5g/l，自然ph。

技术总结
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种栓菌半固态发酵产漆酶的培养基及产漆酶的方法。所述的培养基配方为：橙皮粉50.4g/L、木糖26.26g/L、蛋白胨18.74g/L、硫酸铜0.76g/L、氯化钠1g/L，培养基的初始pH值为4.0。将发酵种子液接种于该培养基在30℃条件下静置培养产漆酶。本发明提供的用于栓菌发酵产漆酶的培养基具有成本低、废水排放少、发酵彻底、条件温和、培养方式简单和酶活力高的优点。培养方式简单和酶活力高的优点。培养方式简单和酶活力高的优点。


技术研发人员：孟娜 秦梦茹 郑瑞 郑子昂 魏胜华 李松 唐松 沈琪 张慧云
受保护的技术使用者：安徽工程大学
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/9