一种PBAT农膜高效降解菌及其应用

一种pbat农膜高效降解菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种pbat(聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯)农膜高效降解菌及其在pbat生物降解方面的应用。


背景技术：

2.农膜能够增温保墒，促进作物增产，被广泛的应用于农业生产中。以聚乙烯(pe)为代表的常规农膜存在着回收利用率低、在环境中的降解周期长等问题。废弃的塑料制品在土壤中持续积累，几乎不被降解，造成了严重的生态威胁。聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯(polyadipate/butylene terephthalate，pbat)是己二酸丁二醇酯和对苯二甲酸丁二醇酯共聚而成的可生物降解塑料，兼具传统塑料优良的延展性、热塑性和可生物降解等特点。近年来，以pbat为主要原料生产的生物可降解塑料得到了推广和使用。但相关研究表明，pbat的降解往往需要特定的环境条件，在实际使用过程中降解效率并不高。残留在土壤中的农膜在光照、机械扰动、土壤动植物及微生物等的共同作用下更易破碎，甚至分解、降解为微塑料，对土壤理化性质及作物生长造成影响，进而威胁农田土壤生态系统安全与健康，限制了此类材料的推广应用。因此，亟需加强有关pbat地膜塑料及次生微塑料的绿色治理技术的研发。
3.利用微生物对pbat农膜进行降解可有效缩短农膜在田间的残留时间。现如今针对pbat等塑料废弃物生物治理方法研究较少，有效菌种资源不多，治理效率低，限制了其进一步的扩展应用。目前，对于pbat的微生物降解研究仍存在高效降解菌种资源短缺、降解效率较低、降解机制尚不明确等问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种pbat(聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯)农膜高效降解菌及其在pbat生物降解方面的应用。
5.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
6.一种pbat农膜高效降解菌，菌株为农膜高效降解菌株pusillimonas sp.pbat-8，其特征在于，所述pbat降解菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc m 20221378；保藏时间为：2022年9月5日。
7.上述pbat农膜高效降解菌株的分离筛选方法，将待分离的样品通过连续富集培养，转接至以pbat为唯一碳源的培养基中富集筛选，并通过多次划线分离、纯化和复筛，挑选对pbat农膜降解效果较高的微生物资源，进而获得能够利用pbat为碳源的高效降解菌pbat-8。
8.一种所述菌株的应用，所述菌株在生物降解pbat塑料中的应用。
9.所述菌株在对土壤或水体环境中pbat塑料降解中的应用。
10.所述pbat塑料为含pbat的塑料制品。
11.所述pbat塑料为pbat农膜、含pbat材料的包装袋或含pbat材料的包装用薄膜。
12.一种塑料降解制剂，制剂为含所述的菌株。
13.所述制剂为含有该菌株的培养物、培养菌悬液或发酵液。
14.所述制剂为所述菌株pbat-8培养至od
600
值为0.6～1.0。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
16.采用本发明获得pbat农膜高效降解菌种资源在pbat农膜生物降解方面具有很好的效果。利用本发明提供的菌株对pbat农膜进行生物降解，可观察到降解后的pbat薄膜表面出现大量裂隙和孔洞，薄膜的疏水性显著降低等特征。本发明提供的菌株以及利用该菌株对pbat农膜降解方法绿色环保，操作简便，成本较低，该菌株对pbat具有良好的降解特性，为环境中残留pbat塑料的生物修复提供了新资源和思路，具有广阔的应用前景。
附图说明
17.图1为本发明提供的pbat降解菌pusillimonas sp.pbat-8的菌落形态特征图。
18.图2为本发明提供的扫描电子显微镜下菌株pbat-8的微观形貌图。
19.图3为本发明提供的菌株pbat-8的系统发育树。
20.图4为本发明提供的降解6个月后pbat薄膜在扫描电镜下(a对照；b接菌)的形貌特征图。
21.图5为本发明提供的降解前后pbat薄膜水接触角的变化效果图。
具体实施方式
22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.本发明提供的pbat高效降解菌pusillimonas sp.pbat-8，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc m 20221378；保藏时间为：2022年9月5日。
24.该菌株对环境中pbat塑料具有良好的降解效果，尤其是对应用于农田土壤中的pbat农膜降解效果较好。利用本发明提供的菌株对pbat农膜进行生物降解，可观察到降解后的pbat薄膜表面粗糙，出现大量裂隙和孔洞，薄膜的疏水性显著降低等特征。该方法绿色环保，操作简便，成本较低，为环境中残留pbat塑料的生物修复提供了新资源和思路，具有广阔的应用前景。
25.本发明请求保护上述保藏编号的pbat-8菌株，以及在适度范围内发生突变，且仍然具有很强pbat降解能力的菌株。
26.在实际应用的过程中，有必要将菌株扩大培养制成发酵液(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。
27.本发明的组合物(优选地，在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以，本发明将纯培养物限定为这样一种培养物，其中全部或基本上全部培养物由本发明的pbat降解菌组成。在替代形式中，将混合培养物限定为这样一种培养物，其包含若干种微生物，具体地讲包含若干种微生物菌株，包括本发明的pbat降解菌株。
28.实施例1：pbat降解菌的分离筛选与鉴定
29.(1)pbat降解菌的分离与筛选
30.本发明所获得的pbat高效降解菌是从具有多年农膜使用历史的残留农田土壤及农膜表面分离筛选到的。采集山东省东营市多年使用农膜的农田土壤和残留地膜，称取10g土壤和残留农膜样品，放置于无菌的锥形瓶中，加入生理盐水及玻璃珠，于恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养2h，制备成土壤悬液。将土壤悬液以2％接种量(v/v)转接至无碳源矿物盐培养基(msm)中，并加入已用75％乙醇灭菌的pbat农膜碎片(1g/l)，30℃、180r/min避光条件下振荡培养。定期取样测定培养体系的od
600
值，待培养体系变浑浊后以2％的接种量(v/v)重复转接至新的上述记载的相同无碳源矿物盐培养基中，连续富集培养。富集培养3次后将培养液梯度稀释，制备成不同稀释度的菌悬液，用稀释涂布平板法分离菌株，将菌液涂布于固体msm培养基，并覆盖无菌的pbat薄膜于培养基上，挑选生长迅速的菌落进行划线分离，纯化得到潜在pbat降解菌株，并进行保存。将所得的菌株接种至msm液体培养基中，加入无菌pbat膜片开展降解实验，观察记录菌株的生长情况及pbat膜片的降解动态和降解率。
31.所用的分离筛选培养基为无碳源矿物盐培养基，其组分为：k2hpo4·
3h2o 0.7g，kh2po
4 0.7g，nh4no
3 1.0g，nacl 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，feso4·
7h2o 0.002g，znso4·
7h2o 0.002g，mnso4
·
h2o 0.001g。将上述试剂溶解于1l蒸馏水中，用1mol/l naoh调节ph至7.0。固体培养基的制备是在上述组分中加入1.5％的琼脂。培养基中添加无菌pbat膜片为唯一碳源。
32.通过上述的分离与筛选获得一株生长较为迅速且对pbat地膜降解较快的菌株命名为pbat-8。
33.(2)pbat降解菌株的生理特征及分子生物学鉴定
34.通过对平板上菌落的形态特征观察，发现pbat-8菌落直径约1～2mm，菌落呈圆形，边缘整齐，表面湿润光滑，呈半透明的乳黄色(图1)。
35.收集在lb培养基中生长至对数期的菌体，离心后用2.5％的戊二醛固定4h，用0.1mol/l pbs缓冲溶液洗涤，再依次用30％、50％、70％、90％和100％浓度的乙醇梯度脱水，用叔丁醇置换处理后冷冻干燥。挑取适量菌体固定在碳胶上，表面喷金后用扫描电子显微镜观察菌株的微观形貌特征。扫描电镜下观察发现，菌株pbat-8呈杆状，大小为1～2μm，未发现鞭毛等结构(图2)。
36.挑取少量生长至对数期的菌落进行革兰氏染色，发现光学显微镜下，菌株经染色后显红色，为革兰氏阴性菌。
37.用试剂盒提取菌株的dna，采用细菌通用引物对菌株pbat-8进行pcr扩增。
38.16s rrna基因扩增引物序列如下：
39.27f：5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3'，
40.1492r：5'-ggt tac ctt gtt acg act t-3'。
41.pcr扩增体系(50μl)：模板dna 5μl，mix(2
×
)25μl，引物27f 2μl，引物1492r 2μl，ddh2o 16μl。扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性1min；58℃退火1min；72℃延伸2min，循环30次；最后72℃延伸10min，4℃保存。对扩增产物进行电泳检测，委托上海生工生物技术有限公司测序。将所得的序列与ncbi数据库中已有的序列进行blast分析，并选取同源性相
近的菌株，采用mega 6.0软件用neighbor joining方法构建系统发育树。
42.16s rrna基因序列比对结果显示，菌株pbat-8与pusillimonas sp.ts35出自同一分支，且在进化距离上相对较近(图3)，系统发育树自展值为100，序列一致性比对为99.93％，由此判断菌株pbat-8与pusillimonas sp.ts35可能为同一个属。因此，将菌株pbat-8命名为极小单胞菌pusillimonas sp.pbat-8。该菌株已保藏至中国典型培养物保藏中心。
43.实施例2：菌株对pbat膜的降解实验
44.为评估pbat降解菌对农田土壤中pbat农膜的降解效果，选取田间常用的pbat地膜进行降解实验，所用pbat地膜购自新疆西部节水有限公司。
45.菌株对pbat薄膜的降解实验按照以下步骤进行：
46.菌悬液的制备：挑取少量pbat-8菌落或者pbat-8甘油菌样品，将其接种至lb培养基中振荡培养，培养至对数生长期，用0.01mol/l pbs缓冲溶液洗涤以去除表面残留的培养基，用msm培养基重悬，调节od
600
值为1.0。
47.将pbat农膜表面清洁后裁剪成5
×
5cm大小，称重后用75％的乙醇灭菌。锥形瓶中加入100ml无菌msm培养基，加入3片无菌的pbat薄膜，以10％(v/v)的接种量接种上述含pbat-8菌的菌悬液。同时设置不接菌对照处理，每个处理设置3个平行样。将锥形瓶放置于恒温振荡培养箱中30℃、180r/min振荡培养，定期取样测定降解前后pbat的表面性质变化。
48.pbat膜片表面微观形貌变化按照如下流程处理：培养结束后，取接菌处理组与对照组的pbat膜片，用无菌水冲洗表面多余的培养基，用2.5％戊二醛固定4h，再依次用30％、50％、70％、90％、100％乙醇梯度脱水，每次15min，再用叔丁醇置换。将处理好的样品干燥，固定喷金后在扫描电子显微镜下观察。
49.pbat地膜的质量变化按照下述流程处理：将降解后的pbat膜片在2％(w/v)的十二烷基硫酸钠(sds)溶液中振荡(180r/min)清洗4h，用蒸馏水冲洗干净，在烘箱中低温干燥至恒重，测定降解后pbat地膜的质量，并根据下述公式计算pbat地膜的降解率。
50.pbat降解率(％)＝(初始质量-降解后质量)/初始质量
×
100％
51.pbat膜片表面官能团的变化采用傅里叶红外光谱(ftir)仪进行测定，选择全反射(atr)模式，对清洗干净的膜片自然干燥后测定。扫描波长范围650～4000cm-1
，分辨率4cm-1
，扫描次数32次。
52.用水接触角测量仪表征降解前后pbat膜片疏水性变化。将降解后的pbat样品用蒸馏水洗涤并超声15min，室温风干。将风干后的样品展平、固定于载玻片表面，放置于样品台上，设置接触角测定仪的水滴体积为2μl，使用接触角测量仪拍照，通过sca20(version 2)软件对静态水滴与pbat表面的接触角进行拟合分析。每个处理测定3个平行。
53.扫描电镜的结果表明，接种pbat-8降解菌pbat农膜表面变得粗糙，出现明显的生物降解孔洞，并有裂缝和剥落(图4)。随着降解时间的增加，pbat膜片表面孔洞、裂缝加剧。与对照组相比，接种pbat-8降解菌的处理，40d后pbat膜片的降解率为6.61％。ftir结果表明，随降解时间的增加，pbat各官能团峰值随培养时间增加而降低。羰基(c＝o)官能团的减少，是因为接种降解菌后pbat酯键在酶的作用下发生了水解，导致主链的断裂，并伴随着醇等较小的分子或低聚物的产生，表明pbat发生了降解。疏水性的变化是也是塑料降解的重要指标。水接触角变化的结果表明，接种pbat-8降解菌降解1个月后，pbat膜片表面疏水性
较对照组显著降低(图5)。随着降解时间的增加，pbat膜片的疏水性呈逐渐降低的趋势。
54.最后应明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种pbat农膜高效降解菌，其特征在于：菌株为农膜高效降解菌株pusillimonas sp.pbat-8，其特征在于，所述pbat降解菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc m 20221378；保藏时间为：2022年9月5日。2.一种权利要求1所述菌株的应用，其特征在于：所述菌株在生物降解pbat塑料中的应用。3.按权利要求2所述菌株的应用，其特征在于：所述菌株在对土壤或水体环境中pbat塑料降解中的应用。4.按权利要求3所述菌株的应用，其特征在于：所述pbat塑料为含pbat的塑料制品。5.按权利要求4所述菌株的应用，其特征在于：所述pbat塑料为pbat农膜、含pbat材料的包装袋或含pbat材料的包装用薄膜。6.一种塑料降解制剂，其特征在于：制剂为含权利要求1所述的菌株。7.按权利要求6所述的制剂，其特征在于：所述制剂为含有该菌株的培养物、培养菌悬液或发酵液。8.按权利要求7所述的制剂，其特征在于：所述制剂为所述菌株pbat-8培养至od600值为0.6～1.0。

技术总结
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种PBAT农膜高效降解菌及其在PBAT生物降解方面的应用。菌株为农膜高效降解菌株Pusillimonassp.PBAT-8，其特征在于，所述PBAT降解菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号CCTCC M20221378；保藏时间为：2022年9月5日。该菌株分离自长期使用农膜的农田土壤，具有良好的环境适应性，对农田土壤中的残留的地膜，尤其是在PBAT农膜的生物降解方面具有很广泛的应用，为PBAT农膜的生物降解提供了新资源，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：涂晨 刘颖 骆永明 张馨宁 董小燕
受保护的技术使用者：中国科学院烟台海岸带研究所
技术研发日：2022.09.06
技术公布日：2023/8/9