一种一体化CRISPR-DNA纳米器件及线粒体DNA单碱基突变的活体成像方法

一种一体化crispr-dna纳米器件及线粒体dna单碱基突变的活体成像方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种一体化crispr-dna纳米器件及线粒体dna单碱基突变活体的成像方法。


背景技术：

2.线粒体是复杂的动态细胞器，执行与细胞代谢相关的多种功能。线粒体的核心功能是通过氧化磷酸化产生细胞能量，同时也在钙离子稳态、启动caspase依赖性凋亡、细胞应激反应和胞质蛋白降解中发挥重要作用。线粒体dna(mtdna)的遗传性或获得性突变会导致一系列代谢疾病。由于其高突变率和有限的修复能力，mtdna通常以异质性状态存在，致病性突变频率很高。此外，获得性突变会在整个生命过程中积累，并最终在达到阈值时导致一系列与衰老相关的疾病。携带mtdna突变的细胞的体内可视化对于解决这些疾病的复杂性很重要。尽管如此，具有高空间分辨率的在单细胞和动物模型中识别mtdna突变的困难限制了对此类生物过程的研究。
3.目前已有一些手段能够分析检测线粒体基因组信息。比如单细胞测序，这种方法能够在单个细胞中推断mtdna的异质性、克隆关系等。但是，它仍然不能够反应相关的时间空间信息。原位滚环扩增(rca)方法已被用于可视化固定单细胞或组织切片中野生型和突变型mtdna的共存。通过对具有高空间分辨率的单个mtdna进行基因分型，这些方法可以研究mtdna组织，从而为线粒体疾病的发病机制提供基本见解。除此之外，另一个非常有力的分析工具是crispr-cas系统，它已被用于基因组和转录组的定向编辑、细胞事件的记录、核酸的生物成像和核酸检测等方面。利用crispr/cas9介导的邻近连接技术直接可视化mtdna单碱基突变。这些方法可以研究mtdna的组织结构，有助于研究线粒体疾病的发病机制。然而，由于涉及多种酶及实验步骤，原位rca不能用于活细胞或体内研究。
4.虽然，目前已经有各种用于实现细胞内吞(例如sgc8适体)和靶向线粒体(例如细胞色素c适体)的工具，然而由于缺乏在细胞内对mtdna突变进行可视化的手段，因此现有技术中，迄今为止尚未开发出能够鉴定体内携带mtdna突变的细胞的工具。


技术实现要素：

5.针对现有技术的问题，本发明构建了一种一体化crispr-dna纳米器件，利用该一体化crispr-dna纳米器件能够实现线粒体dna单碱基突变活体的成像。
6.一种一体化crispr-dna纳米器件，它包括dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件；
7.所述dna纳米器件用于介导细胞内吞和靶向线粒体；
8.所述分子识别元件为crispr系统，包含cas12a蛋白和crrna，所述crrna包括靶标dna识别位点、骨架序列和用于结合dna纳米器件的序列；
9.所述信号转换元件为环状报告基团，所述环状报告基团由修饰有荧光基团和猝灭
基团的dna序列构成。
10.优选的，它由dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件按照摩尔比(1:1:10～20)结合而成。
11.优选的，所述分子识别元件和信号转换元件分别通过互补杂交装载在dna纳米器件上。
12.优选的，所述dna纳米器件包括sgc8适体和细胞色素c适体。
13.优选的，所述dna纳米器件是通过滚环扩增反应合成的dna纳米花，所述dna纳米花的模板序列包括模板一和模板二，所述模板一包括sgc8适体和用于杂交分子识别元件的结合位点，所述模板二包括细胞色素c适体和用于杂交信号转换元件的结合位点；
14.所述模板一的序列如seq id no.1所示，所述模板二的序列如seq id no.2所示。
15.优选的，所述靶标dna识别位点的序列根据待检测靶标dna进行设计；
16.所述靶标dna识别位点中，在待检测靶标dna的单碱基突变位点3端插入1-2个碱基错配。
17.优选的，所述骨架序列如seq id no.3所示，所述用于结合dna纳米器件的序列如seq id no.4所示。
18.优选的，所述环状报告基团的序列如seq id no.5所示。
19.本发明还提供上述一体化crispr-dna纳米器件的制备方法，包括如下步骤：
20.步骤1，分别合成dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件；
21.步骤2，将所述dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件混合孵育，通过互补杂交分别将分子识别元件和信号转换元件装载在dna纳米器件上。
22.本发明还提供利用利用上述一体化crispr-dna纳米器件对线粒体dna单碱基突变进行活体成像的方法，包括如下步骤：
23.步骤a，将所述一体化crispr-dna纳米器件与待检测生物样本混合，或将所述一体化crispr-dna纳米器件注射至待检测生物体内；
24.步骤b，对所述待检测生物样本或待检测生物体进行荧光信号检测，实现活体成像。
25.本发明中，所述“待检测生物样本”是指包含有活细胞的样本，如含有细胞的培养基等；所述“待检测生物体”是指活的生物体，如动物模型、人类受试者等。
26.本发明构建了一种一体化crispr-dna纳米器件，其通过dna纳米器件用于介导细胞内吞和靶向线粒体的作用进入活细胞的线粒体中，由活细胞线粒体dna单碱基突变特征序列触发cas12a的反式切割活性，非特异性剪切环状荧光报告基团，释放荧光信号。该一体化crispr-dna纳米器件集成多个模块，提高了线粒体内cas12a/crrna和报告基因的局部浓度，兼具灵敏检测和信号放大的能力，具有单碱基分辨的识别能力，能够反应mtdna的异质性相关的时间空间信息，实现活细胞线粒体dna单碱基突变精准成像。
27.在优选的方案中，利用crispr系统生物探针高效的序列靶向结合能力与单碱基分辨的特异性，并通过对crrna骨架识别序列(靶标dna识别位点)插入一个碱基错配，进一步实现线粒体dna单碱基突变灵敏分析。
28.因此，本发明在相关领域的检测中具有很好的应用前景。
29.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离
本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
30.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
31.图1是本发明的一体化crispr-dna纳米器件合成原理及成像示意图。
32.图2是实施例1一体化crispr-dna纳米器件的制备及表征结果。
33.图3是实验例1一体化crispr-dna纳米器件的内吞作用及线粒体靶向过程分析。
34.图4是实验例2一体化crispr-dna纳米器件的单碱基识别能力分析。
35.图5是实验例3一体化crispr-dna纳米器件检测活细胞(mda-mb-231)中单碱基突变的线粒体dna的结果。
36.图6是实验例4中检测异质性活细胞中突变型线粒体dna的结果。
37.图7是实验例5中检测小鼠体内携带突变型线粒体dna的肿瘤细胞的结果。
具体实施方式
38.以下实施例和实验例中，未特别说明的试剂和材料均为市售品。
39.实施例1一体化crispr-dna纳米器件
40.本实施例的一体化crispr-dna纳米器件包括dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件。
41.其中，dna纳米器件为通过滚环扩增反应合成的dna纳米花，dna纳米花模板序列包括两个部分，其中模板一包含sgc8适体用于细胞表面ptk-7蛋白介导的内吞作用用于高效进入细胞和cas12a/crrna结合位点，模板二包含细胞色素c适体用于靶向线粒体和环形报告基团结合位点。
42.本实施例中，所述模板一的序列如seq id no.1所示：
43.p-ttggttcagttagttaattttcgtaaatcagtcatcttttgcaacaacgtacccaatgcgccggt
44.所述模板二的序列如seq id no.2所示：
45.p-cggccccagacacggtttttaaccgtacagtattttcccggcggcgcagcagttatt
46.dna纳米器件整体的序列如seq id no.6所示：
47.aataactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttaaaaaccgtgtctggggccgaccggcgcattgggtacgttgttgcaaaagatgactgatttacgaaaattaactaactgaaccaa
48.分子识别元件为crispr系统，包含cas12a蛋白和crrna。crrna序列包含靶标dna识别位点、骨架序列和用于结合dna纳米器件的序列。其中靶标dna识别位点通过在单碱基突变位点附近插入一个碱基错配来提高其单碱基识别特异性。用于结合dna纳米器件的序列在crrna骨架序列5端延长20nt，通过与dna模板序列杂交有效负载在dna纳米花上。
49.本实施例中，待检测的靶标dna序列如seq id no.7所示：
50.gagtaagaagactcctgcta
51.根据靶标dna设计的靶标dna识别位点的序列如seq id no.8所示：
52.uagcaggagucuucuuacuc
53.所述骨架序列如seq id no.3所示：
54.uaauuucuacuaaguguagau
55.所述用于结合dna纳米器件的序列如seq id no.4所示。
56.gguucaguuaguuaauuuuu
57.信号转换元件为环状报告基团。环状报告基团序列由线状dna通过退火、连接反应形成。该线性dna链中的一部分通过序列杂交有效负载在dna纳米上；另一部分中间修饰了荧光基团和猝灭基团，荧光基团和猝灭基团间隔5nt，其序列为ttatt。环状报告基团用于响应cas12a反式切割活性，产生荧光信号。
58.所述环状报告基团的序列如seq id no.5所示：
59.p-tgatt(fam)tatt(bhq-1)acgtaaatcagtcatcgagac
60.参见图1，为本发明提供的一体化crispr-dna纳米器件在活细胞线粒体dna单碱基突变成像中的原理图，图中展示了一体化crispr-dna纳米器件的合成过程，可以看出，一体化crispr-dna纳米器件集成多个模块，通过dna纳米花介导的内吞作用、适体靶向细胞器一体化进入活细胞线粒体中，识别线粒体dna单碱基突变后释放荧光。
61.本实施例的一体化crispr-dna纳米器件的制备方法如下：
62.步骤1，分别合成dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件；
63.(1)dna-mg
2+
杂化纳米花(dna纳米花，dnf)的制备与表征
64.dna-mg
2+
杂化纳米花通过滚环扩增制备。具体而言，首先将5'磷酸化模板一(编码sgc8适体和cas12a/crrna复合物的结合位点)和模板二(编码细胞色素c适体(cyt c apt)和环状报告基团(clr)的结合位点)与引物1(序列如seq id no.9所示)和引物2(序列如seq id no.10所示)在1
×
t4 dna连接酶缓冲液中退火以形成整合的rca模板，然后通过t4dna连接酶环化。rca反应在40μl混合物中进行，其中包含20μl连接产物、4μl 10
×
phi 29dna聚合酶缓冲液、5μl 10mm dntp、1μl 10u/μl phi 29dna聚合酶和10μl depc处理水。将反应混合物在37℃孵育2小时，并在65℃变性10分钟。通过12,000rpm离心20分钟收集沉淀物，并在用depc处理水洗涤两次后，用适量的depc处理水重新溶解。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析dnf的合成过程。用zetasizer(malvern)测量dnf的zeta电位和粒径。扫描电子显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)用于分析dnf的形貌。
65.(2)制备环状报告基团(clr)
66.为了制备clr，首先将带有荧光猝灭剂标记的单链dna(ssdna)溶解在适当浓度的t4 dna连接酶缓冲液中，然后在95℃加热5分钟，然后缓慢冷却至25℃，形成带有切口的哑铃形结构，然后将其与t4 dna连接酶在25℃下孵育12小时以形成clr。最后，将溶液在75℃下孵育10分钟以使连接酶变性。通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀提取dna样品。dna浓度在使用前由nanodrop2000测定。
67.(3)分子识别元件的制备
68.cas12a和crrna在neb缓冲液2.1中以1:1.5的摩尔比混合并室温孵育10分钟形成cas12a/crrnarnp复合物。
69.步骤2，将步骤1制备的dnf和clr在pbs中以1:20的摩尔比混合。在室温下孵育1小时后，通过12,000rpm离心20分钟去除未结合的clr。将dnf/clr与cas12a/crrna以1:1的摩尔比在室温孵育30分钟以形成一体化crispr-dna纳米器件(incasor)。通过zetasizer分析
incasor探针的粒径和zeta电位。然后，使用sem和tem成像研究incasor的形貌和元素组成。
70.参见图2，为incasor的制备及表征结果图。图2a为1％琼脂糖凝胶电泳表征incasor的自组装过程。图2b是incasor的粒径电位表征结果。图2c是扫描电镜和透射电镜分析incasor的形貌特征。由这些结果可知，clr和cas12a/crrna复合物成功负载到dna纳米花上，incasor呈均匀的球形，粒径约为300nm，电位约为-25mv。
71.实施例2 crrna改造的一体化crispr-dna纳米器件
72.本实施例的一体化crispr-dna纳米器件及其制备方法与实施例1基本相同，区别在于对crrna的序列进行改造。五种一体化crispr-dna纳米器件的crrna序列如下：
73.序列的改造方式如图4b所示，具体的：
74.crrna0(seq id no.11):
75.gguucaguuaguuaauuuuuuaauuucuacuaaguguagauuagcaggagucuucuuacuc
76.crrna1(seq id no.12):
77.gguucaguuaguuaauuuuuuaauuucuacuaaguguagauuagcaggagacuucuuacuc
78.crrna2(seq id no.13):
79.gguucaguuaguuaauuuuuuaauuucuacuaaguguagauuagcaggagaguucuuacuc
80.crrna3(seq id no.14):
81.gguucaguuaguuaauuuuuuaauuucuacuaaguguagauuagcaggagagaucuuacuc
82.crrna4(seq id no.15):
83.gguucaguuaguuaauuuuuuaauuucuacuaaguguagauuagcaggagagaacuuacuc
84.上述crrna制备得到的一体化crispr-dna纳米器件依次命名为incasor
nd5-mt-0
、incasor
nd5-mt-1
、incasor
nd5-mt-2
、incasor
nd5-mt-3
和incasor
nd5-mt-4
。
85.实施例2活细胞的线粒体dna单碱基突变的活体成像方法本实施例包括如下步骤：
86.步骤一，将50nm实施例1的一体化crispr-dna纳米器件与活细胞于37℃孵育6小时；
87.步骤二，使用hoechst标记步骤一中细胞的细胞核，在激光共聚焦下观察荧光信号的强度及胞内分布。
88.实施例3动物活体的线粒体dna单碱基突变的活体成像方法本实施例包括如下步骤：
89.步骤一，将实施例1的一体化crispr-dna纳米器件通过尾静脉注射导入荷瘤小鼠体内；
90.步骤二，通过小动物活体成像系统观察注射incasor后荷瘤小鼠的荧光信号，实现对线粒体dna单碱基突变精准成像。
91.下面通过实验对本发明的有益效果作进一步说明。
92.实验例1一体化crispr-dna纳米器件的内吞作用及线粒体靶向过程
93.一、实验方法
94.采用实施例1中的步骤制备incasor探针，其中分别使用fam-ssdna，cy5-nhs标记incasor，cas12a及crrna用于可视化其在胞内分布。
95.为了分析sgc8适体对增强incasor内吞作用的影响，将带有(fam-incasor
sgc8+
)或不带有(fam-incasor
sgc8-)sgc8适体(序列如seq id no.16所示)的fam标记的50nm incasor
探针与hepg2细胞在37℃下孵育4小时。用hoechst 33342染色并用pbs洗涤3次后，使用共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。并使用bd facsverse
tm
accuri c6系统收集细胞用于流式细胞术分析。数据由flow jo分析。
96.为了分析incasor中带有(incasor
cyt c apt+
)或不带有(incasor
cyt c apt-)cyt c适体(序列如seq id no.17、seq id no.18所示)对线粒体靶向的影响，在细胞用50nm incasor-fam处理6小时后，使用50nm mito-tracker red标记细胞的线粒体。使用hoechst 33342标记细胞核后使共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。
97.二、实验结果
98.如图3所示，图3a为用50nm fam-incasor
sgc8+
或fam-incasor
sgc8-孵育的hepg2细胞的共聚焦成像和流式细胞术分析。比例尺：10μm。图3b为用50nm incasor
cyt c apt+
或incasor
cyt c apt-处理后incasor在hepg2细胞中的亚细胞定位的共聚焦成像。incasor用fam(绿色)标记，线粒体用mito-tracker(红色)染色。比例尺：10μm。可以看出，hepg2细胞与含有适体的一体化crispr-dna纳米器件孵育后的共聚焦成像显示良好效果，而不带有sgc8适体或不带有cyt c适体的incasor与实验组相比产生较弱的细胞内吞及线粒体靶向效果。
99.本实验例证明本发明构建的、纳米器件可以被细胞摄取并靶向到线粒体，流式细胞术分析及与线粒体标记的共定位分析结果呈现一致性，结果良好。
100.实验例2改造crrna提高incasor对突变型mtdna单碱基突变的检测能力
101.一、实验方法
102.(1)根据测序结果按照实施例2的方式设计改造crrna，使用t7转录试剂盒通过体外转录合成crrna，并使用trizol纯化。
103.(2)用(1)所得到的crrna，参照实施例1的步骤制备incasor探针。
104.(3)将25μl 1μm incasor、5μl 5μm dsdna和10μl 10
×
neb缓冲液2.1和70μl depc处理水混合。在37℃孵育30分钟后，测量每种反应混合物的荧光(λex：488nm；λem：520nm)。
105.(4)使用1％琼脂糖凝胶电泳分析(1)所得到的反应产物。
106.二、实验结果
107.如图4所示，图4a为hepg2和mda-mb-231细胞中13105位mtdna的测序结果。mda-mb-231细胞在nd5基因中具有mt13105 a》g突变。图4b为其中靶标dna识别位点通过在单碱基突变位点附近插入一个碱基、两个错配、三个错配、四个错配来提高其单碱基识别特异性。图4c为incasor探针在与野生型(wt)或突变型(mt)dsdna孵育后的琼脂糖凝胶电泳分析。
108.结果表明，通过插入1-2个错配的方式改造crrna，能够显著提高其对单碱基突变的识别能力。
109.实验例3一体化crispr-dna纳米器件检测活细胞(mda-mb-231)中的单碱基突变的线粒体dna
110.一、实验方法
111.使用实施例2中的crrna，参照实施例1的步骤制备incasor探针。将mda-mb-231细胞过夜培养。然后将其与50nm incasor在37℃孵育6小时。mito-tracker red和hoechst 33342分别用于标记线粒体和细胞核。细胞在激光共聚焦显微镜上进行成像，并通过流式细胞仪分析上述细胞样品的荧光强度。
112.二、实验结果
113.如图5所示，图5a为用具有不同crrna的incasor探针处理的hepg2细胞(wt)和mda-mb-231细胞(mt)的共聚焦成像。比例尺：10μm。图5b为对应的流式细胞术分析结果。未改造的incasor
nd5-mt-0
在野生型和突变型细胞中均产生绿色荧光，而改造crrna1的incasor
nd5-mt-1
仅在含有mt-mito的mda-mb 231细胞中显示出绿色荧光信号。
114.结果证明crrna改造使得incasor能够在突变型细胞中识别非pam序列单碱基突变。
115.实验例4使用incasor成像异质性细胞中mtdna中nd5基因的mt13105 a》g突变
116.一、实验方法
117.使用实施例2中的crrna，参照实施例1的步骤制备incasor探针。
118.为了制备具有异源mtdna的细胞系，从mda-mb-231细胞中分离出具有突变mtdna的线粒体(mt-mito)并转移到hepg2细胞中。首先，离心(200g,5分钟)收集用胰蛋白酶溶液消化后的mda-mb-231细胞。细胞计数后，将1-2.5ml线粒体分离试剂加入到20-50百万个细胞中，轻轻悬浮并置于冰浴中10-15分钟。在低温组织匀浆器中充分研磨后，将细胞在4℃以1000g离心10分钟。小心地将上清液转移到另一个离心管中，4℃3500g离心10分钟收集分离的线粒体。ripa裂解液用于收集线粒体蛋白，bca蛋白定量试剂盒用于线粒体定量。
119.分离的mt-mito用cellmask
tm
green预染色。受体细胞(hepg2)中具有野生型mtdna的线粒体(wt-mito)被mito-tracker red标记。弃去hepg2细胞原培养基，pbs洗涤后，在细胞板底附近缓慢加入线粒体悬液，再加入200μl dmem/fbs(5％)。37℃孵育过夜后，用pbs冲洗细胞，用50nm incasor探针在37℃孵育6h，然后进行共聚焦成像。
120.二、实验步骤
121.如图6所示，图6a为异质细胞构建示意图。图6b为共聚焦分析incasor
nd5-mt-0
和incasor
nd5-mt-1
成像活异质性细胞中mtdna突变(mt13105 a》g)成像的可行性。图6c为对图6b中具有绿色或红色荧光的紫色信号的共定位分析。
122.结果证明，incasor成功实现对异质性活细胞中突变型线粒体dna精准成像。
123.实验例5使用incasor检测小鼠体内携带突变型线粒体dna的肿瘤细胞
124.一、实验方法
125.使用实施例2中的crrna，参照实施例1的步骤制备incasor探针。
126.为了构建hepg2细胞和mda-mb-231细胞双侧瘤小鼠模型，我们将hepg2细胞皮下注射到雌性裸鼠的左前肢，mda-mb-231细胞皮下注射到右前肢。植入14天后，分别向小鼠尾静脉注射1nmole、200μl不同crrna的incasor。在1、2、4和6小时使用bruker in-vivo xtreme获得全身图像。然后，用二氧化碳对小鼠实施安乐死，取出器官(肿瘤、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏)，并使用bruker in-vivo xtreme对cy5信号进行离体成像。切片使用激光共聚焦显微镜成像。
127.二、实验结果
128.如图7所示，图7a为将incasor
nd5-mt-0
或incasor
nd5-mt-1
尾静脉注射到双侧瘤小鼠模型(左侧带有hepg2肿瘤(wt)，右侧带有mda-mb-231肿瘤(mt))检测体内mt13105 a》g突变的示意图。图7b为不同时间点双侧瘤小鼠模型中荧光分布图像。图7c为解剖的肿瘤组织和肿瘤组织切片的代表性图像。切片的长度和宽度均为2000μm。图7d为静脉注射incasor 8小时后从小鼠解剖肝组织的图像，具有明显的白色结节和荧光信号。图7e为对应肝组织切片的
苏木精和伊红(he)和免疫组织化学染色。免疫组织化学染色的肝组织切片显示在右侧。绿色、红色和蓝色分别对应于来自arginase-1蛋白，dapi和incasor
nd5-mt-1
的cy5报告基团。白色虚线将肿瘤病变(t)与正常组织分开。比例尺对应于2000μm(0.8
×
图像)和200μm(5
×
图像)。
129.结果表明incasor可用于通过在小鼠体内观察具有突变mtdna的细胞来对肿瘤组织及其转移灶进行成像。
130.通过上述实施例和实验例可以看到，本发明集成多个模块，构建了一种一体化crispr-dna纳米器件，该器件应用于活体成像线粒体dna单碱基突变，兼具灵敏检测和信号放大的能力，具有单碱基分辨的识别能力，实现活体线粒体dna单碱基突变精准成像，反应mtdna异质性相关的空间信息，在相关领域的检测中具有很好的应用前景。

技术特征：
1.一种一体化crispr-dna纳米器件，其特征在于：它包括dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件；所述dna纳米器件用于介导细胞内吞和靶向线粒体；所述分子识别元件为crispr系统，包含cas12a蛋白和crrna，所述crrna包括靶标dna识别位点、骨架序列和用于结合dna纳米器件的序列；所述信号转换元件为环状报告基团，所述环状报告基团由修饰有荧光基团和猝灭基团的dna序列构成。2.按照权利要求1所述的一体化crispr-dna纳米器件，其特征在于：所述dna纳米器件包括sgc8适体和细胞色素c适体。3.按照权利要求2所述的一体化crispr-dna纳米器件，其特征在于：所述dna纳米器件是通过滚环扩增反应合成的dna纳米花，所述dna纳米花的模板序列包括模板一和模板二，所述模板一包括sgc8适体和用于杂交分子识别元件的结合位点，所述模板二包括细胞色素c适体和用于杂交信号转换元件的结合位点；所述模板一的序列如seq id no.1所示，所述模板二的序列如seq id no.2所示。4.按照权利要求1所述的一体化crispr-dna纳米器件，其特征在于：所述靶标dna识别位点的序列根据待检测靶标dna进行设计；所述靶标dna识别位点中，在待检测靶标dna的单碱基突变位点3端插入1-2个碱基错配。5.按照权利要求1所述的一体化crispr-dna纳米器件，其特征在于：所述骨架序列如seq id no.3所示，所述用于结合dna纳米器件的序列如seq id no.4所示。6.按照权利要求1所述的一体化crispr-dna纳米器件，其特征在于：所述环状报告基团的序列如seq id no.5所示。7.按照权利要求1所述的一体化crispr-dna纳米器件，其特征在于：它由dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件按照摩尔比(1:1:10～20)结合而成。8.按照权利要求1-7任一项所述的一体化crispr-dna纳米器件，其特征在于：所述分子识别元件和信号转换元件分别通过互补杂交装载在dna纳米器件上。9.权利要求1-8任一项所述一体化crispr-dna纳米器件的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，分别合成dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件；步骤2，将所述dna纳米器件、分子识别元件和信号转换元件混合孵育，通过互补杂交分别将分子识别元件和信号转换元件装载在dna纳米器件上。10.利用权利要求1-8任一项所述一体化crispr-dna纳米器件对线粒体dna单碱基突变进行活体成像的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a，将所述一体化crispr-dna纳米器件与待检测生物样本混合，或将所述一体化crispr-dna纳米器件注射至待检测生物体内；步骤b，对所述待检测生物样本或待检测生物体进行荧光信号检测，实现活体成像。

技术总结
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种一体化CRISPR-DNA纳米器件及线粒体DNA单碱基突变活体的成像方法。该一体化CRISPR-DNA纳米器件包括DNA纳米器件、分子识别元件和信号转换元件；所述DNA纳米器件用于介导细胞内吞和靶向线粒体，所述分子识别元件为CRISPR系统，所述信号转换元件为环状报告基团。其应用于活体成像线粒体DNA单碱基突变，兼具灵敏检测和信号放大的能力，具有单碱基分辨的识别能力，实现活体线粒体DNA单碱基突变精准成像，反应mtDNA异质性相关的空间信息，在相关领域的检测中具有很好的应用前景。检测中具有很好的应用前景。检测中具有很好的应用前景。


技术研发人员：张开翔 李亚楠 黄迪 史进进 刘军杰 张振中 李景虹
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：2022.08.30
技术公布日：2023/8/9