高产辅酶Q

高产辅酶q
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的类球红细菌菌株的建立及其应用
技术领域
1.本发明涉及代谢工程领域；关于高产辅酶q
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的类球红细菌菌株的建立及其应用；更具体地，本发明关于一种基于全局调控因子prra定向进化和高通量筛选方法开发提高辅酶q
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产量的方法。


背景技术：

2.辅酶q
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是一种脂溶性醌类化合物，广泛存在于细胞膜上，参与呼吸链的组成、电子传递和能量代谢，是细胞代谢的激活剂。还原型辅酶q
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能有效清除自由基、预防心血管疾病以及辅助治疗他汀类药物引发的副作用，在功能性食品、化妆品即医药领域应用广泛。因此，随着对辅酶q
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需求的不断增加更突出了其产量提高的重要性。
3.类球红细菌是辅酶q
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的主要生产菌，同时也是研究细菌光合作用的模式菌株；因此，其胞内存在多种代谢模式，既可以通过有氧呼吸获取物质及能量，又能维持无氧条件下的生存，正是这种复杂的代谢调控，对于菌株工程提高辅酶改造q
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产量提出了诸多挑战。
4.通常，菌株工程改造策略可以分为两类：一是通过紫外或化学诱变剂等处理，引起的非特异性基因突变的“非理性”方法；二是利用代谢工程调控已知的物合成途径的“理性”方法。相比于“非理性”策略的费时费力，理性代谢工程改造能有效提升微生物生产性能，也是目前研究的通用方法。类球红细菌早期的理性改造主要聚焦在辅酶q
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的生物合成途径。通过前体物质的添加、合成途径限速酶过表达、竞争分支途径抑制或敲除以及辅因子供应和能量再平衡等策略，实现辅酶q
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的高产。
5.遗憾的是，上述这些改造策略以及本领域现有的其它一些策略并不稳定，在一些类球红细菌中(例如hy01)中的效果并不显著。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供高产辅酶q
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的类球红细菌菌株构建方法及其应用。
7.在本发明的第一方面，提供一种建立或筛选高产辅酶q
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的类球红细菌的方法，包括：(1)靶向改造类球红细菌中的全局调控因子prra；(2)培养(1)的类球红细菌，分离出叶绿素含量显著高(高于prra未改造的对照)的菌，从中获得高产辅酶q
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的类球红细菌。
8.在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述改造包括：对全局调控因子prra进行随机突变。
9.在一种或多种优选实施方式中，所述的突变通过位点特异性重组引入到类球红细菌；
10.在一种或多种优选实施方式中，所述的对全局调控因子prra进行随机突变是高通量的，形成随机突变文库；
11.在一种或多种优选实施方式中，所述的类球红细菌为类球红细菌hy01。
12.在一种或多种优选实施方式中，全局调控因子prra随机突变后的突变序列引入到类球红细菌的基因组中、替换原prra基因；较佳地，通过在类球红细菌基因组的原prra基因
位置引入attb位点、实现所述替换；更佳地，利用自杀质粒(如pk18mobsacb)引入attb位点。
13.在一种或多种优选实施方式中，利用含有整合酶int和接合转移位点orit的质粒(如以puc57作为质粒骨架)，将prra突变序列(文库)插入类球红细菌基因组attb位点；更佳地，后续通过cre酶剪除所述质粒。
14.在一种或多种优选实施方式中，含有突变序列的构建体或质粒上存在attp位点，在接合转移后，其与attb共同作用，从而可实现突变序列(作为外源基因)的定点引入。
15.在一种或多种优选实施方式中，(2)中，通过选自下组的方法来分离出叶绿素含量显著高的菌：(a)观测类球红细菌或其菌落的颜色；(b)测定类球红细菌的叶绿素的含量；(c)测定类球红细菌培养物的od值；较佳地所述od值为700nm。
16.在一种或多种优选实施方式中，所述方法还包括设置对照组，所述对照组是在步骤(1)中未进行全局调控因子prra改造的类球红细菌。
17.在一种或多种优选实施方式中，(a)中，若是全局调控因子prra改造的类球红细菌的菌落颜色为绿色，则其为(或潜在地为)高产辅酶q
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的类球红细菌；较佳地，绿色的颜色越深则产量越高；更佳地所述绿色为墨绿色；(b)中，若是全局调控因子prra改造的类球红细菌的叶绿素的含量在统计学上高于对照，则其为(或潜在地为)高产辅酶q
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的类球红细菌；或，(c)中，若是全局调控因子prra改造的类球红细菌培养物的od值在统计学上高于对照，则其为(或潜在地为)高产辅酶q
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的类球红细菌。
18.在一种或多种优选实施方式中，在获得(1)的类球红细菌后，首先进行(a)，分离获得颜色为绿色的类球红细菌；之后，对于筛选获得的绿色的类球红细菌，进行(b)和/或(c)。
19.在一种或多种优选实施方式中，将菌株涂布于平板上，以观测类球红细菌或其菌落的颜色。
20.在一种或多种实施方式中，通过颜色观测筛选获得的类球红细菌培养于深孔板中。
21.在本发明的另一方面，提供前面任一所述方法的应用，用于建立或筛选高产辅酶q
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的类球红细菌。
22.在一种或多种优选实施方式中，所述的类球红细菌为类球红细菌hy01。
23.在本发明的另一方面，提供一种生物发酵生产辅酶q
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的方法，所述方法包括：(a)以前面任一所述的方法建立高产辅酶q
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的类球红细菌；(b)将(a)的类球红细菌进行发酵，生产辅酶q
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。
24.在本发明的另一方面，提供一种用于建立或筛选高产辅酶q
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的类球红细菌的试剂盒，其中包括：靶向改造类球红细菌中的全局调控因子prra的工具，叶绿素分析工具；较佳地，还包括建立突变体文库的工具。
25.在一种或多种优选实施方式中，所述靶向改造类球红细菌中的全局调控因子prra的工具包括(但不限于)：对全局调控因子prra进行随机突变的材料，以及将所述随机突变引入到类球红细菌基因组的材料；更佳地包括：(i)在类球红细菌基因组的原prra基因位置引入attb位点的材料、如自杀质粒pk18mobsacb，或(ii)将prra突变序列(文库)插入到类球红细菌基因组attb位点的材料、如含有整合酶int和接合转移位点orit的puc57质粒。
26.在一种或多种优选实施方式中，所述叶绿素分析工具包括(但不限于)：培养平板(能培养菌株并观测细胞的颜色)，分光光度计，酶标仪。
27.在本发明的另一方面，提供一种制备高产辅酶q
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的类球红细菌的方法，所述方法包括：以类球红细菌为出发菌株，对其基因组中全局调控因子prra进行突变，将其第24位突变为丝氨酸(ser)；较佳地，所述高产辅酶q
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的类球红细菌与出发菌株相比，产量提升30％以上。
28.在本发明的另一方面，提供一种高产辅酶q
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的类球红细菌，其基因组中全局调控因子prra的第24位突变为丝氨酸(ser)；较佳地，所述高产辅酶q
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的类球红细菌与出发菌株相比，产量提升30％以上。
29.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
30.图1为参与光合基因簇表达调控基因的敲除对辅酶q
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产量的影响。
31.图2为突变文库载体设计及整合酶介导的重组示意图。
32.图3为hy01δprra菌株的质粒设计及δprra菌株的验证。
33.图4为突变库设计、构建及筛选流程示意图。
34.图5为叶绿素含量与辅酶q
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产量之间的线性相关性。
35.图6为深孔板发酵检测结果。
36.图7为prra突变菌株高通量筛选。
具体实施方式
37.本发明人在深入的研究分析后，揭示了一种新的提高类球红细菌的辅酶q
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产量的调控靶点。围绕这一新型靶点，配合适当的代谢工程改造策略以及高通量筛选方法，通过全局调控因子prra定向进化结合高通量筛选技术开发，实现了辅酶q
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高产菌株的获得。
38.术语
39.如本发明所用，术语“位点特异性重组”是一类依赖于小范围同源序列联会的同源重组方式，需要借助整合酶(如phic31)与特异性重组位点(如attb/attp)的参与，最终将外源质粒整合至基因组中。
40.如本发明所用，术语“引入”或“转化”是指将外源多核苷酸转移进宿主细胞(本发明中为类球红细菌)。可选地，外源多核苷酸可以整合进入宿主基因组。
41.如本发明所用，“外源的”或“异源的”基因或蛋白是指并非天然包含在原生物体(本发明中为类球红细菌)基因组中的基因或蛋白，例如可以是突变的蛋白。通常，“外源的”基因或蛋白通过基因工程重组技术被引入到生物体中。
42.高产菌株筛选方法
43.对代谢途径中关键基因的转录水平进行调控是代谢工程常用策略，但该策略往往无法明显提高目标产物的产量或提高作用不明显，甚至导致工程菌株胞内碳/氮代谢网络和辅因子网络的失衡。全局转录调控工程通过采用具有特定功能的转录因子来激活或抑制特定代谢途径中多个基因的协同表达，适当的此类因子的作用潜在地可提高目标代谢物的合成。全局转录调控工程通过修饰转录因子，对代谢途径相关的基因和代谢网络重编程，在全基因组范围调控基因的转录水平。然而，鉴于细胞内代谢通路众多、且代谢网络极其复
杂，确定到恰到好处地调控一系列特定代谢过程、但不至于影响到/威胁到其它一些不希望被调控的通路正常运行的全局调控因子是本领域的瓶颈。
44.通过转录组数据分析，本发明人发现类球红细菌高产辅酶q
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与光合基因簇的表达存在某种联系；进一步分析研究提示，参与光合基因簇调控的组分主要包括阻遏/去阻遏蛋白ppsr/appa、双组份调控系统prrb/prra、全局调控蛋白fnrl、crpk以及mppg等可能潜在地与之相关。这些调控元件通过感知外界氧浓度、光照和胞内氧化还原状态等共同作用于光合基因簇的表达。除了直接参与光合成相关操纵子的表达，双组份调控系统prrb/prra同时还调控四吡咯化合物合成、胞内铁稳态以及能量代谢相关基因。prra作为全局调控因子，能同时作为激活或抑制因子发挥功能，参与胞内上百个基因的表达调控。其中光合基因簇表达调控的信号通路研究最为详细。当氧浓度较低时，流经cbb3氧化酶的氧化还原信号强度减弱，膜蛋白prrb作为激酶感知cbb3氧化还原信号的改变，其组氨酸残基将发生自磷酸化作用，并将其携带的磷酸基团传递给调控蛋白prra，磷酸化的prra与dna紧密结合，参与光合基因的转录激活；而在高氧分压下，流经cbb3氧化酶的氧化还原信号强度大，此时cbb3氧化酶产生强烈的抑制信号并传递至prrb/prra双组份系统，抑制光合基因转录。然而，目前类球红细菌中，通过转录因子工程改造提高辅酶q
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产量的研究还未曾报道。本发明首次通过深入的组学数据分析结合实验分析，确定了prra为参与辅酶q
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调控的相关转录因子，结合转录因子工程改造促进辅酶q
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产量的提升。
45.通常转录因子工程改造利用定向进化随即引入大量突变，按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质。考虑到突变菌选育过程繁琐复杂，亟需开发一种简单快速的高通量筛选技术。本发明人前期的研究发现，发酵过程中工业类球红细菌会自发突变产生一种表型为白色的突变株，光谱扫描发现，该突变株不产生光合色素，其光合成相关基因沉默，且仅少量辅酶q
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积累；而高产辅酶q
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的工业菌(如hy01)表型呈绿色的高产突变株，这一颜色表型正是光合基因被激活，引发细菌叶绿素等光合色素表达的结果。由此，推断光合成系统与辅酶q
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积累可能存在某种未知的联系；进而对不同发酵样品中的辅酶q
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产量和叶绿素含量进行测定，分析发现辅酶q
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与叶绿素含量之前存在正相关，线性相关系数高达0.97。基于此，本发明尝试建立高通量检测体系，用于工程改造后的菌株筛选，以加速高产菌株获取，提升辅酶q
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的生产能力，降低企业生产成本。
46.基于本发明人的上述新发现，本发明中首次披露了prra与辅酶q
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合成具有相关性，靶向改造类球红细菌中的prra，例如通过构建prra突变体库，从中可以筛选获得辅酶q
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的高产菌株。
47.靶向改造类球红细菌中的prra的方式可以是多种多样的，只要能够实现使得prra的表达、活性、修饰或与其它因子的相互作用等形成一定的变化，这种变化使得prra所参与的与辅酶q
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的生产相关的通路也可能发生变化，基于此筛选获得辅酶q
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的产量得以提升的目标菌株(具有优良性状的类球红细菌)。
48.作为本发明的优选方式，所述的靶向改造基于位点特异性重组，对全局调控因子prra进行随机突变。所述的随机突变优选地以高通量的方式进行从而提高筛选的效率。优选地，通过制备随机突变文库，将随机突变引入到类球红细菌基因组中原prra的位置(替换原prra基因)来实施这种改造。
49.作为本发明的优选方式，通过在类球红细菌基因组的原prra基因位置引入attb位
点、实现所述替换；更优选地，利用自杀质粒(如pk18mobsacb)引入attb位点。与之相适应地，含有突变序列(作为外源基因)的构建体或质粒上存在attp位点，在接合转移后，其与attb共同作用，从而可实现突变序列的定点引入。
50.作为本发明的优选方式，利用含有整合酶int和接合转移位点orit的质粒(如以puc57作为质粒骨架)，将prra突变序列(文库)插入类球红细菌基因组attb位点；优选地，后续通过cre酶剪除所述质粒。
51.作为本发明的具体实施例，为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
52.第一步：制备全局调控因子prra突变序列；
53.第二步：设计并构建用于基因组整合的含全局调控因子prra突变序列的质粒文库，并在转化大肠杆菌(如但不限于s17-1)；
54.第三步：将第二步构建得到的突变文库接合转移导入受体菌类球红细菌中进行整合，得到含有不同prra突变位点的菌株；
55.第四步：对第三步得到的含不同prra突变的单克隆进行深孔板发酵，并通过对胞内叶绿素含量测定，筛选高产菌株。
56.在优选的实施方式中，prra突变序列制备主要利用易错pcr试剂盒，以类球红细菌基因组为模板，在扩增过程中随机引入突变序列。
57.在优选的实施方式中，突变文库构建则是通过重组酶将第一步制备好的序列克隆至质粒载体，用于后续接合转移。
58.在优选的实施方式中，接合转移则是在大肠杆菌的辅助下，将上述第二步构建的质粒导入类球红细菌中，并利用质粒中的整合元件构建到类球红细菌基因组。
59.在优选的实施方式中，深孔板发酵是指将接合转移后的单克隆接种在发酵培养基中，于48孔深孔板、32℃、220rpm培养36h。
60.应理解的是，本发明的带有prra突变位点的菌株的发酵或培养的方式并不仅限于深孔板发酵。但是，深孔板当应用于高通量筛选时，是较为优选的，所述的深孔板可以为24孔、48孔或96孔深孔板等适用于分光光度计/酶标仪批量检测的深孔板。所述深孔板可以是方底的或圆底的，优选其底部是透性的。
61.在本发明的优选实施方式中，为了观测菌株的颜色(例如观测是否为绿色菌株)，将经改造的菌株进行平板涂布，经由一定的时间的生长后进行观测。
62.此外，还可用hplc检验高产菌株的产物产量/效价，从而确定高产菌株。实现从菌株培养到产物检测的完整高通量筛选平台。但是用hplc进行效价检测时只能将样品一个一个依次检测，耗时长，达不到高通量检测的目的，其适用于后期的筛选。例如，可在经由平板筛选、酶标仪筛选之后，进一步地利用hplc来验证。hplc是可选的程序，而本发明的整体方案中，仅需平板筛选或酶标仪筛选，即可确定高产辅酶q
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的类球红细菌。
63.可以理解的是，当观测到感兴趣的目标菌株后，还可以进行一次或多次的复筛。
64.可选地，还可通过遗传稳定性实验来进行进一步的验证。优选地，可以挑取经筛选出来的高产突变菌株进行传代培养，连续传一代或多代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，测定产物产量，从而判断遗传稳定特性。
65.高产辅酶q
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的类球红细菌
66.本发明还提供了一系列基于本发明的方法所获得的高产辅酶q
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的类球红细菌。本
发明的方法可以高效地获得一类高产辅酶q
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的类球红细菌，这些菌株可以形成一个菌体库，从中确定最适用于实验生产、工业生产辅酶q
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的经改造的类球红细菌。
67.作为本发明的优选方式，提供一种具体的高产辅酶q
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的类球红细菌，其基因组中全局调控因子prra的第24位突变为丝氨酸(ser)；所述高产辅酶q
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的类球红细菌与出发菌株相比，产量提升30％以上。
68.通过本发明的改造获得高产菌株，还可以进行进一步改良而获得目标产物产量更高或酶系更为优化的衍生菌株，或者还可表达其他重组蛋白。所获得的工程菌株还可以进一步建立无筛选标记的基因操作。
69.更进一步的，本发明的菌株可以作为进一步优化衍生菌株或者其他重组蛋白的工程菌株的基础，构建无标记筛选系统后，可作为分子操作的对象，可以敲入和敲除基因等遗传操作，进行有目的性的遗传改造。
70.本发明的改造菌株是活体细胞，一旦获得了本发明的菌株，就可以用接种传代、再生等手段来大批量地获得该菌株。这通常是将其接种到固体平板培养基或液体培养基中进行菌株的扩大培养而获得本发明的活体细胞。而获得的活体细胞可进一步进行实验室驯化、遗传育种和分子遗传操作等来获得突变体和转化子。也可利用本发明作为异源表达的宿主细胞。
71.本领域的技术人员熟知的方法能用于进一步改造/诱变本发明的活体细胞，使得活体细胞的基因编码改变、酶活特性和形态学上的改变。
72.应用于培养本发明的菌株的培养基和培养方法并不限于本发明实施例中公布的那些，其它常规应用于培养类球红细菌的培养基和培养方法也可以应用于本发明中。
73.如上所述发酵体系可以进行体系放大进行工业生产，根据体系的大小不同，本领域技术人员根据所掌握的一般知识可以进行适当的调整以有利于菌株的生长或生产。
74.本发明的有益技术效果主要包括：
75.首次提出一种新的提高类球红细菌的辅酶q
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产量的调控靶点。围绕这一新型靶点，配合适当的代谢工程改造策略以及高通量筛选方法，通过全局调控因子prra定向进化结合高通量筛选技术开发，可实现辅酶q
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高产菌株的获得。
76.相比于代谢工程的理性设计，转录因子工程改造充分利用原核生物调控网络的特点，通过微小的基因扰动实现在全局水平对胞内代谢进行精细调控，从而协调胞内不同的生理代谢活动，提高目标产物产量，对于代谢改造相对困难的菌株更具优势。
77.传统的筛选过程具有一定的盲目性，容易漏筛，造成筛选效率低且费时费力费材。本发明所述的方法精准、高效、简便且高通量。本发明可低成本地增大筛选样本，降低筛选工作强度，提高筛选效率。
78.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所议的条件。
79.培养基配方
80.种子培养基：
81.0.8％酵母提取物，0.3％葡萄糖，0.2％nacl，0.13％kh2po4，0.0125％mgso4，1.5％
琼脂糖，另外需额外补充15mg/l生物素，1mg/l烟酸，1mg/l硫胺素，121℃灭菌20min。
82.发酵培养基：
83.4％葡萄糖，0.4％玉米浆粉，0.3％谷氨酸钠，0.3％(nh4)2so4，0.28％nacl，0.3％kh2po4，0.63％mgso4，0.2％caco3；另需额外添加1mg/l硫胺素，1mg/l烟酸，15μg/l生物素，121℃灭菌20min。
84.tsb培养基：
85.胰蛋白胨大豆牛肉膏(tryptone soya broth)30g/l。制好后于115℃灭菌20min。
86.本发明培养基中，卡那抗生素的终浓度为50μg/ml，萘啶酮酸的终浓度为7.5μg/ml。
87.实施例1、全局调控因子筛选
88.辅酶q
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是一种脂溶性醌类化合物，广泛存在于细胞膜上。作为呼吸链电子传递链中的重要组成部分，辅酶q
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能有效促进能量供给，是细胞代谢的激活剂，同时在胞内自由基的清除、心血管疾病的预防等领域发挥着重要作用。关于辅酶q
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的合成途径研究较为清晰，主要包括分支酸途径、甲羟戊酸途径和醌环修饰途径。
89.分枝酸途径以赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸为底物，经一系列酶催化，首先生成分支酸，进而在分支酸裂合酶ubic作用下合成辅酶q
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母核的前体物质对羟基苯甲酸，该步催化作用通常被认为是整个途径中的限速步骤。于此同时，分支酸还参与芳香氨基酸、叶酸等多种芳香族化合物的合成。甲羟戊酸途径则是以甘油醛三磷酸和丙酮酸为前体，合成前体二甲基丙烯基焦磷酸(dmapp)和异戊烯焦磷酸(ipp)。ipp和dmapp在法尼基焦磷酸合酶ispa和癸异戊二烯焦磷酸合酶(dps)的催化下一步步延伸，最终形成十聚异戊二烯侧链。由于ipp和dmapp是萜类如类胡萝卜素和叶绿素等合成的底物，所以这些萜类及其衍生物和辅酶q
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的合成回导致前体的竞争。最后，由醌环修饰途径中的对羟基苯甲酸异戊烯基转移酶(ubia)将对羟基苯甲酸和十聚异戊二烯焦磷酸进行缩合，再由一系列羟化酶和甲基化酶等作用得到终产物辅酶q
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。其中，对羟基苯甲酸异戊烯基转移酶ubia、甲基转移酶ubie和ubig是醌环修饰途径的关键酶。而且，辅酶q10合成过程还需要nahdh、nadh、atp和sam等多个辅因子的参与。遗憾的是，这些潜在的代谢改造位点在一些类球红细菌(例如hy01)中的效果并不显著。
90.本发明人的前期研究发现，发酵过程中工业类球红细菌(例如hy01)会自发突变产生一种表型为白色的突变株，经光谱扫描发现，该突变株不产生光合色素，其光合成相关基因沉默，且仅少量辅酶q
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积累；而高产辅酶q
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的工业菌表型呈绿色的高产突变株，这一颜色表型正是光合基因被激活，引发细菌叶绿素等光合色素表达的结果。由此，本发明人推断光合成系统与辅酶q
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积累可能存在某种未知的联系。类球红细菌菌落一般因含有大量的光合色素而呈红色或浅红色，也存在一些其他表型的突变株；这些光合色素随细胞生长而逐渐积累，具有良好的抗氧化能力，保护细胞免于氧化损伤。据报道，在发酵过程中限制氧供应，有利于类球红细菌积累辅酶q
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；而在低氧或无氧条件下，类球红细菌光合基因表达，生成光合色素，促进光合成系统的组装。本发明人分析认为，这表明光合成系统与辅酶q
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积累存在潜在的密切联系；而光合基因簇的表达与呼吸链电子传递链同样密切相关。
91.因此，本发明人首先调研了参与光合基因簇表达和电子传递链相关的调控因子，结合转录组数据分析，筛选了一系列可能的靶点，包括prrb/prra双组分系统、ppsr/appa阻
遏抗阻遏元件、全局调控蛋白fnrl、crpk以及mppg等。通过对上述调控组分进行敲除，发现prra与辅酶q
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合成最为相关，如图1。
92.实施例2、prra突变文库构建
93.全局调控因子prra突变文库的构建分为两部分：全局调控因子dna序列的随机突变和克隆载体puc-int-orit的设计构建。
94.(1)全局调控因子dna序列的随机突变
95.本发明利用易错pcr试剂盒(购自takara)，以类球红细菌hy01基因组dna为模板，prra-er-f/r为引物，通过pcr扩增prra序列，扩增过程中随机引入突变序列，目的片段大小596bp，并对扩增后的片段纯化回收。
96.表1、易错pcr引物
[0097][0098]
(2)克隆载体puc-int-orit的设计构建
[0099]
本发明构建的高产菌株用于辅酶q
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生产，为避免抗生素污染，本发明以puc57为质粒骨架，其中引入整合酶int和接合转移位点orit，利用整合系统将prra突变后的文库插入类球红细菌基因组上，质粒骨架后续可通过cre酶剪除，为后期辅酶q
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的生产提供了帮助，且避免因游离质粒拷贝数不稳定引发的产量波动的影响。其构建示意图如图2。线性质粒骨架可通过引物puc-int-orit-f/r扩增得到。
[0100]
(3)突变位点和碱基突变统计
[0101]
将上述得到的突变序列和线性质粒载体，按照一步克隆重组试剂盒提供的步骤在50℃进行连接，连接时间15min。将连接产物转化大肠杆菌s17-1，并涂布于添加有50μg/ml卡那抗生素的lb平板上进行筛选，挑取部分单克隆进行测序，并对突变位点和碱基突变个数进行统计。
[0102]
刮取平板上所有单克隆于1ml lb培养基中，加入等体积30％的甘油，冻存于-80冰箱；其中，一步克隆重组试剂盒购于近岸蛋白科技公司。
[0103]
(4)类球红细菌hy01-δprra::attb的构建
[0104]
以类球红细菌hy01的基因组dna为模板扩增prra基因的左右同源臂，prra基因左右同源臂的扩增引物如表2所示。用ecori/hindⅲ对pk18mobsacb自杀质粒(购自addgene)进行双酶切，并回收线性化的载体片段。
[0105]
以芽孢杆菌敲除质粒pk18mobsacb为骨架质粒，重组质粒pk18mobsacb-del prra的构建与步骤(3)相似，构建好的敲除质粒转化类球红细菌hy01，利用菌株自身重组系统敲除prra基因，与此同时引入attb位点，序列：gtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcg。其构建示意图及重组质粒鉴定如图3。
[0106]
表2
[0107][0108]
实施例3、prra突变文库转化及克隆筛选
[0109]
本实施例中，进行prra突变文库转化及克隆筛选，包括如下的步骤：
[0110]
(1)取冻存于-80℃冰箱的突变文库，按5％转接至5ml卡那抗性lb培养基中，培养至od
700
为0.4-0.5之间。在种子平板上培养类球红细菌hy01，挑取长至6-7天的类球红细菌hy01的单菌落，接种于无抗tsb培养基中，30℃、200rpm培养至od为0.8-1.0之间。
[0111]
(2)取2ml的上述含有上述突变文库的大肠杆菌s17-1培养液(供体菌)和1ml的类球红细菌hy01培养液(受体菌)，6000rpm离心3min，弃上清；分别重悬菌体于l ml tsb培养基，6000rpm离心3min，弃上清；再添加l ml tsb培养基重悬菌体；按照供/受体菌体积比1：3取重悬后的菌液并混匀，保持总体积400μl，混合后的菌液滴点在无抗种子平板上；32℃倒置培养20～24h，使其发生接合转移，使得重组质粒导入宿主菌中，进而通过整合酶介导的重组将突变序列整合在基因组上；待接合转移结束，将菌苔刮下，分别用1ml tsb培养基重悬；将得到的菌液稀释涂布至含有卡那和萘啶酮酸抗生素的种子固体培养基上；32℃静置培养平板5～7天，直至长出结合子。
[0112]
长出结合子后，平板上的单克隆呈现两种不同的表型：白色和绿色单克隆。根据本发明人分析得出的辅酶q
10
高产和光合基因簇表达之间的联系，后续直接排除白色单克隆，仅挑选绿色突变株进行深孔板发酵。分析及筛选过程的示意图如图4。
[0113]
实施例4、辅酶q
10
产量和叶绿素的相关性研究
[0114]
本发明人根据分析研究结合实验论证得出，类球红细菌绿色表型的突变株和辅酶q
10
高产存在相关性。为了对这一相关性进行进一步论证，本发明人对不同发酵样品中辅酶q
10
产量和叶绿素含量进行检测。
[0115]
叶绿素测定方法如下：
[0116]
取300μl菌液加入到含1ml水的48孔板，离心弃上清；加入三倍菌液体积的提取液(体积比，丙酮：甲醇＝7：2)，混匀后离心；待离心结束，用排枪吸取200μl上清液，转移至96孔酶标板中，测定样品770nm处的吸光值。根据以下公式计算出胞内细菌叶绿素浓度：
[0117][0118]
细菌叶绿素在770nm有最大吸收峰，其在770nm处的吸光度值与其浓度有线性相关关系，根据朗伯比尔定律，od
770
＝消光系数*光程*叶绿素浓度，细菌叶绿素消光系数为76mm-1
cm-1
，比色皿光程为1cm，则可以根据od770计算出细菌叶绿素摩尔浓度。
[0119]
分析发现，当叶绿素含量较高时，辅酶q
10
产量随之表现出相对较高水平；进一步对相关性进行拟合，发现线性相关系数高达0.97，如图5所示。
[0120]
这一结果为高通量检测方法的建立提供了依据，即通过批量测定菌株叶绿素含量间接表征辅酶q
10
产量。
[0121]
实施例5、prra突变菌株深孔板发酵及叶绿素含量检测
[0122]
从种子板板挑取生长6-7天的类球红细菌突变文库接合子，枪头在孔中快速晃动直到单克隆完全从枪头脱落即可，单克隆不需要打散，优先选择呈墨绿色的单克隆，接种于提前分装1200μl三级发酵液的48孔深孔板中，以32℃、200rpm发酵至48h，此时培养基中的碳源基本消耗殆尽。
[0123]
三级发酵液分装时，由于发酵液含碳酸钙等不溶物容易沉淀，建议使用排枪吸取，不时振荡摇匀；深孔板需轻拿轻放，避免引起交叉污染。
[0124]
1、发酵液od
700
测定
[0125]
待发酵结束，取100μl菌液加入48孔板中，为保减小样品误差，取样前需先用排枪混匀发酵液，后立即吸取100μl混匀后的菌液，加入50μl 0.5m盐酸，后加水定容至3ml，取200μl加入酶标板中，在波长700nm下测定od值。
[0126]
2、叶绿素测定
[0127]
测定方法同前述实施例4。
[0128]
3、辅酶q
10
测定
[0129]
对于叶绿素含量较高的菌株，进一步提hplc精确定量，取400μl菌液加入5ml棕色ep管中，加入10μl 6m盐酸，0.8ml丙酮，90μl过氧化氢，摇匀后加入2.7ml无水乙醇，0.22μm滤膜过滤后的样品即可用于hplc检测。
[0130]
(1)标准曲线制备
[0131]
称取0.004g标准品，置于10ml棕色容量瓶中，并加入无水乙醇至刻度线，超声溶解10min，溶解后浓度为0.4g/l，对半稀释至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125g/l(所有标准品均保存在棕色容量瓶中，室温下可以保存半个月，4℃保存可能导致样品析出，每次进样前都要重新进标准品)。
[0132]
(2)hplc定量分析
[0133]
流动相甲醇：乙醇＝65：35，波长275nm，柱温35℃，进样量20μl，流速1.5ml/min，柱压130bar，c18反相色谱柱(日本ymc，柱号102ha70078，4.6mm
×
150mm)。
[0134]
4、结果
[0135]
深孔板发酵结果如图6所示，分别测定突变株od值和叶绿素含量，对于其中叶绿素/od较高的菌株，包括突变株a3、a8、c8和g1等，进一步检测辅酶q
10
产量，以进行产量的验证。
[0136]
结果显示，叶绿素/od较高的突变体菌株，其辅酶q
10
产量显著更高。就突变株a3、a8、c8和g1来比较可见，g1产量提升最显著，相比于出发菌株，辅酶q
10
产量提高了30％以上。
[0137]
分析g1菌株的基因组，其它位置没有变化，仅全局调控因子prra发生了一个位点的突变，其第24位苯丙氨酸(phe)突变为丝氨酸(ser)，其产量提升非常显著。
[0138]
实施例6、prra突变菌株高通量筛选
[0139]
为了验证筛选效果，申请人利用48孔深孔板进行了更多批次的高通量检测。
[0140]
设置对照组以及实验组如表3。
[0141]
表3
[0142][0143]
将菌株接种于48孔深孔板中，操作方法和检测方法同实施例5。结果如图7，图中的点表示单孔中的辅酶q10的产量。统计结果表明，实验组能够稳定地获得高产菌株，且所筛选获得的高产菌株极显著地多于对照组(仅个别或基本上难以获得高产菌)。
[0144]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

技术特征：
1.一种建立或筛选高产辅酶q
10
的类球红细菌的方法，其特征在于，包括：(1)靶向改造类球红细菌中的全局调控因子prra；(2)培养(1)的类球红细菌，分离出叶绿素含量显著高的菌，从中获得高产辅酶q
10
的类球红细菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述改造包括：对全局调控因子prra进行随机突变；较佳地，所述的突变通过位点特异性重组引入到类球红细菌；较佳地，所述的对全局调控因子prra进行随机突变是高通量的，形成随机突变文库；较佳地，所述的类球红细菌为类球红细菌hy01。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，全局调控因子prra随机突变后的突变序列引入到类球红细菌的基因组中、替换原prra基因；较佳地，通过在类球红细菌基因组的原prra基因位置引入attb位点、实现所述替换；更佳地，利用自杀质粒引入attb位点；较佳地，利用含有整合酶int和接合转移位点orit的质粒将prra突变序列插入类球红细菌基因组attb位点；更佳地，后续通过cre酶剪除所述质粒。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，通过选自下组的方法来分离出叶绿素含量显著高的菌：(a)观测类球红细菌或其菌落的颜色；(b)测定类球红细菌的叶绿素的含量；(c)测定类球红细菌培养物的od值；较佳地所述od值为700nm。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括设置对照组，所述对照组是在步骤(1)中未进行全局调控因子prra改造的类球红细菌；较佳地，(a)中，若是全局调控因子prra改造的类球红细菌的菌落颜色为绿色，则其为高产辅酶q
10
的类球红细菌；较佳地，绿色的颜色越深则产量越高；更佳地所述绿色为墨绿色；(b)中，若是全局调控因子prra改造的类球红细菌的叶绿素的含量在统计学上高于对照，则其为高产辅酶q
10
的类球红细菌；或(c)中，若是全局调控因子prra改造的类球红细菌培养物的od值在统计学上高于对照，则其为高产辅酶q
10
的类球红细菌；较佳地，在获得(1)的类球红细菌后，首先进行(a)，分离获得颜色为绿色的类球红细菌；之后，对于筛选获得的绿色的类球红细菌，进行(b)和/或(c)。6.权利要求1-5任一所述方法的应用，用于建立或筛选高产辅酶q
10
的类球红细菌；较佳地，所述的类球红细菌为类球红细菌hy01。7.一种生物发酵生产辅酶q
10
的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)以权利要求1-5任一所述的方法建立高产辅酶q
10
的类球红细菌；(b)将(a)的类球红细菌进行发酵，生产辅酶q
10
。8.一种用于建立或筛选高产辅酶q
10
的类球红细菌的试剂盒，其中包括：靶向改造类球红细菌中的全局调控因子prra的工具，叶绿素分析工具；较佳地，还包括建立突变体文库的工具；较佳地，所述靶向改造类球红细菌中的全局调控因子prra的工具包括：对全局调控因子prra进行随机突变的材料，以及将所述随机突变引入到类球红细菌基因组的材料；更佳
地包括：(i)在类球红细菌基因组的原prra基因位置引入attb位点的材料、如自杀质粒pk18mobsacb，或(ii)将prra突变序列插入到类球红细菌基因组attb位点的材料、如含有整合酶int和接合转移位点orit的puc57质粒；较佳地，所述叶绿素分析工具包括：培养平板，分光光度计，酶标仪。9.一种制备高产辅酶q
10
的类球红细菌的方法，所述方法包括：以类球红细菌为出发菌株，对其基因组中全局调控因子prra进行突变，将其第24位突变为丝氨酸；较佳地，所述高产辅酶q
10
的类球红细菌与出发菌株相比，产量提升30％以上。10.一种高产辅酶q
10
的类球红细菌，其基因组中全局调控因子prra的第24位突变为丝氨酸；较佳地，所述高产辅酶q
10
的类球红细菌与出发菌株相比，产量提升30％以上。

技术总结
本发明涉及一种高产辅酶Q


技术研发人员：谭高翼 张立新 刘晶 梁敏东
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/9