一种积雪草发酵液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于化妆品技术领域，尤其涉及一种积雪草发酵液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.由于当前的气候变化、空气污染等外部环境、生活习惯(电脑辐射、压力大、睡眠不足)的内部因素、日常用的化妆品的种类与成分越发复杂等多种因素，肌肤敏感的问题越来越严重，对广大消费者造成了很大的困扰，皮肤经常出现发红、瘙痒、烧灼感、紧绷不适、出现红血丝等，皮肤不能经受任何刺激，太阳光刺激、冷热刺激、化妆刺激后，上述症状会加重、反复；有时候不接受明显刺激也会出现上述症状。
3.目前的研究表明，敏感性皮肤的发生是一种涉及皮肤屏障-神经血管-免疫炎症的复杂过程；是皮肤屏障功能受损和对外界刺激的反应性增强的一种皮肤状态。目前市面上有很多适合敏感肌的化妆品，但是效果参差不齐，尤其是舒缓和修护方面还有待提升。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有显著的舒缓和修护作用的积雪草发酵液及其制备方法和应用。
5.本发明提供了一种积雪草发酵液的制备方法，包括以下步骤：
6.1)新鲜的积雪草花/叶/茎与水混合打浆获得积雪草浆；
7.2)向所述积雪草浆中添加葡萄糖后进行高温灭菌获得灭菌后的积雪草浆；
8.3)向所述灭菌后的积雪草浆中接种植物乳杆菌和酵母菌进行第一发酵获得第一发酵液；
9.4)对所述第一发酵液进行固液分离，收集液相组分获得第一清液；
10.5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌进行第二发酵获得第二发酵液；
11.6)对所述第二发酵液进行固液分离，收集上清液为积雪草发酵液。
12.优选的，步骤1)中所述积雪草花/叶/茎与水混合的比例为1g：(5～8)ml。
13.优选的，步骤2)所述的葡萄糖的添加量为积雪草浆的4～6wt％。
14.优选的，步骤3)中所述植物乳杆菌和酵母菌总的接种量为4～6％。
15.优选的，所述第一发酵的温度为30～32℃，所述第一发酵的时间为72～84h。
16.优选的，步骤5)中所述胶质芽孢杆菌的接种量为4～6％。
17.优选的，所述第二发酵的温度为32～35℃，所述第二发酵的时间为24～48h。
18.本发明提供了所述的制备方法制备获得的积雪草发酵液。
19.本发明提供了所述的积雪草发酵液在制备护肤品中的应用。
20.优选的，所述护肤品为具有舒缓、修护功效的护肤品。
21.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明以新鲜的积雪草花/叶/茎为原料，经过两步发酵，将积雪草充分发酵，并最大程度的保留了积雪草中的活性成分，胶质芽孢杆菌产生的胞外多糖，具有优异的保湿作用，与积雪草中的活性成分协同作用，增强了
积雪草发酵液的舒缓修护作用，同时增强了发酵液的保湿效果。
附图说明
22.图1为本发明实施例1～3、对比例1～3的积雪草发酵液对炎症因子il-6表达抑制情况；
23.图2为本发明实施例1～3、对比例1～3的积雪草发酵液对炎症因子il-8表达抑制情况；
24.图3为试验例2中实验组1的10％乳酸刺痛试验评分变化；
25.图4为试验例2中实验组2的10％乳酸刺痛试验评分变化；
26.图5为试验例2中实验组3的10％乳酸刺痛试验评分变化；
27.图6为试验例2中阴性对照的10％乳酸刺痛试验评分变化；
28.图7为试验例2中不同处理组皮肤红斑指数变化对比；
29.图8为试验例2中一个受试者使用前后面部红斑对比；
30.图9为试验例2中另一个受试者使用前后面部红斑对比。
具体实施方式
31.本发明提供了一种积雪草发酵液的制备方法，包括以下步骤：1)新鲜的积雪草花/叶/茎与水混合打浆获得积雪草浆；2)向所述积雪草浆中添加葡萄糖后进行高温灭菌获得灭菌后的积雪草浆；3)向所述灭菌后的积雪草浆中接种植物乳杆菌和酵母菌进行第一发酵获得第一发酵液；4)对所述第一发酵液进行固液分离，收集液相组分获得第一清液；5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌进行第二发酵获得第二发酵液；6)对所述第二发酵液进行固液分离，收集上清液为积雪草发酵液。
32.在本发明中，将新鲜的积雪草花/叶/茎与水混合打浆获得积雪草浆。本发明对所述积雪草的来源没有特殊限定，优选的以新鲜刚采摘的积雪草花/叶/茎为原料，在本发明中，所述积雪草花/叶/茎指的是每株积雪草上的花/叶/茎同时使用；所述积雪草花/叶/茎与水混合的比例优选为1g：(5～8)ml，进一步优选为1g：(6～7)ml。本发明对所述打浆的操作没有特殊限定，采用本领域常规的打浆机进行即可；本发明打浆的目的是初步破碎细胞是积雪草中的有效成分得到释放，利于后续的发酵。
33.在本发明中，向获得的积雪草浆中添加葡萄糖后进行高温灭菌获得灭菌后的积雪草浆。在本发明中，所述的葡萄糖的添加量为积雪草浆的4～6wt％，更优选为4.5～5.5wt％，最优选为5wt％。本发明对所述葡萄糖的来源没有特殊限定，采用市售商品即可。在本发明中，所述葡萄糖作为碳源，为后续两步发酵的菌种提供足够的能量，使菌种能够快速发酵。在本发明中，所述高温灭菌的温度优选为115℃，时间优选为15～30min。
34.本发明在获得灭菌后的积雪草浆后，向所述灭菌后的积雪草浆中接种植物乳杆菌和酵母菌进行第一发酵获得第一发酵液。在本发明中，所述植物乳杆菌和酵母菌总的接种量优选为4～6％，更优选为4.5～5.5％；所述植物乳杆菌和酵母菌的比例优选为1:1；所述植物乳杆菌和酵母菌优选的经过活化后接种，所述活化后的植物乳杆菌和酵母菌的活菌浓度优选的分别为1～5
×
107cfu/ml。在本发明中，所述第一发酵的温度优选为30～32℃，进一步优选为31℃；所述第一发酵的时间优选为72～84h，进一步优选为75～82h；所述第一发
酵优选的伴随振荡或搅拌，所述振荡或搅拌的转速优选为180～220rpm，更优选为190～210rpm。
35.本发明对获得的所述第一发酵液进行固液分离，收集液相组分获得第一清液。在本发明中，所述固液分离优选的采用过滤或离心的步骤；当采用离心时，所述离心的转速优选为6000～8000rpm，更优选为6500～7500rpm；所述离心的时间优选为5～8min，进一步优选为6～7min。当采用过滤时，优选的采用滤膜过滤，更优选的采用抽滤；所述滤膜的孔径优选为0.45μm。
36.在本发明中，向第一清液中接种胶质芽孢杆菌进行第二发酵获得第二发酵液；所述胶质芽孢杆菌的接种量优选为4～6％，更优选为5％；所述第二发酵的温度优选为32～35℃，更优选为33～34℃；所述第二发酵的时间优选为24～48h，进一步优选为30～40h。所述第二发酵优选的伴随振荡或搅拌，所述振荡或搅拌的转速优选为180～220rpm，更优选为190～210rpm。
37.本发明在获得所述第二发酵液后，对所述第二发酵液进行固液分离，收集上清液为积雪草发酵液。在本发明中，对第二发酵液进行固液分离的方式与第一发酵液进行固液分离的方式一致，在此不再赘述。
38.本发明还提供了所述的制备方法制备获得的积雪草发酵液，所述积雪草发酵液中含有丰富的活性物质，包括积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸、胞外多糖等等。
39.本发明提供了所述的积雪草发酵液在制备护肤品中的应用。在本发明中，所述护肤品为具有舒缓、修护功效的护肤品，包括但不限于护肤水、乳液、霜、面膜；所述积雪草发酵液在所述护肤品中的质量百分含量优选为5～20％。
40.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
41.菌种来源：
42.酵母菌(cctcc ny20083094)和植物乳杆菌(cctcc lb 2008168)均购自中国典型培养物保藏中心，非特殊菌种。
43.胶质芽孢杆菌as1.232购自上海沪峥生物科技有限公司。
44.人体成纤维细胞购自上海弘顺生物科技有限公司。
45.实施例1
46.制备方法：
47.1)新鲜的积雪草花/叶/茎100g与500ml水混合打浆机打浆获得积雪草浆；每个250ml三角瓶装入100ml积雪草浆；
48.2)向每一个三角瓶中添加4g葡萄糖后，115℃高温灭菌15min，自然冷却；
49.3)在无菌操作台中，向冷却后的积雪草浆中接种植物乳杆菌(od
600
＝0.8)2ml和酵母菌(od
600
＝0.7)2ml；进行发酵，30℃，200rpm，72h。
50.4)6000rpm离心第一发酵液6min，收集上清获得第一清液；
51.5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌5ml(od
600
＝0.6)进行第二发酵获34℃，200rpm，发酵24h；
52.6)0.45μm滤膜过滤，收集上清液为积雪草发酵液。
53.实施例2
54.制备方法：
55.1)新鲜的积雪草花/叶/茎100g与800ml水混合打浆机打浆获得积雪草浆；每个250ml三角瓶装入100ml积雪草浆；
56.2)向每一个三角瓶中添加5g葡萄糖后，115℃高温灭菌15min，自然冷却；
57.3)在无菌操作台中，向冷却后的积雪草浆中接种植物乳杆菌(od
600
＝0.8)2.5ml和酵母菌(od
600
＝0.7)2.5ml；进行发酵，30℃，200rpm，84h。
58.4)8000rpm离心第一发酵液5min，收集上清获得第一清液；
59.5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌4ml(od
600
＝0.6)进行第二发酵获34℃，200rpm，发酵48h；
60.6)0.45μm滤膜过滤，收集上清液为积雪草发酵液。
61.实施例3
62.制备方法：
63.1)新鲜的积雪草花/叶/茎100g与500ml水混合打浆机打浆获得积雪草浆；每个250ml三角瓶装入100ml积雪草浆；
64.2)向每一个三角瓶中添加6g葡萄糖后，115℃高温灭菌15min，自然冷却；
65.3)在无菌操作台中，向冷却后的积雪草浆中接种植物乳杆菌(od
600
＝0.8)3ml和酵母菌(od
600
＝0.7)3ml；进行发酵，30℃，200rpm，72h。
66.4)6000rpm离心第一发酵液6min，收集上清获得第一清液；
67.5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌3ml(od
600
＝0.6)进行第二发酵获34℃，200rpm，发酵24h；
68.6)8000rpm离心第一发酵液5min，收集上清液为积雪草发酵液。
69.对比例1
70.制备方法：
71.1)新鲜的积雪草花/叶/茎100g与500ml水混合打浆机打浆获得积雪草浆；每个250ml三角瓶装入100ml积雪草浆；
72.2)向每一个三角瓶中添加4g葡萄糖后，115℃高温灭菌15min，自然冷却；
73.3)在无菌操作台中，向冷却后的积雪草浆中接种植物乳杆菌(od
600
＝0.8)2ml和酵母菌(od
600
＝0.7)2ml；进行发酵，30℃，200rpm，72h。
74.4)6000rpm离心第一发酵液6min，收集上清获得第一清液为积雪草发酵液。
75.对比例2
76.制备方法：
77.1)新鲜的积雪草花/叶/茎100g与500ml水混合打浆机打浆获得积雪草浆；每个250ml三角瓶装入100ml积雪草浆；
78.2)向每一个三角瓶中添加4g葡萄糖后，115℃高温灭菌15min，自然冷却；
79.3)在无菌操作台中，向冷却后的积雪草浆中接种植物乳杆菌(od
600
＝0.8)4ml；进行发酵，30℃，200rpm，72h。
80.4)6000rpm离心第一发酵液6min，收集上清获得第一清液；
81.5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌5ml(od
600
＝0.6)进行第二发酵获34℃，
200rpm，发酵24h；
82.6)0.45μm滤膜过滤，收集上清液为积雪草发酵液。
83.对比例3
84.制备方法：
85.1)新鲜的积雪草花/叶/茎100g与500ml水混合打浆机打浆获得积雪草浆；每个250ml三角瓶装入100ml积雪草浆；
86.2)向每一个三角瓶中添加4g葡萄糖后，115℃高温灭菌15min，自然冷却；
87.3)在无菌操作台中，向冷却后的积雪草浆中接种酵母菌(od
600
＝0.7)4ml；进行发酵，30℃，200rpm，72h。
88.4)6000rpm离心第一发酵液6min，收集上清获得第一清液；
89.5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌5ml(od
600
＝0.6)进行第二发酵获34℃，200rpm，发酵24h；
90.6)0.45μm滤膜过滤，收集上清液为积雪草发酵液。
91.试验例1
92.本发明提供的积雪草发酵液对炎症因子的作用
93.将人体成纤维细胞接种于25cm2培养瓶，以含15％fbs的dmem培养液培养，待其长至85％融合，进行传代。将传代至第4代的细胞接种于细胞板中，每孔接种106个细胞，待长至85％融合，进行试验。
94.使用1.2μg/ml的lps诱导人体成纤维细胞(hsf)发生炎症反应，并使用本发明实施例1～3、对比例1～3的积雪草发酵液进行处理，空白对照细胞不做任何处理，刺激对照只添加lps；对炎性因子il-6、il-8的表达进行测定评估。试验结果见图1(il-6)和图2(il-8)所示。
95.使用lps诱导细胞时，il-6、il-8的表达较阴性对照组显著增高，使用lps+积雪草发酵液诱导细胞时，il-6、il-8的表达均显著下降，实施例1～3的积雪草发酵液能够显著抑制炎症因子，对比例1～3的效果不明显。
96.试验例2
97.敏感性肌肤人群使用试验
98.受试者纳入标准：
99.1、10％乳酸刺痛试验阳性(室温下将10％的乳酸涂抹在鼻唇沟与任意一侧脸颊。用4分法分别在2.5分钟和5.0分钟时评判刺痛程度。若无红斑为0分，轻度红斑为1分，中度红斑为2分，重度红斑为3分。若两次相加的分数大于3，认为是阳性)；
100.2、年龄18～30岁；
101.3、女性。
102.试用时间为4周，每日早晚使用，全脸涂抹，每周记录受试者皮肤改变状况。
103.分组：实验组1～3分别为含实施例1～3制备的积雪草发酵液10％的乳液，阴性对照组使用不含本发明积雪草发酵液的乳液。
104.实验结果记录如表1和图3～6所示。
105.表1敏感性肌肤人群使用试验结果(部分)
[0106][0107][0108]
由上述实验结果可知，本发明提供的积雪草发酵液能够显著降低乳酸刺痛试验评分，修护敏感肌，并且使用者能够维持肌肤状态，不会反复；而阴性对照则没有明显的修护效果，敏感肌肤的症状存在反复，甚至出现比受试前加重的情况。
[0109]
皮肤红斑指数实验
[0110]
使用4周后，进行皮肤红斑指数(erythema index，ei)检测，使用visia-cr皮肤检测系统，测定红斑指数ei值；结果如图7所示，可见添加了本发明实施例1～3制备的积雪草发酵液的乳液对敏感皮肤具有修护作用。
[0111]
实验组1中的部分受试者使用前后对比照片如图8和9所示，可见添加了本发明实施例1制备的积雪草发酵液的乳液能够显著的修复红斑。
[0112]
试验例3
[0113]
积雪草发酵液保湿性能测试
[0114]
分别采用实施例1、对比例1～3的方案制备积雪草发酵液，进行保湿性能实验。
[0115]
招募健康皮肤志愿者10人，年龄在18～30，实验前24h内不使用任何护肤品，志愿者面部清洁后，使用实施例1、对比例1～3制备的积雪草发酵液，浸泡面膜纸10min，贴敷在
面部；用皮肤水份测试仪(德国corneometer cm825)测定使用前、使用后0h、0.5h、1h、2h、3h、4h额头的水分含量，在同一区域内选取不同点测定4次，取均值记为皮肤水分含量mvv值。
[0116]
mvv值的普通评判标准：
[0117]
mvv值《35记为皮肤干燥；
[0118]
mvv值处于35～50记为皮肤水分中等；
[0119]
mvv值》50皮肤水分充分。
[0120]
测定结果如下表2所示：
[0121]
表2保湿性能测试结果
[0122]
实验组测试前0h0.5h1h2h3h4h实施例136.2367.2065.3165.1364.2163.3363.31对比例137.1854.3253.1049.1344.9041.1237.14对比例236.8564.2362.0655.3852.1050.3148.56对比例338.0962.8559.1854.3447.1345.5544.35
[0123]
对保湿性能测试结果进行分析可知，采用两步法发酵，尤其是添加了胶质芽孢杆菌的第二发酵制备获得的积雪草发酵液，具有显著的保湿性能，原因是胶质芽孢杆菌发酵产生的胞外多糖具有显著的长效保湿作用，能够降低皮肤失水率，提高积雪草中有效成分功效，而对比例的皮肤水分含量mvv值降低幅度较大，保湿时效较短。
[0124]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种积雪草发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)新鲜的积雪草花/叶/茎与水混合打浆获得积雪草浆；2)向所述积雪草浆中添加葡萄糖后进行高温灭菌获得灭菌后的积雪草浆；3)向所述灭菌后的积雪草浆中接种植物乳杆菌和酵母菌进行第一发酵获得第一发酵液；4)对所述第一发酵液进行固液分离，收集液相组分获得第一清液；5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌进行第二发酵获得第二发酵液；6)对所述第二发酵液进行固液分离，收集上清液为积雪草发酵液。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述积雪草花/叶/茎与水混合的比例为1g：(5～8)ml。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的葡萄糖的添加量为积雪草浆的4～6wt％。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述植物乳杆菌和酵母菌总的接种量为4～6％。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一发酵的温度为30～32℃，所述第一发酵的时间为72～84h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述胶质芽孢杆菌的接种量为4～6％。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第二发酵的温度为32～35℃，所述第二发酵的时间为24～48h。8.权利要求1～7任意一项所述的制备方法制备获得的积雪草发酵液。9.权利要求8所述的积雪草发酵液在制备护肤品中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述护肤品为具有舒缓、修护功效的护肤品。

技术总结
本发明提供了一种积雪草发酵液及其制备方法和应用，属于化妆品技术领域，所述积雪草发酵液的制备方法，包括以下步骤：1)新鲜的积雪草花/叶/茎与水混合打浆获得积雪草浆；2)向所述积雪草浆中添加葡萄糖后进行高温灭菌获得灭菌后的积雪草浆；3)向所述灭菌后的积雪草浆中接种植物乳杆菌和酵母菌进行第一发酵；4)对第一发酵液进行固液分离，收集液相组分获得第一清液；5)向第一清液中接种胶质芽孢杆菌进行第二发酵；6)对第二发酵液进行固液分离，收集上清液为积雪草发酵液。本发明经过两步发酵，将积雪草充分发酵，胶质芽孢杆菌产生的胞外多糖与积雪草中的活性成分协同作用，增强了积雪草发酵液的舒缓修护作用和保湿效果。积雪草发酵液的舒缓修护作用和保湿效果。积雪草发酵液的舒缓修护作用和保湿效果。


技术研发人员：王杰
受保护的技术使用者：广州杨森药业有限公司
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/9