一种用于量子点芯片平台SNP检测的探针及其设计方法与流程

一种用于量子点芯片平台snp检测的探针及其设计方法
技术领域
1.本发明属于基因分子检测领域，具体涉及一种用于量子点芯片平台snp检测的探针及其设计方法。


背景技术：

2.目前尚无基于量子点基因芯片平台检测snp的探针设计方案，常用的芯片平台捕获探针设计方法就是两条涵盖snp位点的寡核苷酸；一条是野生型探针，能够特异性地结合野生型的模板；另一条是突变型探针，能够特异性地结合突变型的模板。扩增的产物分别与两条探针杂交，依据终点的信号来判定样品的基因型是野生型、杂合型还是突变型。
3.常规的捕获探针设计方法，由于野生型和突变型的捕获探针只差别了1个碱基，很容易出现非特异性的捕获，即突变型探针捕获野生型核酸，造成错误的判定结果。


技术实现要素：

4.针对上述背景技术中存在的问题，本发明提供一种基于量子点芯片平台提高snp检测特异性的探针设计方法，可有效提高量子点芯片平台检测snp的特异性。本发明在常规捕获探针的基础上，在寡核苷酸链上引入一个错配碱基，从而可提高捕获探针的特异性。
5.本发明采用以下技术方案：
6.一种基于量子点芯片平台提高snp检测特异性的探针设计方法，对捕获探针中的突变型探针进行设计，所述突变型探针为寡核苷酸单链dna，在靠近3’末端倒数3个碱基以上(优选为3-5个碱基)的位置上引入1个错配，并在3’端或5’端标记氨基；在所述寡核苷酸单链dna与氨基间连接有间臂，间臂为脂肪酸c链和oligo dt中的一种或两种的组合，所述脂肪酸c链的c的数量为1～12的整数，所述oligo dt的dt的数量为1～30的整数。
7.基于量子点芯片平台进行snp检测时，扩增反应的上游引物为常规引物，tm在60℃左右；下游引物的5’端为生物素修饰引物，tm在60℃左右；探针的tm在60℃左右。
8.量子点作为一种新型纳米材料，已广泛用于生物成像、药物输送和药物分析领域。量子点通常是由ii
–
iv组的元素或iii
–
v组的元素组成的稳定的纳米晶粒，具有独特的荧光发光特性。与传统有机荧光染料相比，量子点主要具有以下优势：发光率高、寿命长、光稳定性好、单一光源多色激发等，是更优的荧光探针选择。将多重pcr与量子点基因芯片相结合来进行dna分析，能显著提高敏感度、特异性，实现更快速高效的检测。本发明所采用的量子点为cdse/zns，量子点的激发波长为200-500nm，量子点的发射波长为400-700nm，量子点的尺寸为1-200nm。
9.本发明的有益效果为：
10.本发明的基于量子点芯片平台提高snp检测特异性的探针设计方法通过在探针的中后端引入一个错配碱基，即可提高捕获探针的特异性。因此该方法具有步骤简单，特异性好的优点。
附图说明
11.图1为egfr基因-t790m位点的量子点核酸检测结果；
12.图2为egfr基因-t790m位点的样品一代测序结果；
13.图3为egfr基因-l858r位点的量子点核酸检测结果；
14.图4为egfr基因-l858r位点的样品一代测序结果。
具体实施方式
15.实施例1
16.1、egfr基因-790位点突变引物探针设计
17.依据egfr基因-t790m位点设计1对扩增引物(790f和790rb)以及4条突变型探针。4条突变型探针分别为：1)常规突变型探针(790-1p)；2)常规突变型探针在第5个碱基引入一个错配(790-2p)；3)常规突变型探针在倒数第5个碱基引入一个错配(790-3p)；4)常规突变型探针分别在第5个碱基和倒数第5个碱基引入一个错配(790-4p)。
18.19.[0020][0021]
2、样品
[0022]
2.1阴性dna样品d1、e1：口腔拭子，采用天根提取试剂盒提取dna，定量至10ng/μl；
[0023]
2.2阳性dna样品790s：生物公司合成，溶解至1ng/μl，稀释10000倍后备用，序列如下(带下划线的粗斜体为突变碱基)：
[0024][0025]
3、pcr扩增
[0026][0027]
4、量子点核酸检测
[0028]
4.1量子点核酸检测原理
[0029]
检测膜条的材质为尼龙膜，且经活化后的尼龙膜上点有一定浓度的捕获探针(1-50um)，以微阵列形式分布在尼龙膜上。量子点为表面偶联有若干数量链霉亲和素的量子点(cdse/zns)，具体偶联的链霉亲和素数量≥1。量子点的激发波长为200-500nm，发射波长为400-700nm，尺寸大小为1-200nm。将带有生物素标记核酸扩增产物与检测膜条上的探针进行分子杂交，再通过生物素与偶联链霉亲和素的量子点进行结合，检测膜条经荧光检测仪器观察各个位点有无光信号来判断该探针是否与该核酸产物杂交，从而确定样本中是否含有相关靶标核酸。
[0030]
4.2量子点核酸检测流程
[0031]
4.2.1核酸扩增后，将产物进行95℃高温热变性。
[0032]
4.2.2将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至48℃的杂交液(2*ssc与0.1％sds)中进行杂交，杂交时间为1h。
[0033]
4.2.3杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至48℃的洗涤液(0.5*ssc与0.1％sds)中进行洗涤，洗涤时间为0.5h。
[0034]
4.2.4洗涤结束后，将洗涤液去除后，加入预热到48℃的孵育液(2*ssc、0.1％sds以及0.01-5nm的链霉素耦联的量子点)中，室温孵育0.5h。
[0035]
4.2.5孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液(0.5*ssc与0.1％sds)进行洗涤，洗涤时间为0.5h。
[0036]
4.2.6洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。
[0037]
5、结果分析
[0038]
由图1和2可知：
[0039]
5.1 790-1p为常规突变型探针，特异性不佳；
[0040]
5.2 790-2p为探针骨架第5个碱基引入错配的突变型探针，特异性不佳；
[0041]
5.3 790-3p为探针骨架倒数第5个碱基引入错配的突变型探针，与一代测序结果一致，特异性正常；
[0042]
5.4 790-4p为探针骨架第五个碱基和倒数第五个碱基同时引入错配的突变型探针，无论是野生型还是突变型都没有检测到信号。
[0043]
实施例2
[0044]
1、egfr基因-858位点突变引物探针设计
[0045]
依据egfr基因-l858r位点设计1对扩增引物(858f和858rb)以及2条突变型探针。2条突变型探针分别为：1)常规突变型探针(858-1p)；2)常规突变型探针在倒数第5个碱基引入一个错配(858-2p)。
[0046][0047]
2样品
[0048]
2.1阴性dna样品d1、e1：口腔拭子，采用天根提取试剂盒提取dna，定量至10ng/μl；
[0049]
2.2阳性dna样品858s：生物公司合成，溶解至1ng/μl，稀释10000倍后备用，序列如下(带下划线的粗斜体为突变碱基)：
[0050]
[0051]
3pcr扩增
[0052][0053]
4量子点核酸检测
[0054]
4.1量子点核酸检测原理
[0055]
检测膜条的材质为尼龙膜，且经活化后的尼龙膜上点有一定浓度的捕获探针(1-50um)，以微阵列形式分布在尼龙膜上。量子点为表面偶联有若干数量链霉亲和素的量子点(cdse/zns)，具体偶联的链霉亲和素数量≥1。量子点的激发波长为200-500nm，发射波长为400-700nm，尺寸大小为1-200nm。将带有生物素标记核酸扩增产物与检测膜条上的探针进行分子杂交，再通过生物素与偶联链霉亲和素的量子点进行结合，检测膜条经荧光检测仪器观察各个位点有无光信号来判断该探针是否与该核酸产物杂交，从而确定样本中是否含有相关靶标核酸。
[0056]
4.2量子点核酸检测流程
[0057]
4.2.1核酸扩增后，将产物进行95℃高温热变性。
[0058]
4.2.2将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至48℃的杂交液(2*ssc与0.1％sds)中进行杂交，杂交时间为1h。
[0059]
4.2.3杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至48℃的洗涤液(0.5*ssc与0.1％sds)中进行洗涤，洗涤时间为0.5h。
[0060]
4.2.4洗涤结束后，将洗涤液去除后，加入预热到48℃的孵育液(2*ssc、0.1％sds以及0.01-5nm的链霉素耦联的量子点)中，室温孵育0.5h。
[0061]
4.2.5孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液(0.5*ssc与0.1％sds)进行洗涤，洗涤时间为0.5h。
[0062]
4.2.6洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。
[0063]
5分析
[0064]
由图3和4可知：
[0065]
5.1 858-1p为常规突变型探针，特异性不佳；
[0066]
5.2 858-2p为探针骨架倒数第5个碱基引入错配的突变型探针，与一代测序结果一致，特异性正常。
[0067]
由实施例1和2可知，两个位点均证明在常规突变型探针的中后端引入错配碱基能
够显著提高量子点芯片检测snp的特异性。

技术特征：
1.一种用于量子点芯片平台snp检测的探针设计方法，其特征在于，对捕获探针中的突变型探针进行设计，所述突变型探针为寡核苷酸单链dna，在靠近3’末端倒数3个碱基以上的位置上引入1个错配，并在3’端或5’端标记氨基；在所述寡核苷酸单链dna与氨基间连接有间臂，间臂为脂肪酸c链和oligo dt中的一种或两种的组合，所述脂肪酸c链的c的数量为1～12的整数，所述oligo dt的dt的数量为1～30的整数。2.根据权利要求1所述的一种用于量子点芯片平台snp检测的探针设计方法，其特征在于，将错配碱基引入到靠近3’末端倒数3-5个碱基的位置上。3.一种用于量子点芯片平台snp检测的探针，其特征在于，采用权利要求1或2所述方法设计得到。4.根据权利要求3所述的用于量子点芯片平台snp检测的探针，其特征在于，当捕获探针用于检测egfr基因-t790m位点时，突变型探针的序列为ttttttttttcagctcatcatgcagcacatg。5.根据权利要求4所述的用于量子点芯片平台snp检测的探针，其特征在于，当捕获探针用于检测egfr基因-l858r位点时，突变型探针的序列为ttttttttttgtttggcccgcgcaaa。

技术总结
本发明提供一种用于量子点芯片平台SNP检测的探针及其设计方法，该方法具体为：对捕获探针中的突变型探针进行设计，所述突变型探针为寡核苷酸单链DNA，在靠近3’末端倒数3-5个碱基的位置上引入1个错配，并在3’端或5’端标记氨基；在所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，间臂为脂肪酸C链和oligo dT中的一种或两种的组合，所述脂肪酸C链的C的数量为1～12的整数，所述oligo dT的dT的数量为1～30的整数。本发明方法可有效提高量子点芯片平台检测SNP的特异性。SNP的特异性。SNP的特异性。


技术研发人员：朱海涛 裘惠良 方美红 陈思伊
受保护的技术使用者：杭州千基生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/8/13