戈登氏菌ZJJ及其在降解3-甲基吡啶中的应用

rubripertincta)zjj经扩大培养获得的静息细胞加入ph6-8(优选ph6.0)、含有3-甲基吡啶的无机盐液体培养基中，在20-40℃(优选35℃)条件下进行培养，实现对3-甲基吡啶的降解。
11.进一步，所述静息细胞的加入量以菌体干重记为30mg/l无机盐液体培养基。
12.进一步，所述含有3-甲基吡啶的无机盐液体培养基中3-甲基吡啶的浓度为100-500mg/l(优选为100-200mg/l)。
13.进一步，所述含有3-甲基吡啶的无机盐液体培养基由以下浓度的各组分组成：k2hpo
4 0.5g/l、kh2po
4 0.5g/l、nh4cl 0.5g/l、mgso4·
7h2o 0.2g/l、feso4·
7h2o 0.02g/l、cacl
2 0.02g/l、nacl 0.1g/l、微量元素储备液2ml/l和100-500mg/l 3-甲基吡啶，溶剂为去离子水；其中，所述微量元素储备液由以下浓度的各组分组成：cacl
2 0.0003g/l、feso4·
7h2o 0.04g/l、mnso4·
4h2o 0.04g/l、znso4·
7h2o 0.02g/l、cuso4·
5h2o 0.005g/l、cocl2·
6h2o 0.004g/l、nacl 1.0g/l、na2moo4·
2h2o 0.005g/l，溶剂为去离子水。
14.进一步，所述静息细胞按如下步骤制备：
15.(1)斜面培养：
16.将所述戈登氏菌(gordonia rubripertincta)zjj于固体lb培养基30℃培养箱中培养至长出单菌落；
17.(2)扩大培养
18.挑取步骤(1)中的单菌落接种至lb液体培养基中，在30℃，160rpm下培养至对数期后期，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐液体培养基洗涤，获得所述静息细胞。
19.进一步，步骤(1)中所述的固体lb培养基由以下终浓度的各组分组成：5g/l酵母粉，10g/l nacl，10g/l蛋白胨，20g/l琼脂，ph自然，溶剂为去离子水。
20.进一步，步骤(2)中所述lb液体培养基由以下终浓度的各组分组成：5g/l酵母粉，10g/l nacl，10g/l蛋白胨，ph自然，溶剂为去离子水。
21.更进一步，步骤(2)中所述无机盐液体培养基由以下浓度的各组分组成：k2hpo
4 0.5g/l、kh2po
4 0.5g/l、nh4cl 0.5g/l、mgso4·
7h2o 0.2g/l、feso4·
7h2o 0.02g/l、cacl
2 0.02g/l、nacl 0.1g/l、微量元素储备液2ml/l，溶剂为去离子水；其中，所述微量元素储备液由以下浓度的各组分组成：cacl20.0003g/l、feso4·
7h2o 0.04g/l、mnso4·
4h2o 0.04g/l、znso4·
7h2o 0.02g/l、cuso4·
5h2o 0.005g/l、cocl2·
6h2o 0.004g/l、nacl 1.0g/l、na2moo4·
2h2o0.005g/l，溶剂为去离子水。
22.与现有技术相比，本发明有益效果体现在：
23.本发明提供的戈登氏菌(gordonia rubripertincta)zjj取自农药厂废水生物处理池中的污泥，对于3-甲基吡啶具有较好地降解效果，可以高效地把3-甲基吡啶转化为co2、氨氮等稳定物质。因而在含3-甲基吡啶工业废水的生物净化过程中具有广阔的应用前景。
24.本发明所述的戈登氏菌能高效降解3-甲基吡啶，在初始污染物浓度为100-600mg/l的情况下，该菌都能迅速且较完全降解。因此，该戈登氏菌对于3甲基吡啶具有高效的降解能力，且能承受较高浓度的污染物。
附图说明
25.图1为gordonia rubripertincta zjj的透射电子显微镜照片。
26.图2为gordonia rubripertincta zjj的系统发育树图。
27.图3为gordonia rubripertincta zjj在不同浓度下3-甲基吡啶的降解率。
28.图4和图5分别为gordonia rubripertincta zjj在28h内不同ph条件下对初始浓度为200mg/l 3-甲基吡啶的降解率，在32h内不同温度条件下对初始浓度为200mg/l 3-甲基吡啶的降解率。
具体实施方式
29.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
30.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
31.以下实施例中提到的配方组成：
32.无机盐液体培养基组成为：k2hpo
4 0.5g、kh2po
4 0.5g、nh4cl 0.5g、mgso4·
7h2o 0.2g、feso4·
7h2o 0.02g、cacl
2 0.02g、nacl 0.1g、微量元素储备液2ml，溶剂为1l去离子水。其中，微量元素储备液由以下组分组成：cacl20.0003g、feso4·
7h2o 0.04g、mnso4·
4h2o 0.04g、znso4·
7h2o 0.02g、cuso4·
5h2o 0.005g、cocl2·
6h2o 0.004g、nacl1.0 g、na2moo4·
2h2o 0.005g、溶于1l去离子水。lb固体培养基配方：5g/l酵母粉，10g/l nacl，10g/l蛋白胨，20g/l琼脂，ph自然，溶剂为去离子水。
33.实施例1：gordonia rubripertincta zjj的分离、纯化及其鉴定。
34.①
gordonia rubripertincta zjj的分离及纯化。
35.gordonia rubripertincta zjj是从污水厂活性污泥中驯化、分离纯化得到的一株革兰氏阳性菌。具体步骤如下：
36.在摇瓶中加入50ml无机盐液体培养基，并加入5ml污水厂活性污泥和80mg/l的3-甲基吡啶完全降解时从中取出5ml富集液于50ml新鲜无机盐液体培养基中，加入相同量的3-甲基吡啶，重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液梯度稀释涂布lb固体培养基，选择单菌落分离平板画线纯化，将得到的备选菌加入无机盐固体培养基，并加入200mg/l3-甲基吡啶作为唯一的碳源及能源进行验证，得到目的菌株zjj，通过透射电子显微镜确定其形态(图1)。
37.菌株zjj特征：菌落橙黄色，边缘规则，不透明，表面光滑，凸起。透射电镜下观察该菌体的形态为球菌，无鞭毛，革兰氏染色阳性。
38.②
菌株zjj的鉴定
39.通过16s rrna序列分析和生理生化实验鉴定，确定该菌株为gordonia rubripertincta。具体步骤如下：
40.采用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取和纯化菌株zjj的dna，4℃保存。用细菌的通用引物对纯化的dna进行pcr扩增，引物分别为27f(agagtttgatcctggctcag)和1492r(ggttaccttgttacgactt)，pcr反应程序设定为94℃预变性4min，然后在94℃条件下变性45s，55℃条件下退火45s，72℃条件下延伸1min，循环30个周期，最后7在2℃条件下修复延伸10min。将pcr产物纯化回收后进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，16s rrna测序结果(如seq id no:1所示)上传至ncbi，获得登录号ok036739，同时将该序列同ncbi数
据库中的基因序列进行blast对比。发现其属于gordonia属，与gordonia terrae strain dsm 43249、gordonia bronchialis dsm 43247和gordonia westfalica strain kb2具有99％的同源性。从结果中选取8株rhodococcus具有代表性的菌株，以16s rrna基因序列同源性为基础，采用mega6.0软件构建系统发育树，如图2。通过遗传距离及16s rrna序列对比，鉴定为gordonia rubripertincta，命名为zjj。
41.菌株对梅里埃cbc卡上41种碳源的利用能力。
42.利用梅里埃全自动鉴定仪考察菌株对41中不同碳源的代谢情况(委托给浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))。鉴定结果如表1所示。经梅里埃全自动鉴定仪vitek生化反应，菌株zjj可较强利用11种碳源，对其他37种碳源不能利用。
43.表1菌株zjj梅里埃全自动鉴定仪vitek生化反应结果(cbc卡)
[0044][0045]
表注：+，阳性反应；-：阴性反应
[0046]
实施例2戈登氏菌cctcc m:2022975静息细胞的获得
[0047]
①
斜面培养：
[0048]
将戈登氏菌cctcc m:2022975画线于固体lb平板30℃培养箱培养，得到单菌落进行lb试管斜面常规(4℃)保存。
[0049]
②
扩大培养
[0050]
在无菌操作台中将生长于30℃恒温培养箱以3-甲基吡啶为唯一碳源的无机盐固
体培养基上的纯菌接种于lb液体培养基中，在温度为30℃，转速为160rpm的恒温气浴摇床中培养至对数期后期(24h)取出，将培养液在6000rpm，4℃的条件下离心10min，倒掉上清液，用无菌水清洗3次，最后加入一定量的无菌水，摇匀，调其od
600
值为2。
[0051]
实施例3：戈登氏菌cctcc m:2022975对不同浓度3-甲基吡啶的降解性能检测。
[0052]
将无机盐液体培养基分装于摇瓶中，每瓶50ml，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到30mg/l(以细胞干重记)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入3-甲基吡啶作为唯一碳源使其终浓度分别为100、200、300、500、600、700mg/l，摇瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定摇瓶中残留的3-甲基吡啶浓度，绘制菌株降解3-甲基吡啶80h内的去除率曲线，结果见图3所示。结果表明，当3-甲基吡啶低于200mg/l时，菌株zjj可以快速的降解所添加的底物。
[0053]
实施例4：细菌gordonia rubripertincta zjj在不同ph下降解200mg/l3-基吡啶的降解性能测试。
[0054]
将无机盐液体培养基分装于摇瓶中，每瓶50ml，调节ph，ph设置为：4、5、6、7、8、9、10(用稀硫酸调节ph至4、5、6，用稀释后的氢氧化钠溶液调节ph至7、8、9、10)。110℃灭菌40min，灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到30mg/l(以细胞干重记)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入3-甲基吡啶作为唯一碳源使其初始浓度为200mg/l，摇瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定摇瓶中残留的3-甲基吡啶浓度，绘制菌株28h对于不同ph下，同一初始浓度3-甲基吡啶的去除率曲线，结果见图4所示。结果表明，当ph＝6菌株zjj可以快速的降解所添加的底物。
[0055]
实施例5：细菌gordonia rubripertincta zjj在不同温度下降解200mg/l3-基吡啶的降解性能测试。
[0056]
将无机盐液体培养基分装于摇瓶中，每瓶50ml，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到30mg/l(以细胞干重记)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入3-甲基吡啶作为唯一碳源使其初始浓度都为200mg/l，ph为所配液体无机盐培养基的原ph：6.9，摇瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，以此时刻为0点开始计时，将每组的5个培养瓶分别放入20℃、25℃、30℃、35℃、40℃这5个不同温度环境的恒温气浴摇床中进行培养，转速统一调为160rpm。定时测定摇瓶中残留的3-甲基吡啶浓度，绘制菌株降解3-甲基吡啶32h内的去除率曲线，结果见图5所示。结果表明，菌株zjj降解3-甲基吡啶的最适温度是35℃。
[0057]
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更改与润饰，均应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种戈登氏菌(gordonia rubripertincta)zjj，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：cctcc m:2022975，保藏日期：2022年06月27日。2.如权利要求1所述的戈登氏菌(gordonia rubripertincta)zjj在降解3-甲基吡啶中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是：将所述戈登氏菌(gordonia rubripertincta)zjj经扩大培养获得的静息细胞加入ph6-8、含有3-甲基吡啶的无机盐液体培养基中，在20-40℃条件下进行培养，实现对3-甲基吡啶的降解。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述静息细胞的加入量以菌体干重记为30mg/l无机盐液体培养基。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述含有3-甲基吡啶的无机盐液体培养基中3-甲基吡啶的浓度为100-500mg/l。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述含有3-甲基吡啶的无机盐液体培养基由以下浓度的各组分组成：k2hpo
4 0.5g/l、kh2po
4 0.5g/l、nh4cl0.5g/l、mgso4·
7h2o 0.2g/l、feso4·
7h2o 0.02g/l、cacl
2 0.02g/l、nacl 0.1g/l、微量元素储备液2ml/l和100-500mg/l 3-甲基吡啶，溶剂为去离子水；其中，所述微量元素储备液由以下浓度的各组分组成：cacl
2 0.0003g/l、feso4·
7h2o0.04g/l、mnso4·
4h2o 0.04g/l、znso4·
7h2o 0.02g/l、cuso4·
5h2o 0.005g/l、cocl2·
6h2o 0.004g/l、nacl 1.0g/l、na2moo4·
2h2o 0.005g/l，溶剂为去离子水。7.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述静息细胞按如下步骤制备：(1)斜面培养：将所述戈登氏菌(gordonia rubripertincta)zjj于固体lb培养基30℃培养箱中培养至长出单菌落；(2)扩大培养挑取步骤(1)中的单菌落接种至lb液体培养基中，在30℃，160rpm下培养至对数期后期，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐液体培养基洗涤，获得所述静息细胞。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的固体lb培养基由以下终浓度的各组分组成：5g/l酵母粉，10g/l nacl，10g/l蛋白胨，20g/l琼脂，ph自然，溶剂为去离子水。9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤(2)中所述lb液体培养基由以下终浓度的各组分组成：5g/l酵母粉，10g/l nacl，10g/l蛋白胨，ph自然，溶剂为去离子水。10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤(2)中所述无机盐液体培养基由以下浓度的各组分组成：k2hpo
4 0.5g/l、kh2po
4 0.5g/l、nh4cl 0.5g/l、mgso4·
7h2o 0.2g/l、feso4·
7h2o 0.02g/l、cacl
2 0.02g/l、nacl 0.1g/l、微量元素储备液2ml/l，溶剂为去离子水；其中，所述微量元素储备液由以下浓度的各组分组成：cacl
2 0.0003g/l、feso4·
7h2o 0.04g/l、mnso4·
4h2o 0.04g/l、znso4·
7h2o 0.02g/l、cuso4·
5h2o 0.005g/l、cocl2·
6h2o 0.004g/l、nacl 1.0g/l、na2moo4·
2h2o 0.005g/l，溶剂为去离子水。

技术总结
本发明提供了戈登氏菌(Gordonia rubripertincta)ZJJ及其在降解3-甲基吡啶中的应用。所述戈登氏菌(Gordonia rubripertincta)ZJJ保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，OP430847，保藏日期：2022年06月27日，保藏编号：CCTCC M:2022975。本发明提供的3-甲基吡啶降解菌能利用3-甲基吡啶作为唯一碳源繁殖并将该底物完全矿化成CO2和氨氮；在一定就pH的培养条件下，该菌可降解190mg/L的3-甲基吡啶；该菌株有较强的环境适应能力和高效降解能力。强的环境适应能力和高效降解能力。


技术研发人员：於建明 王自如 吴朦 郑嘉俊 胡俊 余志良
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/8/13