一种筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法与流程

1.本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法。


背景技术：

2.人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，hiv)是一种rna病毒，变异性大，引起获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome，aids)。近几年来，全球流行的病毒亚型越来越复杂。hiv-1具有高度变异，现已发现hiv-1型m组至少包括10种亚型(a、b、c、d、f、g、h、j、k)。当一个地区流行亚型复杂，在人群中达到一定的传播后，hiv-1亚型间易发生重组，产生一些独特重组型毒株(unique recombinant forms，urfs)。当某种urf在流行过程中趋于形成优势毒株，就成为了流行重组型毒株(circμlating recombinant forms，crfs)。截止目前，国内外已产生132种crfs，并在流行中占有优势。hiv-1基因突变，极易进一步导致耐药，给传染病预防和控制工作增加了压力。及时筛选、鉴别出新的urfs和crfs，对hiv-1传播监控有很重要的意义。
3.当前扩增hiv-1基因序列时，采用的较多的方法为：将hiv-19k bp的全长分为2段或者多段分别进行扩增并进行测序，通过拼接后获得全长序列。扩增方法一般为先反转录后进行巢式pcr两轮扩增。扩增出来的序列通过比对确认基因亚型归属，并确认其是否为urfs或crfs。由于hiv-1为rna病毒，变异大，在同一个宿主体内大量复制后形成了群体基因组遗传多样性，常常以准种的方式存在。准种形式存在就意味着病毒在同一样本里以多种毒株基因序列存在，被扩增或检测到的一般为准种中的优势毒株或占比大的基因片段。那么使用多段扩增拼接后进行新的urfs或crfs进行鉴定时存在风险为人工重组，即分别在扩增不同毒株片段，获得的基因序列可能来自同一样本不同毒株的基因片段，而非来自同一毒株。本发明旨在采用一种hiv基因全长扩增方法，避免发生人工重组的风险，使得扩增出来的基因为同一毒株的基因片段。
4.大部分文献目前鉴别出的新的urfs或crfs，一般只做最终的判别，并未详细介绍大量样本中筛选的方法。部分文献提到扩增了全长序列进行筛选，对所有样本进行全长扩增测序，全长测序成本高，也费时费力，且一些文献报道全长扩增率仅仅只有66％。本发明的筛选、鉴别方法在大量样本中先进行不同基因区的mosaic图谱的对比，再针对一些疑似新亚型毒株进行全长扩增，锁定和减小目标范围，再对目标毒株进行全长扩增并进行比对。这一筛选、鉴别方法和流程既给新亚型的筛选和发现提供了思路，也降低了经济成本和时间成本，提高了新亚型筛选的效率。


技术实现要素：

5.为了解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供一种筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法，其降低了筛选人类免疫缺陷病毒1型独
特重组型毒株和准流行性重组毒株的成本，将传统的所有待选样本均进行全长扩增测序，更改为易突变区进行扩增分析和筛选，克服了多片段扩增全长导致人工重组的风险，通过技术上的改进让扩增成功率增加。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供一种用于扩增hiv-1全长基因序列的引物，包括巢式pcr第1轮全长基因序列扩增用外引物对、第2轮全长基因序列扩增用内引物对；
8.第1轮全长基因序列扩增用外引物对为of、or，第2轮全长基因序列扩增用内引物对为if、ir；
9.of的核苷酸序列如seq id no.1所示；
10.or的核苷酸序列如seq id no.2所示；
11.if的核苷酸序列如seq id no.3所示；
12.ir的核苷酸序列如seq id no.4所示。
13.本发明的第二方面，提供一种用于扩增hiv-1易发生断点突变区gag、env、pol基因片段的引物，包括巢式pcr第1轮扩增用引物对、第2轮扩增用引物对；3个基因片段区巢式pcr第1轮扩增用引物均使用全长基因序列扩增的外引物of、or；巢式pcr第2轮扩增用引物对中，gag、env、pol基因片段的扩增引物分别对应为gf、gr，ef、er，pf、pr；
14.gf的核苷酸序列如seq id no.5所示；
15.gr的核苷酸序列如seq id no.6所示；
16.ef的核苷酸序列如seq id no.7所示；
17.er的核苷酸序列如seq id no.8所示；
18.pf的核苷酸序列如seq id no.9所示；
19.pr的核苷酸序列如seq id no.10所示。
20.具体而言，of、or、if、ir、gf、gr、ef、er、pf、pr的核苷酸序列分别如下：
21.of：5
’‑
aaagcttgccttgagtgctt-3’；
22.or：5
’‑
ttaagcagtgggttcccttg-3’；
23.if：5
’‑
gcccgtctgtgttaggactc-3’；
24.ir：5
’‑
ggctcgacctggtctaacaa-3’；
25.gf：5
’‑
aggtgcacacagcaagagg-3’；
26.gr：5
’‑
cctccaattccccctatcat-3’；
27.ef：5
’‑
catattgtgagattaatrrm-3’；
28.er：5
’‑
tggagctgtttaatgccccaga-3’；
29.pf：5
’‑
aacagggttgttggaaatgc-3’；
30.pr：5
’‑
tgatcctttccatccctgtg-3’。
31.本发明的第三方面，提供一种筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法，先根据基因片段序列初筛出疑似新亚型的毒株，再针对性扩增这些毒株的全长序列，进一步确定重组断点和建立进化树比对，最终综合判断是否为新的urfs或crfs。
32.具体步骤如下：
33.初筛的方法：
34.为了防止在初筛过程中因分段扩增发生人工重组，逆转录后，巢式pcr的第1轮扩增采用全长基因序列扩增，第2轮针对各个基因片段的扩增采用片段扩增。
35.由于样本中hiv-1含量极少，很难通过1轮扩增的产物就能达到测序所需的量，一般采用巢式pcr法进行两轮扩增。第1轮扩增用外引物组的of、or具有序列表seq id no.1、seq id no.2的碱基序列。第2轮的扩增建立在第1轮的基础上，使用gag、env、pol 3个基因区的内引物分别扩增并进行测序分析。gag、env、pol3个基因区的内引物gf、gr、ef、er、pf、pr具有序列表seq id no.5～seq id no.10的碱基序列。对3个基因区的序列做亚型分析，剔除已知亚型毒株，其余毒株做mosaic图，记录断点位置，与已公开的crfs的mosaic图进行再次比对，找出疑似发生新的断点的毒株进入下一步全长扩增确认。
36.新的urfs毒株或crfs毒株的确认：
37.使用扩增全长基因序列的引物，对筛选出的疑似新亚型毒株进行全长扩增。对全长序列拼接后做mosaic图，记录断点位置和亚型，并建立进化树，与已有的crfs的mosaic图进行比对，综合判断是否为新的urfs。当筛选和确认为urfs毒株时，同一种urfs毒株的数量≥3时，在人群中构成了流行趋势，初步判定为crfs毒株，并将序列上传至hiv sequence database进行最终的判定、命名和公开。鉴于以往文献中全长扩增率低的情况，本发明采用补充体系，在不开盖的情况下，对反应过程中的易失活的酶使用海藻糖进行保护，并使用矿物油对反应体系进行隔热处理，防止补充体系提前消耗或酶失活。
38.本发明提供了一种筛选新的独特重组型毒株(urfs)或流行重组型毒株(crfs)的低成本高效率的流程和方法，并克服了传统全长扩增时采用分片段扩增后拼接成全长而易导致人工重组的风险，通过上述技术上的改进，本发明直接扩增全长且提高了全长扩增效率和成功率，本发明提供的上述方法在筛选和鉴别新urfs毒株或crfs毒株时更加精准可靠，为监控hiv-1毒株重组和演化提供了基础技术支持。
39.本发明的第四方面，提供一种上述引物组的应用。
40.本发明提供的引物组参考了流行毒株和重组毒株的序列，在保守区域设计引物，可以实现对不同hiv亚型进行扩增。所述引物组在扩增hiv-1全长基因和扩增突变区时使用。
41.在扩增全长基因序列时，采用2套引物进行巢式pcr扩增。
42.先反转录全长序列，再使用巢式pcr扩增全长序列。巢式pcr第1轮的扩增引物为of、or，巢式pcr第2轮扩增引物为if和ir。
43.具体包括如下步骤：
44.s1、提取样本病毒rna；
45.s2、进行全长反转录为cdna，反转录进行一段时间后中断，在不开盖的情况下，颠倒混匀后将盖子内侧补充体系甩入反应体系继续反应，以保证酶长时间反应中的活性和保真度；
46.s3、使用上述外引物of、or对hiv-1全长基因序列进行第1轮巢式pcr扩增，扩增进行一段时间后中断，在不开盖情况下，颠倒混匀后将盖子上补充体系瞬离甩入反应体系继续扩增反应，用于克服长片段扩增时，酶的保真度和活性的降低；
47.s4、用上述内引物if和ir进行巢式pcr的第2轮扩增，扩增进行一段时间后中断，在不开盖情况下，颠倒混匀后将盖子内侧补充体系瞬离甩入反应体系继续扩增反应，用于克
服长片段扩增时，酶的保真度和活性的降低；
48.s5、将巢式pcr第2轮扩增产物进行电泳，电泳结果在目标条带位置9kbp的样本进行测序，并拼接序列进行分析。
49.优选地，步骤s1中，提取样本病毒rna可使用市场化的自动抽提仪或人工柱式抽提法。
50.优选地，步骤s2中，对hiv-1全长进行反转录体系如下：该步骤中为双体系，包括体系1和体系2：体系1为常规的逆转录反应体系，体系2为补充体系。20μl体系1为dntp(10mm)1.2μl，10x buffer 2.0μl，superscriptaseⅲ1μl，rnase inhibitor 0.4μl，引物选择oligo-dt(50mm)0.8μl，病毒rna模板14.6μl。体系2为superscriptaseⅲ1μl，10％的海藻糖4μl。
51.其中，体系1加至反应管管底，矿物油加至体系1上方用于隔热，体系2加至反应管的盖体内侧。反应管中的体系1在48℃下反应90分钟(选择不使用热盖，以防体系2中的酶失活)后，然后在不开盖情况下，颠倒混匀后将体系2瞬离到反应管的管底，对混匀后的体系在48℃下补充反应90分钟。
52.体系2对体系1的补充原因为在反转录全长片段时，酶在长时间加热反应中保真度和活性降低，通过体系2的补充，保证反转录的产物量和产物长度。
53.优选地，步骤s3中，第1轮的pcr全长扩增，为了保障长时间加热反应时酶的活性和保真度，仍然采用反应体系1和补充体系2进行双体系扩增。其中taq酶使用专门扩增长片段的hot start la taq酶。反应体系1为：10*buffer 2.5μl，mgcl25μl，dntp 2.5μl，20μm引物of 0.5μl，20μm引物or 0.5μl，hot start la taq酶0.5μl，ddh2o 8.5μl，步骤s2中反转录的cdna模板5μl。补充体系2为：hot start la taq酶1μl，10％海藻糖4μl。
54.反应体系1加在反应管底部，在反应体系1上方加20μl矿物油用于隔热，补充体系2加在反应管的盖体内侧。
55.第1轮pcr扩增程序为：94℃3分钟；94℃15秒，68℃10分钟，20cycles；选择不使用热盖，颠倒混匀后将盖体内的补充体系2离心到反应管管底的反应体系1中，设置扩增程序为：94℃15秒，68℃10分钟，15cycles。
56.优选地，步骤s4中，巢式pcr第2轮扩增，为了保障长时间加热反应时酶的活性和保真度，仍然采用反应体系1和补充体系2进行双体系扩增。其中taq酶使用专门扩增长片段的hot start la taq酶。由于全长扩增的第2轮pcr产物用于28次测序，采用100μl反应体系1为：10*buffer 10μl，mgcl220μl，dntp 10μl，20μm引物if 2μl，20μm引物ir 2μl，hot start la taq酶2μl，ddh2o 34μl，步骤s3中的第1轮产物为模板20μl。补充体系2为10μl：hot start la taq酶2μl，10％海藻糖8μl。
57.反应体系1加在反应管底部，在反应体系1上方加20μl矿物油用于隔热，补充体系2加在反应管的盖体内侧。
58.第2轮pcr扩增程序为：94℃3分钟；94℃15秒，68℃10分钟，20cycles；选择不使用热盖，取出混匀后，将盖体内的补充体系2瞬离到反应管管底的反应体系1中，设置扩增程序为：94℃15秒，68℃10分钟，15cycles。
59.根据扩增和拼接的全长序列绘制mosaic图和建立进化树，并根据mosaic图的断点、亚型以及进化树分支、亲缘关系等综合判断是否为新的urfs毒株或crfs毒株。
60.优选地，步骤s5中的测序引物，使用常规的测全长的引物，见列表1。由于一代测序技术限制，一个反应的有效测序长度一般在900bp左右，或者更短，所以采取叠加测序的方式进行多个片段测序并进行拼接。测序引物见表1，属于通用的常规测序反应。将测序结果使用软件lasergene中的seqman程序进行拼接，将拼接后序列以fasta格式导出，并进行重组分析，鉴定断点位置和绘制mosaic图，建立进化树，综合判断所扩增的序列是否为新的urfs毒株或crfs毒株。
61.表1测序使用的常规测序引物
62.[0063][0064]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0065]
(1)本发明中的筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法，其在大量样本中先进行亚型筛选和不同基因区的mosaic图谱的对比，剔除已知亚型和已知mosaic图谱的毒株，再针对一些疑似新亚型毒株进行全长扩增，锁定和减小目标范围，再对目标毒株进行全长扩增并进行比对；这一方法和流程既给新亚型的筛选和发现提供了思路，也降低了经济成本和时间成本，提高了新亚型筛选的效率；
[0066]
(2)大部分文献目前鉴别出的新的urfs或crfs，一般只做最终的判别，并未详细介绍大量样本中筛选的方法，或者是对所有样本扩增了全长序列后进行筛选，比较费时费力，扩增和测序成本也很高，且一些文献报道全长扩增率仅仅只有66％。传统全长扩增时分段扩增易发生人工重组的风险，产生的全长序列有一定的概率来自准种中的不同毒株。本发明采用首轮全长扩增，第2轮仅扩增容易发生断点和突变的区域，并根据断点和亚型进行初筛后再进行全长扩增，防止发生人工重组的发生，使得扩增出来的基因为同一毒株的基因片段。另外，传统方法分段扩增的原因也是因为直接扩增全长时间久，taq酶易失活或低效，降低了长片段扩增的成功率，本发明在扩增技术上采用加入补充体系的方法，提高了扩增全长的成功率，且在补充体系里加入海藻糖有效地保护了酶，保障了酶的活性和保真度，且在扩增过程中不开盖防止了污染，具有更高的灵敏度和扩增成功率；
[0067]
(3)本发明提供的筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法，其具有低成本、高效率的特点，将传统的所有待选样本均进行全长扩增，更改为易突变区进行扩增分析和筛选，缩小了需要扩增全长的目标范围，更有针对性地进行扩增和分析，克服了多片段扩增全长导致人工重组的风险，通过技术上的改进让扩增成功率增加，整个筛选、鉴别流程清晰详细，更有应用价值，具有高强的实践应用价值。
附图说明
[0068]
下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0069]
图1为大样本筛选时，同一样品gag、env、pol的mosaic图以及断点与亚型特征(展示了部分样品)；
[0070]
图2为几例疑似新urfs或crfs的样本毒株全长基因组mosaic图以及断点和亚型分析图(展示了部分样品)；
[0071]
图3为几例疑似新urfs或crfs的样本毒株与已发现的参考毒株建立的全基因组进化树。
具体实施方式
[0072]
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
[0073]
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0074]
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
[0075]
实施例1
[0076]
本实施例提供一种根据基因片段序列初筛出疑似新亚型的毒株的方法和流程。
[0077]
初筛先使用反转录全长序列，第1轮pcr扩增全长序列，第2轮pcr扩增一些容易发生断点和突变的基因序列。
[0078]
巢式pcr第1轮扩增引物为of、or，巢式pcr第2轮扩增gag、env、pol基因中容易发生断点和突变的基因片段，使用扩增引物依次分别为gf和gr、ef和er、pf和pr。
[0079]
of的核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0080]
or的核苷酸序列如seq id no.2所示；
[0081]
gf的核苷酸序列如seq id no.5所示；
[0082]
gr的核苷酸序列如seq id no.6所示；
[0083]
ef的核苷酸序列如seq id no.7所示；
[0084]
er的核苷酸序列如seq id no.8所示；
[0085]
pf的核苷酸序列如seq id no.9所示；
[0086]
pr的核苷酸序列如seq id no.10所示；
[0087]
具体而言，of、or、gf、gr、ef、er、pf、pr的核苷酸序列分别如下：
[0088]
of：5
’‑
aaagcttgccttgagtgctt-3’；
[0089]
or：5
’‑
ttaagcagtgggttcccttg-3’；
[0090]
gf：5
’‑
aggtgcacacagcaagagg-3’；
[0091]
gr：5
’‑
cctccaattccccctatcat-3’；
[0092]
ef：5
’‑
catattgtgagattaatrrm-3’；
[0093]
er：5
’‑
tggagctgtttaatgccccaga-3’；
[0094]
pf：5
’‑
aacagggttgttggaaatgc-3’；
[0095]
pr：5
’‑
tgatcctttccatccctgtg-3’；
[0096]
本实施例中提供的引物组参考了hiv database里各种流行毒株，根据hiv病毒亚型的序列进行多序列比对寻找到不同亚型的保守区域。在保守区域设计引物，可以实现对不同hiv亚型进行扩增。hiv-1变异性大，保守区位置发生个别碱基突变时，本发明引进了简并碱基(混合碱基)，以保证不同亚型在引物区域发生碱基突变时能很好地与模板结合。引物ef中的m为a/c,r为a/g。
[0097]
本实施例还提供了筛选出疑似新urfs或crfs的高效且更加精准的方法和流程，包括如下步骤：
[0098]
s1、提取样本病毒rna；
[0099]
s2、进行反转录为cdna，反转录进行一段时间后中断，在不开盖的情况下，颠倒混匀后将盖子内侧补充体系甩入反应体系继续反应，以保证酶长时间反应中的活性和保真度；
[0100]
s3、使用上述外引物of、or对hiv-1全长基因序列进行第一轮pcr，扩增进行一段时间后中断，在不开盖的情况下，颠倒混匀后将盖子内侧补充体系甩入反应体系继续扩增，用于克服长片段扩增时，时间久导致酶的保真度和活性的降低；
[0101]
s4、使用上述内引物gf和gr、ef和er、pf和pr对hiv-1基因中容易发生断点和突变的基因片段gag、env、pol进行扩增；
[0102]
s5、将巢式pcr第2轮扩增产物进行电泳，电泳结果在目标条带位置的样本进行测序，并拼接序列进行分析。
[0103]
优选地，步骤s1中，提取样本病毒rna可使用市场化的自动抽提仪或人工柱式抽提法。
[0104]
优选地，步骤s2中，对hiv-1全长进行反转录体系如下：该步骤具有2个体系，体系1为逆转录体系，体系2为补充体系。体系1为20μl，成分为dntp(10mm)1.2μl，10x buffer2.0μl，superscriptaseⅲ1ul，rnase inhibitor 0.4ul，引物选择oligo-dt(50mm)0.8μl，病毒rna模板14.6μl。空白对照采用等体积的去离子水代替模板。体系2为5μl，成分为superscriptaseⅲ1ul，10％海藻糖4μl。
[0105]
体系1加在反应管管底，体系1和体系2之间使用矿物油进行隔热，体系2加在管盖内侧。体系1在48℃下反应90分钟(选择不使用热盖，以防体系2中的酶失活)后，不开盖，颠倒混匀后将体系2瞬离到管底，并将混匀后的体系在48℃下进行补充反应90分钟。采用体系2对体系1的补充原因为在反转录全长片段时，酶在长时间加热反应中保真度和活性降低，通过体系2的补充，保证反转录的产物量和产物长度。
[0106]
优选地，步骤s3中，第1轮的pcr全长扩增，为了保障长时间加热反应时酶的活性和保真度，仍然采用反应体系1和补充体系2进行双体系扩增。其中taq酶使用专门扩增长片段的hot start la taq酶。25μl反应体系1，其成分为：10*buffer 2.5μl，mgcl25μl，dntp 2.5μl，20μm引物of 0.5μl，20μm引物or 0.5μl，hot start la taq酶0.5μl，ddh2o 8.5μl，步骤s2中反转录的cdna模板5μl。空白对照采用等体积的去离子水代替模板。补充体系2为5μl，成分为hot start la taq酶1μl，10％海藻糖4μl。
[0107]
反应体系1加在反应管底部，在反应体系1上方加20μl矿物油用于隔热，补充体系2加在反应管的盖体内侧。
[0108]
第1轮pcr扩增程序为：94℃3分钟；94℃15秒，68℃10分钟，20cycles；选择不使用热盖，取出颠倒混匀后，将盖体内的补充体系2离心到反应管管底的反应体系1中，设置扩增程序为：94℃15秒，68℃10分钟，15cycles。
[0109]
优选地，步骤s4中，使用内引物gf和gr、ef和er、pf和pr，对hiv-1基因中容易发生断点和突变的基因片段gag、env、pol进行巢式pcr第2轮扩增的体系如下：第2轮扩增使用的模板为第1轮的扩增产物，使用试剂为premixtaq
tm
。该步骤的扩增产物用于测序，50μl反应总体系1，其成分为premix taq 25μl，20μm上游内引物1μl，20μm下游内引物1μl，去离子水18μl，模板(第1轮扩增产物)5μl。当扩增gag时，扩增、测序引物为gf和gr；当扩增env时，扩增、测序引物为ef和er；当扩增pol时，扩增、测序引物为pf和pr。空白对照采用等体积的去离子水代替模板。
[0110]
巢式pcr第2轮扩增程序为：94℃3分钟；94℃5秒，55℃5秒，72℃1分钟，30cycles；热盖温度为105℃。
[0111]
将测序结果使用软件lasergene中的seqman程序进行拼接，将拼接后序列以fasta格式导出。gag、env、pol 3个基因区均成功扩增和测序成功的有321个毒株。剔除已知亚型的样本序列，剩余为110个毒株。将剩余序列进行综合判断所扩增的序列是否疑似为新的
urfs或crfs，将剩余序列与已知crfs的mosaic图相同或者进化树中分支在相同末端的同源性序列进行剔除，保留有新的mosaic图和不同的进化树分支毒株，最后为42个毒株。见图1，同一样品env、gag、pol的mosaic图。mosaic图中原本不同颜色代表不同的亚型，变为黑白图后，由不同的灰度进行区分。根据图1中容易发生突变的基因区域的mosaic图与已公布的crfs的mosaic图进行比对，并没有相同或者相似，疑似是一种新的断点方式。由于篇幅问题，图1展示了部分筛选出来的疑似新urfs毒株。
[0112]
实施例2
[0113]
本实施例提供一种扩增备选毒株全基因序列的方法和流程，以及进行urfs或crfs辨别的方法和流程。
[0114]
本实施例中，先使用反转录全长序列，再使用巢式pcr扩增全长序列。巢式pcr第1轮扩增引物为of、or，巢式pcr第2轮扩增引物为if和ir。
[0115]
s1、提取样本病毒rna(同实施例1)；
[0116]
s2、进行全长反转录为cdna，反转录进行一段时间后中断，在不开盖的情况下，颠倒混匀后将盖子内侧补充体系甩入反应体系继续反应，以保证酶长时间反应中的活性和保真度(同实施例1)；
[0117]
s3、使用上述外引物of、or对hiv-1全长基因序列进行第1轮巢式pcr扩增，扩增进行一段时间后中断，在不开盖情况下，颠倒混匀后将盖子上补充体系甩入反应体系继续扩增反应，用于克服长片段扩增时，酶的保真度和活性的降低(同实施例1)；
[0118]
s4、用上述内引物if和ir进行巢式pcr的常规第2轮扩增，扩增进行一段时间后中断，在不开盖情况下，颠倒混匀后将盖子上补充体系甩入反应体系继续扩增反应，用于克服长片段扩增时，酶的保真度和活性的降低；
[0119]
s5、将巢式pcr第2轮扩增产物进行电泳，电泳结果在目标条带位置9kbp的样本进行测序，并拼接序列进行分析。
[0120]
优选地，步骤s1中，提取样本病毒rna可使用市场化的自动抽提仪或人工柱式抽提法。
[0121]
优选地，步骤s2中，对hiv-1全长进行反转录体系如下：该步骤中为双体系，包括体系1和体系2：体系1为常规的逆转录反应体系，体系2为补充体系。体系1为dntp(10mm)1.2μl，10x buffer 2.0μl，superscriptaseⅲ1μl，rnase inhibitor 0.4μl，引物选择oligo-dt(50mm)0.8μl，病毒rna模板14.6μl。体系2为superscriptaseⅲ1μl，10％的海藻糖4μl。
[0122]
其中，体系1加至反应管管底，矿物油加至体系1上方用于隔热，体系2加至反应管的盖体内侧。反应管中的体系1在48℃下反应90分钟(选择不使用热盖，以防体系2中的酶失活)后，然后在不开盖情况下，颠倒混匀后将体系2混匀瞬离到反应管的管底，对混匀后的体系在48℃下补充反应90分钟。
[0123]
体系2对体系1的补充原因为在反转录全长片段时，酶在长时间加热反应中保真度和活性降低，通过体系2的补充，保证反转录的产物量和产物长度。
[0124]
优选地，步骤s3中，第1轮的pcr全长扩增，为了保障长时间加热反应时酶的活性和保真度，仍然采用反应体系1和补充体系2进行双体系扩增。其中taq酶使用专门扩增长片段的hot start la taq酶。反应体系1为：10*buffer 2.5μl，mgcl25μl，dntp 2.5μl，20μm引物of 0.5μl，20μm引物or 0.5μl，hot start la taq酶0.5μl，ddh2o 8.5μl，步骤s2中反转录
的cdna模板5μl。补充体系2为：hot start la taq酶1μl，10％海藻糖4μl。
[0125]
反应体系1加在反应管底部，在反应体系1上方加20μl矿物油用于隔热，补充体系2加在反应管的盖体内侧。
[0126]
第1轮pcr扩增程序为：94℃3分钟；94℃15秒，68℃10分钟，20cycles；选择不使用热盖，取出颠倒混匀后，将盖体内的补充体系2离心到反应管管底的反应体系1中，设置扩增程序为：94℃15秒，68℃10分钟，15cycles。
[0127]
优选地，步骤s4中，巢式pcr第2轮扩增，为了保障长时间加热反应时酶的活性和保真度，仍然采用反应体系1和补充体系2进行双体系扩增。其中taq酶使用专门扩增长片段的hot start la taq酶。由于全长扩增的第2轮pcr产物用于28次测序，采用100μl反应体系1为：10*buffer 10μl，mgcl220μl，dntp 10μl，20μm引物if 2μl，20μm引物ir 2μl，hot start la taq酶2μl，ddh2o 34μl，步骤s3中的第1轮产物为模板20μl。补充体系2为10μl：hot start la taq酶2μl，10％海藻糖8μl。
[0128]
反应体系1加在反应管底部，在反应体系1上方加20μl矿物油用于隔热，补充体系2加在反应管的盖体内侧。
[0129]
第2轮pcr扩增程序为：94℃3分钟；94℃15秒，68℃10分钟，20cycles；选择不使用热盖，取出颠倒混匀后，将盖体内的补充体系2离心到反应管管底的反应体系1中，设置扩增程序为：94℃15秒，68℃10分钟，15cycles。
[0130]
对实施例1中筛选到的疑似新亚型的42例毒株，进行全长扩增后获得35例全长基因序列。使用全长测序引物(见表1)，对每个毒株进行28次测序，并进行序列拼接。根据拼接的全长序列绘制mosaic图和建立进化树，并根据mosaic图的断点、亚型以及进化树分支、亲缘关系等综合判断是否为新的urfs毒株或crfs毒株。
[0131]
断点和亚型分析结果见表格2
～
5，其展示了4个扩增的全基因序列的断点起止位置(由于篇幅仅展示了部分毒株结果)，以及片段的亚型，与已公布的132例crfs进行比对后，为新的urfs；图2的4个毒株的全长mosaic图显示，与已公布的132例进行比对后，被判定为新的urfs；将筛选到的urfs与参考毒株一起建立进化树(仅展示了其中9例结果，见图3)，yn211与crf86_bc在同一分支末端具有同源性，排除其为新urfs。mosaic图中原本不同颜色代表不同的亚型，变为黑白图后，由不同的灰度进行区分。进化树里yn开头的其余8例，单独形成进化分支，与参考毒株之间没有同源性，被判定为新的urfs。当每株新的urfs的数量达到3例以及3例以上时，上传至hiv circulating recombinant forms(crfs)网站进行最后的评价和命名。本实施例中yn242/yn306之间、yn381/yn417之间具有同源性(见图3)，每组数量达到2例，当发现有新的同源毒株时，即可上传网站进行最后的评价、确认和新crfs的命名。
[0132]
表2 yn242断点及亚型分析
[0133]
[0134][0135]
表3yn205断点及亚型分析
[0136][0137]
表4yn211断点及亚型分析
[0138]
[0139][0140]
表5yn233断点及亚型分析
[0141][0142]
对比例1
[0143]
不同病毒载量的样本，分别在不使用补充体系和使用补充体系条件下的全长扩增实验结果对比：分别在病载《103copies/ml、10
3-105copies/ml、》106copies/ml的范围内选10例样本进行2种方法的比较。
[0144]
使用补充体系的方法采用如上述实施例2的扩增方法和流程。
[0145]
不使用补充体系的常规扩增方法如下：
[0146]
先进行反转录，30μl反转录体系为：dntp 1.8μl，oligo-dt 1.2μl，5x buffer 6.0μl，0.1m dtt 2.4μl，逆转录酶1.2μl，rnase inhibitor 0.6μl，ddh2o 1.8μl，rna 15.0μl。反应条件为45℃1.5小时。
[0147]
巢式pcr第1轮扩增反应体系为：2
×
la mixture 25μl，10pmol/μl上游外引物1μl，下游外引物10pmol/ul 1μl，反转录的cdna 5μl，去离子水18μl。
[0148]
巢式pcr第2轮扩增反应体系为：2
×
la mixture 25μl，10pmol/μl上游内引物1μl，10pmol/ul下游内引物1μl，反转录的cdna 5μl,去离子水18μl。
[0149]
巢式pcr的两轮扩增反应条件均为：94℃2分钟；94℃10秒，68℃9分钟，30cycles；热盖温度为105℃。
[0150]
测试结果见表6。
[0151]
表6常规法与双体系法进行全长扩增的对比实验结果
[0152] 《103copies/ml10
3-106copies/ml》106copies/ml常规法1/103/106/10双体系法3/107/109/10
[0153]
表6中实验结果表明：本发明中采用双体系法在不同的病毒载量范围均比常规法的扩增成功率高；尤其是在《103copies/ml、10
3-106copies/ml这两范围里，使用本发明的补充体系，在提高了扩增的成功率又更明显的提高检测灵敏度。说明本发明中的扩增引物和补充体系的扩增方法针对中低病毒载量的实验中，比常规的方法有更高的敏感度和扩增效率。
[0154]
综上，本发明采用首轮全长扩增，第2轮仅扩增容易发生断点和突变的区域，并根据断点和亚型进行初筛后再针对疑似新亚型毒株进行全长扩增，防止发生人工重组的发生，使得扩增出来的基因为同一毒株的基因片段。另外，传统方法分段扩增的原因也是因为直接扩增全长时间久，taq酶易失活或低效，降低了长片段扩增的成功率，本发明在扩增技术上采用加入补充体系的方法，提高了扩增全长的成功率，且在补充体系里加入海藻糖有效地保护了酶，保障了酶的活性和保真度，且在扩增过程中不开盖防止了污染，具有更高的灵敏度和扩增成功率。
[0155]
本发明提供的筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法，其具有低成本、高效率的特点，相比传统的对每个样本进行全长扩增和测序而言，更改为对易突变区进行扩增分析和筛选，提高了筛选效率，通过初筛能从大量备选样本中筛查到疑似新亚型，把扩增全长的目标范围缩小，更有针对性得进行扩增和分析，整个筛选流程清晰详细，更有应用价值，具有更强的实践应用价值。
[0156]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

技术特征：
1.一种用于扩增hiv-1全长基因序列的引物，其特征在于，包括巢式pcr第1轮全长基因序列扩增用外引物对、第2轮全长基因序列扩增用内引物对；第1轮全长基因序列扩增用外引物对为of、or，第2轮全长基因序列扩增用内引物对为if、ir；of的核苷酸序列如seq id no.1所示；or的核苷酸序列如seq id no.2所示；if的核苷酸序列如seq id no.3所示；ir的核苷酸序列如seq id no.4所示。2.一种用于扩增hiv-1易发生断点突变区gag、env、pol基因片段的引物，其特征在于，包括巢式pcr第1轮扩增用引物对、第2轮扩增用引物对；3个基因片段区巢式pcr第1轮扩增用引物均使用全长基因序列扩增的外引物of、or；巢式pcr第2轮扩增用引物对中，gag、env、pol基因片段的扩增引物分别对应为gf、gr，ef、er，pf、pr；gf的核苷酸序列如seq id no.5所示；gr的核苷酸序列如seq id no.6所示；ef的核苷酸序列如seq id no.7所示；er的核苷酸序列如seq id no.8所示；pf的核苷酸序列如seq id no.9所示；pr的核苷酸序列如seq id no.10所示。3.一种筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法，其特征在于，首先，对如权利要求2中扩增出来的易发生断点突变的基因序列进行基因亚型分析，筛选掉已知基因亚型后，其余疑似新亚型的样本序列，使用jphmm进行断点位置鉴定并绘制mosaic图，进行二次筛选，将与已知crfs的mosaic图相同的筛选掉，保留疑似新亚型的样本。4.根据权利要求3所述的筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法，其特征在于，当筛选出疑似新亚型的样本时，进行全长基因序列扩增，将全长基因序列使用jphmm进行断点位置鉴定并绘制mosaic图，与参考序列一起建立进化树，根据mosaic图和进化树结果综合判断是否为新的urfs毒株。5.根据权利要求4所述的筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法，其特征在于，当筛选和确认为urfs毒株时，同一种urfs毒株的数量≥3时，在人群中构成了流行趋势，初步判定为crfs毒株，并将序列上传至hivsequencedatabase进行最终的判定、命名和公开。6.一种高效的防止人工重组的全长基因序列扩增方法，其特征在于，部分步骤采用双体系进行扩增，具体包括如下步骤：s1、提取样本病毒rna；s2、进行全长反转录为cdna，反转录进行一段时间后中断，在不开盖的情况下，颠倒混匀后将盖子内侧补充体系甩入反应体系继续反应，以保证酶长时间反应中的活性和保真度；s3、使用上述外引物of、or对hiv-1全长基因序列进行第1轮巢式pcr扩增，扩增进行一段时间后中断，在不开盖情况下，颠倒混匀后将盖子内侧补充体系甩入反应体系继续扩增
反应，用于克服长片段扩增时，酶的保真度和活性的降低；s4、用上述内引物if和ir进行巢式pcr的第2轮扩增，扩增进行一段时间后中断，在不开盖情况下，颠倒混匀后将盖子内侧补充体系甩入反应体系继续扩增反应，用于克服长片段扩增时，酶的保真度和活性的降低；s5、将巢式pcr第2轮扩增产物进行电泳，电泳结果在目标条带位置9kbp的样本进行测序，并拼接序列进行分析。7.根据权利要求6所述的高效的防止人工重组的全长基因序列扩增方法，其特征在于，所述步骤s2中的双体系包括体系1和体系2：体系1为常规的逆转录反应体系，体系2为补充体系；体系2包括superscriptaseⅲ1μl，10％的海藻糖4μl；其中，体系1加至反应管管底，矿物油加至体系1上方用于隔热，体系2加至反应管的盖体内侧。8.根据权利要求7所述的高效的防止人工重组的全长基因序列扩增方法，其特征在于，所述步骤s2中，反应管中的体系1在48℃下反应90分钟，选择不使用热盖，以防体系2中的酶失活，然后在不开盖情况下，颠倒混匀后将盖体内侧的体系2瞬离到反应管的管底，对混匀后的体系在48℃下补充反应90分钟。9.根据权利要求6所述的高效的防止人工重组的全长基因序列扩增方法，其特征在于，所述步骤s3和s4中，第1轮pcr扩增和第2轮pcr扩增均采用反应体系1和补充体系2进行双体系扩增；步骤s3补充体系2包括hotstartlataq酶1μl，10％的海藻糖4μl；步骤s4补充体系2包括hotstartlataq酶2μl，10％的海藻糖8μl；其中，反应体系1加至反应管管底，矿物油加在反应体系1上方用于隔热，补充体系2加在反应管的盖体内侧。10.根据权利要求6所述的高效的防止人工重组的全长基因序列扩增方法，其特征在于，所述步骤s3中，第1轮pcr扩增程序为：94℃3分钟；94℃15秒，68℃10分钟，20cycles；选择不使用热盖，取出颠倒混匀，将盖体内的补充体系2瞬离到反应管管底的反应体系1中，设置扩增程序为：94℃15秒，68℃10分钟，15cycles；所述步骤s4中，第2轮pcr扩增程序为：94℃3分钟；94℃15秒，68℃10分钟，20cycles；选择不使用热盖，取出颠倒混匀，将盖体内的补充体系2瞬离到反应管管底的反应体系1中，设置扩增程序为：94℃15秒，68℃10分钟，15cycles。

技术总结
本发明公开了一种筛选、鉴别人类免疫缺陷病毒1型独特重组型毒株和流行重组型毒株的方法，其根据HIV-1易发生断点突变区的扩增片段产生的mosaic图，与已公布的CRFs的mosaic图进行比对，筛选出具有新mosaic图的毒株，并建立一种新的高效的防止人工重组的全长基因序列扩增方法，将扩增出来的全长序列与参考序列一起建立进化树，通过同源分析和mosaic图，综合判断是否为URFs，并根据相同URFs的流行毒株数量来进一步判断是否为CRFs。该技术方法具有低成本、高效率的特点，将传统的所有待选样本均进行全长扩增，更改为易突变区进行扩增分析和筛选，克服了多片段扩增全长导致人工重组的风险，通过技术上的改进让扩增成功率增加。通过技术上的改进让扩增成功率增加。通过技术上的改进让扩增成功率增加。


技术研发人员：曹凯 李鑫 曹珊
受保护的技术使用者：上海纳全生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/8/13