一株可缓解类风湿性关节炎的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用

1.本发明涉及一株可缓解类风湿性关节炎的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：：2.类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是一种慢性、长期的自身免疫失调疾病。全球流行病学调查发现，类风湿性关节炎发病高峰年龄段是30-50岁，发病率在发达地区高于欠发达地区，女性高于男性，与日常饮食和生活环境条件密切相关，有一定的遗传性。尽管类风湿关节炎的发病机制目前尚未完全明确，但免疫系统的失调是导致疾病发生、发展的一个重要因素。患者初期呈现关节对称性晨僵、僵硬等特点，随着疾病的发展，病变部位出现肿胀畸形，关节功能丧失，有残疾风险，又被称为“不死的癌症”。目前对类风湿性关节炎的治疗主要包括非甾类抗炎药、糖皮质激素、抗风湿药和生物制剂。在临床治疗中很少使用单一药物治疗，一般联合多种药物来减缓病情。这些药物通常有不良反应或副作用，例如非甾类抗炎药会造成胃肠道和心血管风险，糖皮质激素消炎止痛效果明显但由于负作用众多而不能长期使用，抗风湿药物起效慢，生物制剂疗效好但价格昂贵。在此背景下，有必要开发一种易获取、无不良反应的手段来辅助药物治疗，加强治疗效果。3.类风湿性关节炎作为一种全身性的免疫疾病，与免疫系统的异常反应紧密相关。肠道是机体重要的免疫器官之一，其中有大量微生物生长、繁殖并产生多种代谢产物，这些微生物及其代谢物共同作用建立起了一个正常的活跃的免疫系统。众多的研究发现类风湿性关节炎患者的肠道菌群组成与健康人群显著不同，例如普氏菌prevotellacopri、haemophilus会显著高于正常人群，而双歧杆菌则会变低(具体可见文献：pianta,a.,etal.,evidenceoftheimmunerelevanceofprevotellacopri,agutmicrobe,inpatientswithrheumatoidarthritis.arthritisrheumatol,2017.69(5):p.964-975.)。在一些临床双盲实验中已经证实鼠李糖乳杆菌lgg可降低类风湿性关节炎患者炎症性指标，对疾病有一定的缓解作用。因此，口服益生菌有望作为治疗类风湿性关节炎的辅助干预手段来改善病情。4.因此，需找到一种以益生菌为主要成分的药物或治疗方式，既能够在预防和/或辅助治疗类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)的方面发挥根本上的作用，同时，也不会给类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)患者带来任何潜在的安全隐患，并且，生产成本低廉。技术实现要素：5.本发明提供了一株长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269，所述长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269已于2022年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：62839，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。6.本发明还提供了含有所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的食品、药品或保健品。7.在一种实施方式中，所述食品、药品或保健品中，长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269的活菌数为不低于1×109cfu/ml或1×109cfu/g。8.本发明还提供了所述长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。9.在一种实施方式中，所述预防和/或治疗类风湿性关节炎包括如下至少一种作用：降低关节厚度、降低关节炎特异性抗体的含量、提高血清中骨保护素含量、提高血清中骨钙素含量。10.在一种实施方式中，所述药物含有所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269、药物载体和/或药用辅料。11.在一种实施方式中，所述食品或保健品包括使用含有所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。12.在一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为：将所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养24-48h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水重悬，得到发酵剂。13.在一种实施方式中，所述培养基为mrs培养基。14.本发明还提供了所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269在制备提高骨保护素、骨钙素含量的药物或保健品中的应用。15.在一种实施方式中，所述应用是将长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269作为骨保护素、骨钙素补充剂的主要成分。16.本发明还提供了所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269在制备有助于调节肠道菌群的药物或保健品中的应用。17.在一种实施方式中，所述调节肠道菌群包括但不限于提高乳杆菌属(lactobacillus)和/或瘤胃球菌1(ruminococcus1)的相对丰度。18.在一种实施方式中，所述调节肠道菌群包括下调福涅拉氏菌属(fournierella)的相对丰度的异常升高。19.有益效果：20.1、本发明筛选出了一株长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269，此长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269具有缓解类风湿性关节炎的作用，具体体现在：21.(1)显著降低类风湿性关节炎大鼠的关节厚度、临床评分以及发病率；22.(2)显著降低类风湿性关节炎大鼠血清中促炎性细胞因子tnfα、il-6、il-22和il-23的含量；23.(3)显著降低类风湿性关节炎大鼠血清中关节炎特异性抗体的含量；24.(4)调节类风湿性关节炎大鼠血清中骨保护素和骨钙素的含量；25.(5)在属水平改善类风湿性关节炎大鼠的肠道菌群。26.因此，长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景。27.2、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明筛选得到的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269不会给类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)患者带来任何潜在的安全隐患。28.3、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)的培育过程仅需培养基以及一些培养条件的控制，成本相对低廉，与造价昂贵的生物制剂相比，不会对类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)患者带来太大的经济负担。29.生物材料保藏30.一株长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269，分类学命名为bifidobacteriumlongumsubsp.infantis，已于2022年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：62839，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。附图说明31.图1：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠关节厚度的影响。32.图2：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠临床评分的影响。33.图3：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠体重的影响。34.图4：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠关节病理切片的影响。35.图5：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中il-6和tnf-α含量的影响。36.图6：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中il-22和il-23含量的影响。37.图7：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中cii-总igg的影响。38.图8：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中cii-igg1的影响。39.图9：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中cii-igg2a的影响。40.图10：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中cii-igg2b的影响。41.图11：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中骨保护素的影响。42.图12：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中骨钙素的影响。43.图13：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠粪便中乳杆菌属(lactobacillus)丰度的影响。44.图14：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠粪便中瘤胃球菌1(ruminococcus1)丰度的影响。45.图15：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠粪便中福涅拉氏菌属(fournierella)丰度的影响。具体实施方式46.下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。47.下述实施例中涉及的雌性wistar大鼠购自浙江维通利华公司；下述实施例中涉及的牛ii型胶原蛋白溶液以及弗氏不完全佐剂购自chondrex公司；下述实施例中涉及的检测il-6、tnf-α、il-22、il-23、总ii型胶原特异型抗体igg、ii型胶原特异型抗体igg1、ii型胶原特异型抗体igg2a、ii型胶原特异型抗体igg2b、骨钙素、骨保护素的elisa试剂盒购自森贝伽公司。48.下述实施例中涉及的培养基如下：49.mrs固体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·3h2o2.6g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso40.05g/l、吐温801ml/l、琼脂15g/l。50.mrs液体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·3h2o2.6g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso40.05g/l、吐温801ml/l。51.实施例1：长双歧杆菌婴儿亚种的筛选及菌种鉴定52.1、筛选53.以来源于江苏省无锡市母乳样本，取0.5ml保存于30％(v/v)甘油中的样本在无菌环境下加入装有4.5ml生理盐水的10ml离心管中，得到10-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；分别吸取100μl不同梯度的梯度稀释液涂布于mrs固体培养基上，37℃培养72h，得到稀释涂布平板；挑取稀释涂布平板上的典型菌落分别在mrs固体培养基上划线，37℃培养48h，得到纯化菌落；挑取纯化菌落接种至mrs液体培养基中，37℃培养48h，得到菌株bjswxb6mnim1，命名ccfm1269。54.2、鉴定55.提取ccfm1269的基因组，进行16s扩增，16srdna扩增条件：95℃5min；35个循环(95℃30s，55℃30s，72℃2min)；72℃10min。扩增引物：27f：(5’‑agagtttgatcctggctcag-3’)，1492r：(5’‑tacggctaccttgttacgactt-3’)扩增产物纯化和序列比对过程参考文献《exploringthediversitymofthebifidobacterialpopulationinthehumanintestinaltract》记载的方法进行。将ccfm1269的16srdna进行扩增和测序(由苏州金唯智生物科技有限公司)，将测序分析得到的ccfm1269的16srdna序列在genbank中进行比对，结果显示此菌株为长双歧杆菌婴儿亚种，命名为长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269。56.实施例2：长双歧杆菌婴儿亚种菌悬液的制备57.长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269菌液按如下方法制备：58.蘸取长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269菌液在mrs固体培养基上划线，37℃培养48h，得到单菌落；59.挑取单菌落接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照1％(v/v)的接种量接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到一级种子液；60.将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；61.将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6000g离心15min，收集沉淀；将沉淀用生理盐水缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用生理盐水将乳酸菌菌体重悬至细胞浓度为1×109cfu/ml，得到长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269菌液。62.实施例3：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠体重、关节厚度、临床评分以及发病率的影响63.取6周龄的spf(specificpathogenfree)级雌性wistar大鼠24只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为3组，每组8只，3组分别为：正常组、模型组、灌胃长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269的ccfm1269组。64.实验共四周：从造模前一周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃0.5ml浓度为0.9％(w/w)的无菌生理盐水溶液，ccfm1269组每只每天灌胃0.5ml浓度为1×109cfu/ml的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269菌液；第二周到第三周为造模期，造模第一天时，将牛ii型胶原蛋白溶液(chondrex，20022)与弗氏不完全佐剂(chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。65.造模结束后，通过体重计测定每组大鼠体重，通过螺旋测微器测定每组大鼠关节厚度，通过观察踝和指关节的肿胀、红肿程度测定每组大鼠临床评分、并制作大鼠踝关节的番红-固绿病理切片(具体可见参考文献《integratedserumandfecalmetabolomicsstudyofcollagen-inducedarthritisratsandthetherapeuticeffectsofthezushimatablet》)。测定结果分别见图1-4。66.由图1可知，在首次免疫后2周开始关节发生肿胀，第3周时模型组大鼠的关节厚度显著高于正常组大鼠，ccfm1269组大鼠的关节厚度均低于模型组大鼠，其中，对照组、模型组、和ccfm1269组大鼠的关节厚度分别为4.3、6.7和5.5mm。67.由图2可知，每组大鼠临床评分的变化与关节厚度的变化曲线相似，第2周时临床评分开始增加，直到首次免疫后第3周，模型组的平均评分最高为7.1分，ccfm1269可以显著下调关节炎模型鼠的关节评分到5.6分。68.由图3可知，模型组大鼠的体重首次免疫后第3周显著低于正常组为242.9g，ccfm1269组大鼠体重介于模型组和对照组之间为256g，对照组体重最高为270.9g。69.由图4可知，模型组大鼠的踝关节受损严重，模型组肿胀程度明显高于对照组和ccfm1269组。模型组周围软组织受到明显的炎症浸润(箭头处)；ccfm1269则无明显炎症浸润，表明ccfm1269可以明显缓解踝关节的病理损伤。70.可见，长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269可辅助治疗以及预防风湿性关节炎。71.实施例4：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中il-6和tnf-α含量的影响72.取6周龄的spf(specificpathogenfree)级雌性wistar大鼠24只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为3组，每组8只，3组分别为：正常组、模型组、灌胃长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269的ccfm1269组。73.实验共四周：从造模前一周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃0.5ml浓度为0.9％(w/w)的无菌生理盐水溶液，ccfm1269组每只每天灌胃0.5ml浓度为1×109cfu/ml的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269菌液；第二周到第三周为造模期，造模第一天时，将牛ii型胶原蛋白溶液(chondrex，20022)与弗氏不完全佐剂(chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。74.造模结束后，取血并处死大鼠，取大鼠血清，通过elisa试剂盒测定每组大鼠血清中il-6、tnf-α、il-22、il-23的含量，检测结果见图5-6。75.如图5所示，模型组大鼠血清中il-6的浓度为261ng/l，比正常组(121ng/l)显著升高；相比于模型组大鼠，ccfm1269组大鼠血清中il-1β水平显著降低至179ng/l。模型组大鼠血清中tnf-α的浓度为368ng/l，比正常组(190ng/l)显著升高；相比于模型组大鼠，ccfm1269组大鼠血清中tnf-α水平显著降低至259ng/l。76.如图6所示，模型组大鼠血清中il-22的浓度为29.3ng/l，比正常组(19.8ng/l)显著增高；相比于模型组大鼠，ccfm1269组大鼠血清中il-22水平显著降低至18.4ng/l。模型组大鼠血清中il-22的浓度为55.8ng/l，比正常组(37.3ng/l)显著增高；相比于模型组大鼠，ccfm1269组大鼠血清中il-22水平显著降低至46.7ng/l。77.可见，长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269可降低类风湿性关节炎大鼠血清中促炎因子il-6、tnf-α、il-22和il-23的水平。78.实施例5：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中ii型胶原特异型抗体igg亚型含量的影响79.取6周龄的spf(specificpathogenfree)级雌性wistar大鼠24只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为3组，每组8只，3组分别为：正常组、模型组、灌胃长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269的ccfm1269组。80.实验共四周：从造模前一周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃0.5ml浓度为0.9％(w/w)的无菌生理盐水溶液，ccfm1269组每只每天灌胃0.5ml浓度为1×109cfu/ml的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269菌液；第二周到第三周为造模期，造模第一天时，将牛ii型胶原蛋白溶液(chondrex，20022)与弗氏不完全佐剂(chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。81.造模结束后，取血并处死大鼠，取大鼠血清，通过elisa试剂盒测定每组大鼠血清中总ii型胶原特异型抗体igg、ii型胶原特异型抗体igg1、ii型胶原特异型抗体igg2a、ii型胶原特异型抗体igg2b的含量，ii型胶原特异型抗体的水平高低反映了大鼠关节炎症状的强弱。检测结果见图7-10。82.如图7所示，模型组大鼠总ii型胶原特异型抗体igg的浓度为9.67μg/l，比正常组(7.59μg/l)显著升高；相比于模型组大鼠，ccfm1269组大鼠血清中总ii型胶原特异型抗体igg的水平显著降低至7.56μg/l与正常水平接近。83.如图8所示，模型组大鼠ii型胶原特异型抗体igg1的浓度为6.89μg/l，比正常组(5.19μg/l)显著升高；相比于模型组大鼠，ccfm1269组大鼠血清中ii型胶原特异型抗体igg1的水平显著降低至5.38μg/l，接近正常水平。84.如图9所示，模型组大鼠ii型胶原特异型抗体igg2a的浓度为3.04μg/l，比正常组(1.71μg/l)显著升高；相比于模型组大鼠，ccfm1269组大鼠血清中ii型胶原特异型抗体igg2a的水平显著降低至2.39μg/l。85.如图10所示，模型组大鼠ii型胶原特异型抗体igg2b的浓度为1.75μg/l，比正常组(1.18μg/l)显著升高；相比于模型组大鼠，ccfm1269组大鼠血清中ii型胶原特异型抗体igg2b的水平显著降低至1.34μg/l，接近正常水平。86.可见，长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269可降低类风湿性关节炎大鼠血清中总ii型胶原特异型抗体igg、ii型胶原特异型抗体igg1、ii型胶原特异型抗体igg2a、ii型胶原特异型抗体igg2b的含量，从而缓解大鼠关节炎的症状。87.实施例6：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠血清中骨保护素和骨钙素含量的影响88.取6周龄的spf(specificpathogenfree)级雌性wistar大鼠24只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为3组，每组8只，3组分别为：正常组、模型组、灌胃长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269的ccfm1269组。89.实验共四周：从造模前一周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃0.5ml浓度为0.9％(w/w)的无菌生理盐水溶液，ccfm1269组每只每天灌胃0.5ml浓度为1×109cfu/ml的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269菌液；第二周到第三周为造模期，造模第一天时，将牛ii型胶原蛋白溶液(chondrex，20022)与弗氏不完全佐剂(chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。90.造模结束后，取血并处死大鼠，取大鼠血清，通过elisa试剂盒测定每组大鼠血清中骨保护素和骨钙素的含量，骨保护素在阻止类风湿性关节炎导致的骨质破坏中发挥着重要的作用。骨钙素水平反映了风湿性关节炎的疾病进程。血清骨钙素水平明显下降，表明成骨细胞活性下降，且骨转换率降低。检测结果见图11-12。91.如图11所示，模型组大鼠血清骨保护素的浓度为325ng/l，显著低于正常组(438ng/l)和ccfm1269组(482ng/l)。92.如图12所示，模型组大鼠血清骨钙素的浓度为2.12ng/l，显著低于正常组(3.21ng/l)和ccfm1269组(3.38ng/l)。93.可见，长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269可改善类风湿性关节炎大鼠血清中骨保护素和骨钙素的含量，并具有增加血清中骨保护素和骨钙素含量的作用。94.实施例7：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对类风湿性关节炎大鼠粪便中菌群丰度的影响95.6周龄的spf(specificpathogenfree)级雌性wistar大鼠24只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为3组，每组8只，3组分别为：正常组、模型组、灌胃长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269的ccfm1269组。96.实验共四周：从造模前一周开始，一直持续到实验结束，正常组和模型组每只每天灌胃0.5ml浓度为0.9％(w/w)的无菌生理盐水溶液，ccfm1269组每只每天灌胃0.5ml浓度为1×109cfu/ml的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269菌液；第二周到第三周为造模期，造模第一天时，将牛ii型胶原蛋白溶液(chondrex，20022)与弗氏不完全佐剂(chondrex，7002)等体积混合、乳化，形成完全乳化液，使用异氟烷麻醉大鼠，固定大鼠并用75％酒精对大鼠尾根部整体进行消毒后，对大鼠进行初次免疫，初次免疫精确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部1.5cm处进行皮下注射，一周后采用相同的处理方法进行加强免疫，即准确吸取0.2ml完全乳化液在距离大鼠尾根部2.0cm处进行皮下注射，正常组大鼠仅采用同样的方法注射相同体积的无菌生理盐水。97.造模结束后，收集大鼠的粪便，提取粪便中基因组dna，对v3-v4区进行特异性pcr扩增，16srdna测序，分析粪便菌群变化，分析结果如图13-15所示。98.如图13-15所示，与正常组大鼠相比，模型组大鼠粪便中微生物菌群发生了显著的变化，其中，模型组大鼠粪便中乳杆菌属(lactobacillus)的相对丰度较正常组大鼠显著降低，长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269可将大鼠粪便中乳杆菌属(lactobacillus)相对丰度上调至正常组水平。并且，相比于模型组，长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269可以显著下调福涅拉氏菌属(fournierella)的相对丰度；以及相比于正常组，长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269可以显著上调正常组瘤胃球菌1(ruminococcus1)的相对丰度。长双歧杆菌婴儿亚种可以将类风湿性关节炎大鼠的异常菌群正常化，维持正常的肠道稳态。99.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一株长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longum subsp.infantis)ccfm1269，已于2022年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：62839，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。2.权利要求1所述的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗类风湿性关节炎包括如下至少一种作用：降低关节厚度、降低关节炎特异性抗体的含量、提高血清中骨保护素含量、提高血清中骨钙素含量。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述食品、药品或保健品中，长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的活菌数不低于1
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109cfu/ml或1
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109cfu/g。5.权利要求1所述的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269在制备提高骨保护素、骨钙素含量的药物或保健品中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述保健品包括使用含有所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵剂的制备方法为：将所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养24～48h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水重悬，得到发酵剂。8.权利要求1所述的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269在制备有助于调节肠道菌群的药物或保健品中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述调节肠道菌群包括但不限于提高乳杆菌属(lactobacillus)和/或瘤胃球菌1(ruminococcus 1)的相对丰度。10.一种预防或治疗类风湿性关节炎的药物，其特征在于，含有权利要求1所述的所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269，以及药物载体和/或药用辅料。

技术总结
本发明公开了一株可缓解类风湿性关节炎的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一株长双歧杆菌婴儿亚种CCFM1269，并将该长双歧杆菌婴儿亚种CCFM1269用于制备缓解类风湿性关节炎的药物，具体体现在：显著缓解类风湿性关节炎哺乳动物关节肿胀程度；显著降低类风湿性关节炎哺乳动物血清中促炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IL-22、和IL-23的含量；显著调节类风湿性关节炎哺乳动物血清中Ⅱ型胶原特异性抗体含量；显著调节类风湿性关节炎哺乳动物血清骨保护素和骨钙素含量，并能够在生物分类学的“属”水平改善类风湿性关节炎哺乳动物的肠道菌群。炎哺乳动物的肠道菌群。炎哺乳动物的肠道菌群。


技术研发人员：杨波 丁梦帆 李博文 陈海琴 刘小鸣 陈卫 赵建新 张灏
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/8/13