一种治疗肺腺癌的纳米材料、制备方法及其应用与流程

1.本发明提供了一种治疗肺腺癌的纳米材料、制备方法及其应用，属于生物材料制备技术领域。


背景技术：

2.肺腺癌是极具侵袭性和快速进展的致死性肿瘤类型之一，尽管根据驱动基因突变进行的靶向治疗已成为晚期肺腺癌的一线治疗，但目前肺腺癌患者的生存率依旧居高不下，需要进一步探索新的治疗可能。
3.目前在肺腺癌的研究中发现了一种致癌基因，即爪蟾驱动蛋白2靶蛋白(targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2，tpx2)，该致癌基因与肺腺癌的进展有直接关系，成为了相关研究的关注点。
4.因此，本领域存在一种技术难题，无法将调控因子准确递送至肺腺癌细胞中，导致其针对tpx2靶点的治疗疗效受到一定程度的影响。同时目前大多数小分子靶向治疗药物均通过口服给药，经过首关消除后，药效差且不良反应多。
5.上述问题对于治疗领域提出了产品研发的迫切需求，是否可以开发一种生物材料，能够有效负调控tpx2癌基因的表达以减缓肺腺癌的进展，并且增强药物的局部疗效及减少对人体的毒副作用，为tpx2基因高表达的肺腺癌患者提供更优的治疗方式，进而提高肺腺癌患者的总体生存率。
6.但此时带来一种技术层面上的问题，需要针对何种调控因子、何种给药方式才能达到这一目的，成为本领域开发时的难题。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，申请人想提供一种治疗肺腺癌的纳米材料，其中，所述纳米材料由mir-502-3p和中空介孔二氧化硅(hollow mesoporous silica nanoparticles，hmsn)组成，其中mir-502-3p与中空介孔二氧化硅的重量比为1:0.1-10。
8.进一步地，在上述的纳米材料中，mir-502-3p与中空介孔二氧化硅的重量比为1:1-5。
9.进一步地，在上述的纳米材料中，mir-502-3p与中空介孔二氧化硅的重量比为1:1.5-4。
10.进一步地，在上述的纳米材料中，mir-502-3p与中空介孔二氧化硅的重量比为1:2。
11.进一步地，在上述的纳米材料中，所述中空介孔二氧化硅为氨基修饰hmsn。
12.进一步地，在上述的纳米材料中，所述mir-502-3p为质粒，质粒的载体选择为真核细胞表达载体，优选lentiviral vector(lv3(h1/gfp&puro)。
13.进一步地，在上述的纳米材料中，所述纳米材料为注射剂，包括静脉注射剂。
14.进一步地，本发明提供一种制剂，所述制剂由上述纳米材料和药学上可接受的辅
料共同组成，所述制剂包括注射剂。
15.本发明进一步提供了一种上述纳米材料的制备方法，由以下步骤组成：
16.1)取中空介孔二氧化硅微球溶于有机溶剂中，配制成中空介孔二氧化硅溶液；
17.2)在中空介孔二氧化硅溶液中加入述氨基修饰试剂，进行氨基修饰，得到氨基修饰的中空介孔二氧化硅溶液，室温下搅拌充分反应后离心，得到沉淀；
18.3)步骤2)中的沉淀用步骤1)有机溶剂洗涤多次；
19.4)pbs溶液重悬步骤3)所述沉淀，加入mir-502-3p质粒，室温下搅拌充分反应；
20.5)离心，弃上清，所得沉淀即为所述纳米材料。
21.进一步地，在上述制备方法中，步骤1)和步骤3)所述有机溶剂为乙醇或甲醇。进一步优选无水乙醇。
22.充分搅拌优选选择5-24h，进一步优选8-12h。
23.进一步地，在上述制备方法中，所述氨基修饰试剂3-氨丙基三甲氧基硅烷(aptes)。
24.本发明进一步提供一种上述的纳米材料在制备治疗肺腺癌的药物中的应用，其中，所述肺腺癌为tpx2高表达型。(所述高表达指的是肺腺癌细胞中tpx2基因的表达量与正常细胞中tpx2的表达量具有统计学上的显著差异(即p值小于0.05或0.01))
25.本发明中乙醇或甲醇或包括其不同浓度的水溶液。
26.在本发明中，上述纳米材料的形成，构成机制来源于纳米载体中空介孔二氧化硅与小rna的静电吸附，这是一种物理结合方式，采用的载体为中空介孔二氧化硅，其具有肿瘤高通透性和滞留性效应(enhanced permeability and retention effect，epr效应)，能在肿瘤微环境中长时间滞留并蓄积，且能稳定装载过表达mir-502-3p的质粒，不容易发生解离，所制备的生物纳米材料不应具有明显的生物毒性。
27.在本发明中，所给出的中空介孔二氧化硅的含量通常比质粒的用量高，保证质粒能够充分携带。
28.基于上述考虑，发明人在前期的实验中发现mir-502-3p的高表达可以有效负调控tpx2基因，但由于mir-502-3p是否能够稳定地进入靶向细胞，是否对靶向细胞缠身作用，尚不确定。因此发明人阐释开发一种mir-502-3p质粒的生物纳米材料，初步确定其对肺腺癌的生长抑制作用。
29.根据目前相关文献报道，mir-502-3p可以参与多种肿瘤进展的调控，包括骨肉瘤、胆囊癌、肝细胞癌、胃癌等。但mir-502-3p参与肺腺癌治疗尚未有人报道。
30.关于载体的选择，发明人选取了中空介孔二氧化硅(hollow mesoporous silica nanoparticle,hmsn)。目前研究发现大多数纳米载体进入血液后可以被动靶向肿瘤，与正常组织相比，肿瘤脉管系统的渗漏性使得纳米材料更容易从肿瘤组织中渗出，又因肿瘤不良的淋巴引流而将纳米材料蓄积在肿瘤细胞内，而不会在正常组织中滞留。介孔二氧化硅是安全、可生物降解并且具有生物相容性的一种高效药物递送载体，它可通过静电吸附作用负载各种有机官能团。其目前除了用于递送化学治疗剂外，还可以作为混合有机-无机材料以及作为核酸的载体，因此能用于递送microrna(mirna)等相关物质。与基于无机材料的其他递送系统相比，hmsn的多孔中空结构可以使得核苷酸在表面上的结合以及在颗粒内的封装更稳定。使用中空介孔二氧化硅进行体内递送mirna有几个优点：(1)中空介孔二氧化
硅可以将大量且可量化的mirna负载到颗粒中。(2)中空介孔二氧化硅稳定的无机氧化物框架能防止mirna分子在血液循环中被rna酶降解。(3)介孔二氧化硅纳米颗粒不受溶酶体的吞噬。因此，hmsn可以作为将mirna递送进肿瘤细胞中的载体。
31.目前予开发的生物材料存在多种物质的修饰，并且其组装方式复杂、重复性差，体内的治疗作用不明显。
32.因此发明人力求开发一种制备简单、重复性强、安全性高的生物材料，最好是在自然状态下能够稳定结合。
33.根据前期实验结果的证实、治疗效果、安全性等因素考虑目前优先选择小分子非编码rna，即mir-502-3p。
34.根据生物纳米材料本身的特点，推荐该生物纳米材料采用无水乙醇常温下保存。
35.申请人进一步地提供一种上述生物纳米材料的制备方法，由以下步骤组成：
36.1)取中空介孔二氧化硅微球溶于无水乙醇中，配制成中空介孔二氧化硅溶液；
37.2)在中空介孔二氧化硅溶液中加入3-氨丙基三甲氧基硅烷(aptes)；
38.3)室温下，在磁力搅拌器中搅拌过夜，离心；
39.4)弃上清，用无水乙醇重悬沉淀，再次离心，弃上清；
40.5)最后用无菌的pbs溶液重悬沉淀，加入mir-502-3p质粒，室温下于磁力搅拌器上搅拌过夜；
41.6)离心，弃上清，用pbs溶液重悬。
42.7)水浴超声至该生物纳米材料完全溶解于pbs溶液中。
43.本发明中pbs溶液为本领域公知技术，ph优选7.4。
44.本发明进一步提供一种上述生物纳米材料在治疗肺腺癌中的应用，所述肺腺癌为tpx2高表达类型。
45.研究发现，本发明所提供的生物材料具有以下两个优点：
46.1)能够有效负调控tpx2高表达的肺腺癌，从而抑制肺腺癌的进展
47.2)通过静脉给药能提高药物的有效利用率，同时减少药物本身的毒副作用
48.有益效果：
49.申请人经过前期的实验验证，开发出一种通过物理结合的生物纳米材料，具有治疗作用显著、生物安全性高、制备简便、重复性强等优点。
50.1)应用范围广，不仅适用于肺腺癌，也适用于tpx2癌基因高表达的其他肿瘤的治疗。
51.2)尚未有mir-502-3p质粒通过注射方式治疗肺腺癌的报道，同时，mir-502-3p是否在肺腺癌的质量上也属于首次报道。
52.3)治疗作用显著，在体内能有效抑制肺腺癌的生长。
53.4)恰好所选择的纳米材料能够保证该mir-502-3p在相关的肿瘤细胞上能够顺利释放，从而保证了相关的治疗效果，这是本发明所具有的意想不到的技术特点。
附图说明
54.图1中空介孔二氧化硅负载mir-502-3p质粒后的结构形态；
55.图2生物纳米材料的电位图；
56.图3生物纳米材料在不同ph条件下的释放情况；
57.图4生物纳米材料在细胞水平的滞留效应；
58.图5生物纳米材料在体内对肺腺癌的抑制作用(p1975移植瘤)；
59.图6生物纳米材料在体内对肺腺癌的抑制作用(pc9移植瘤)
60.图7生物纳米材料对于正常支气管上皮细胞的影响(hn-nh2浓度梯度)；
61.图8生物纳米材料对于正常支气管上皮细胞的影响(mir@hn-nh2浓度梯度)；
62.图9生物纳米材料对于主要功能器官的影响；
63.图10生物纳米材料对于主要功能器官的影响。
具体实施方式
64.下面实例用于进一步说明本发明但不限于本发明。
65.实施例1
66.(一)中空介孔二氧化硅和mir-502-3p生物纳米材料的制备
67.中空介孔二氧化硅和mir-502-3p生物纳米材料的制备过程包括两个部分：
68.(1)氨基修饰hmsn的制备(hm-nh2)
69.1)吸取20mg中空介孔二氧化硅微球(郑州费曼生物科技有限公司，规格：1g-100mg/ml，货号：fmh410415-1g)于50ml单口圆底烧瓶中，取20ml无水乙醇加进上述液体中，再加入200μlaptes(碧云天beyotime，规格：100ml，st1087)(1mg hmsn加10μl aptes)。
70.2)于上述单口圆底烧瓶中加入转子，盖上瓶盖，置于磁力搅拌器上，在室温下以搅拌过夜。
71.3)次日将单口圆底烧瓶中的液体分装于15ml离心管中，12000rpm高速低温离心15min，弃上清。
72.4)用1ml无水乙醇重悬沉淀于1.5ml离心管中，离心(12000rpm 15min)，重复此步骤3次；
73.5)最后用1ml无水乙醇重悬沉淀，配制成浓度为10mg/ml溶液并分装于1.5ml离心管中于常温放置。
74.(2)hm-nh2负载mir-502-3p生物纳米材料制备，mir-502-3p过表达质粒购于吉玛基因公司(货号：c06003*1)，质粒的载体选择为lentiviral vector(lv3(h1/gfp&puro))。
75.1)取100μl上述hm-nh2溶液于2ml离心管中，12000rpm 15min离心，弃上清。
76.2)用1ml 75％酒精重悬沉淀，离心(12000rpm 15min无菌操作)，弃上清。(无水乙醇在本体系中对于二氧化硅微球和产品的溶解度最好，但使用75％酒精具有消毒的功能)
77.3)用1ml无菌pbs重悬沉淀，离心(12000rpm 15min)，弃上清，重复此步骤2次。
78.4)加入500μg mir-502-3p质粒(hm-nh2:mir-502-3p＝2mg:1mg，(本发明实施例购于吉玛基因公司，货号：c06003*1))，加入pbs使得溶液体积为1.5ml，在离心管管中放入小转子，置于磁力搅拌器上，在室温下搅拌12小时。
79.mir-502-3p(lv3(h1/gfp&puro)has-mir-502-3p)的序列：
80.forward oligo:
81.gatccgaatgcacctgggcaaggattcattcaagagatgaatcctcccaggtgcattcttttttg
82.reverse oligo:
83.aattcaaaaaagaatgcacctgggaggattcatctcttgaatgaatccttgcccaggtgcattcg
84.5)次日(以小时来确定一个搅拌时间)将上述液体在常温下离心(12000rpm 15min)弃上清。
85.6)用1ml pbs(ph约7.4，
±
0.1)重悬，水浴超声至材料完全溶解，离心(12000rpm 15min)弃上清，重复2次；
86.7)最后用1ml pbs重悬于1.5ml离心管中，配成浓度为1mg/ml的溶液，并在水浴超声至材料(mir@hm-nh2)完全溶解后于常温放置。
87.如无特殊指出，本发明中pbs溶液均为ph约7.4，
±
0.1。
88.(二)hm-nh2和mir-502-3p生物材料的表征
89.(1)通过透射电子显微镜(tem)观察到hmsn纳米颗粒呈现大小均一、圆形形态，粒径在20-30nm之间，当hmsn修饰上氨基后以及hm-nh2负载上mir-502-3p后，颗粒依旧呈现圆形形态，粒径大小均未改变，如图1所示。
90.(2)采用nano-zs90纳米颗粒跟踪分析(nta)测定hmsn、hm-nh2及mir@hm-nh2的zeta电学性能。结果显示氨基修饰后的hm-nh2带正电荷(8.72mv)，这表明它具有装载质粒的能力。在hm-nh2和mir-502-3p质粒连续混合静电吸附后，mir@hm-nh2带负电荷(-1.57mv)，如图2所示。
91.(3)配置ph值为5.5、6.8、7.4的pbs溶液，分别模拟溶酶体环境，肿瘤组织内环境和人体正常生理环境，验证在不同环境下mir@hm-nh2生物纳米材料释放mir-502-3p情况。如图3所示，mir@hm-nh2生物纳米材料在ph值为6.8的条件下能够释放mir-502-3p，在5.5及7.4环境中则不能。由此说明，mir@hm-nh2生物纳米材料可以在肿瘤组织中能够成功释放mir-502-3p，而在溶酶体和正常组织中不会释放出mir-502-3p，因此本发明制备方法中的pbs溶液选择ph为7.4。
92.结论：通过对mir@hm-nh2相关性能的检测，证明了通过静电吸附的物理结合方式成功合成了具有一定功能的生物纳米材料。
93.(三)细胞水平验证生物纳米材料在肿瘤细胞中的滞留效应
94.(1)首先制备带fitc荧光的hm-nh2生物纳米材料(fitc@hm-nh2)。称取1mg fitc于4ml离心管中，加入2ml无菌pbs溶解，使之浓度为500μg/ml，加入1mg hm-nh2。置于磁力搅拌器上，在室温下避光以最大转速搅拌过夜。次日离心清洗后用1ml无菌pbs重悬于1.5ml离心管后放入水浴超声。
95.(2)将fitc@hm-nh2以25μg/ml hm-nh2的浓度分别与正常支气管细胞(beas-2b)、肺腺癌细胞系(h1975)孵育，设置5个时间梯度，通过流式细胞术定量检测生物纳米材料在正常细胞与癌细胞中的滞留效应。结果如图4所示，随时间推移，与beas-2b相比，fitc@hm-nh2在h1975中的滞留时间更长，且结果具有统计学差异。
96.结论：通过在细胞水平对生物纳米材料在肿瘤细胞中的滞留效应检测，证实该生物纳米材料可以富集在肿瘤细胞中并且能够长时间的滞留。
97.(四)动物水平验证生物材料对肺腺癌的抑制作用
98.(1)选取6-8周龄裸鼠，分别在腿部皮下接种肺癌细胞系h1975及pc9，约一周后成瘤，肿瘤直径平均在4mm时，以20mg/kg的hm-nh2浓度通过尾静脉注射mir-nc@hm-nh299.对照质粒即空载质粒(lv3-shnc)
100.mir-nc的序列：
101.forward oligo:
102.gatccgttctccgaacgtgtcacgtttcaagagaacgtgacacgttcggagaacttttttg，
103.reverse oligo:
104.aattcaaaaaagttctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaacg
105.与mir@hm-nh2生物纳米材料，平均4天注射一次材料，共注射4次，期间监测小鼠肿瘤体积及体重变化。如图5-6所示，注射fitc@hm-nh2生物纳米材料的h1975荷瘤小鼠及pc9荷瘤小鼠的肿瘤均呈现缓慢生长趋势，注射hm-nh2生物纳米材料组与saline组(等体积的生理盐水)的小鼠肿瘤生长速度无明显差异，但相比于mir@hm-nh2生物纳米材料的小鼠肿瘤，生长速度显著增快，且结果具有统计学差异。
106.(2)在第四次注射材料后的第4天，使用异氟烷气麻小鼠，再通过眼球取血法将小鼠处死，取出荷瘤小鼠腿部移植瘤，进行离体移植瘤的大体比较。如图5-6所示，不论是h1975荷瘤小鼠亦或是pc9荷瘤小鼠，注射mir@hm-nh2生物纳米材料的小鼠移植瘤体积相对于注射saline和mir-nc@hm-nh2生物纳米材料荷瘤小鼠的移植瘤体积显著减小，而注射saline和mir-nc@hm-nh2生物纳米材料组荷瘤小鼠离体移植瘤体积无明显差异。
107.本发明静脉给药浓度为10mg/kg的hm-nh2，按照hm-nh2:mir-502-3p 2:1计算，裸鼠体重为20g左右，每只小鼠约注入100μg mir-502-3p，制备过程中mir-502-3p反应完全，因此可以参照mir-502-3p进行相关计算。
108.这本发明中前期预实验中，静脉注射mir-502-3p在体内会降解掉，无法靶定目标细胞，因此不必要设定mir-502-3p单独质粒组。
109.结论：以上实验数据证明静脉注射mir@hm-nh2生物纳米材料具有显著抑制肺腺癌生长作用。
110.(五)生物纳米材料的体内外生物安全性
111.(1)通过cck8细胞增殖实验检测hm-nh2及mir@hm-nh2在细胞水平上的生物安全性，如图7-8所示，分别用不同浓度hm-nh2和不同浓度mir@hm-nh2与正常支气管上皮细胞(beas-2b)共孵育24h后测其细胞活性，结果显示随着两种生物材料浓度的增加，beas-2b细胞活性未受明显影响，证明不论是hm-nh2还是mir@hm-nh2生物纳米材料在细胞水平上均具有一定的生物安全性，不影响正常细胞的生长和增殖。
112.(2)对上述对照组(saline)、实验组(mir-nc@hm-nh2及mir@hm-nh2)小鼠进行眼球取血，并分离血清来检测各组小鼠的生化指标以验证纳米材料对脏器功能的影响。如图9-10所示，在h1975荷瘤小鼠及pc9荷瘤小鼠中，3组小鼠的谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶没有显著差异，并且都在正常值范围内，肾功能指标肌酐及尿素氮亦在正常值范围内，并且3组均不具有统计学差异，说明该生物纳米材料不会损伤主要脏器功能。同时取对照组(saline)、实验组(mir-nc@hm-nh2及mir@hm-nh2)小鼠的主要脏器，即心、肝、脾、肺、肾，做石蜡切片he染色，检测该生物纳米材料在动物水平上的生物安全性，结果如图所示，与saline组相比，实验组(mir-nc@hm-nh2及mir@hm-nh2)的器官未见明显病理损伤，证实该生物纳米材料在动物水平上也具有一定的生物安全性。
113.结论：通过以上实验数据表明，该生物纳米材料对于正常支气管上皮细胞无明显生物毒性，且对主要脏器功能及组织无明显生物损伤，具有良好的生物安全性。
114.实施例2
115.为了优化hm-nh2与mir-502-3p的最佳比例。分别以hm-nh2与mir-502-3p比为0.1:1，2:1，1:1，4:1，8:1，10:1制备生物材料，结果发现当hm-nh2与mir-502-3p两者的比为2:1时，该生物材料的分散性、稳定性更好，但不同比例的都能合成相应的mir@hn-nh2。

技术特征：
1.一种治疗肺腺癌的纳米材料，其特征在于，由mir-502-3p和中空介孔二氧化硅组成，其中mir-502-3p与中空介孔二氧化硅的重量比为1:0.1-10。2.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，mir-502-3p与中空介孔二氧化硅的重量比为1:1-5。3.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，mir-502-3p与中空介孔二氧化硅的重量比为1:1.5-4。4.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，mir-502-3p与中空介孔二氧化硅的重量比为1:2。5.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，所述中空介孔二氧化硅为氨基修饰hmsn。6.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，所述mir-502-3p为质粒，质粒的载体选择为真核细胞表达载体。7.权利要求1所述质粒肺腺癌的纳米材料的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：1)取中空介孔二氧化硅微球溶于有机溶剂中，配制成中空介孔二氧化硅溶液；2)在中空介孔二氧化硅溶液中加入氨基修饰试剂，进行氨基修饰，得到氨基修饰的中空介孔二氧化硅溶液，室温下搅拌充分反应后离心，得到沉淀；3)步骤2)中的沉淀用步骤1)有机溶剂洗涤多次；4)pbs溶液重悬步骤3)所述沉淀，加入mir-502-3p质粒，室温下搅拌充分反应；5)离心，弃上清，所得沉淀即为所述纳米材料。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1)和步骤3)所述有机溶剂为乙醇或甲醇。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述氨基修饰试剂为3-氨丙基三甲氧基硅烷(aptes)。10.权利要求1所述的纳米材料在制备治疗肺腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述肺腺癌为tpx2高表达类型。

技术总结
本发明提供了一种治疗肺腺癌的纳米材料，由中空介孔二氧化硅和miR-502-3p组成，二者能够通过有效比例混合，能够制备成注射剂型，绕过口服所带来的药效不稳定的情况，可以直接锚定相关的靶细胞，并发挥TPX2的表达抑制作用，该纳米材料属于本领域首次提出，miR-502-3p作为常规上检测肺癌的一个靶点，却在肺腺癌上未有报道，因此，本发明为本领域的肺腺癌治疗提供了新的候选药物，具有广泛工业前景。具有广泛工业前景。具有广泛工业前景。


技术研发人员：江铭铮 白旸煜彦 李济伟 胡小艺 高占成 郑雅莉 吴婧 龙秋月 叶红莉 宋时旭
受保护的技术使用者：郑雅莉
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/13