不同亚型小胶质细胞对IR引发铁死亡敏感性的检测方法与流程

不同亚型小胶质细胞对ir引发铁死亡敏感性的检测方法
技术领域
1.本发明涉及小胶质细胞领域，具体涉及不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法。


背景技术：

2.m1型小胶质细胞对铁死亡不敏感，而m2型小胶质细胞对铁死亡高度敏感。这种敏感性差异若在is里也存在，那么在卒中早期抑制m2型小胶质细胞铁死亡减缓m2型小胶质细胞数量下降将有重大意义。
3.有鉴于此，本发明提供一种不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法。
5.为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，包括以下步骤：（a）先将若干只小鼠随机分为sham组和mcao组，然后通过磁珠分选出小胶质细胞，最后通过c11-bodipy检测sham组和mcao组的小胶质细胞的脂质ros水平；（b）先在体外诱导原代小胶质细胞极化成不同亚型小胶质细胞，并通过对不同亚型小胶质细胞给予铁死亡诱导剂；（c）先将不同亚型小胶质细胞分为con组、ogd/r组、和ogd/r+ fer-1组，然后将con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞进行mda检测。
6.进一步，所述mcao组的小鼠进行大脑中动脉梗塞手术，所述sham组的小鼠进行相同的手术，不阻塞大脑中动脉。
7.进一步，所述ogd/r组的小胶质细胞处理过程如下：（1）将原代小胶质细胞以5x103/孔接种于96孔板，或以2x105/孔接种于6孔板中；（2）培养24 h后吸走孔中完全培养基，加入不含fbs的无糖dmem培养基；（3）放置于灭菌后的缺氧小室中，打开小室进出气口后灌入含有95%氮气+5%二氧化碳的二元混合气，当小室内氧气浓度低于1%并能稳定维持3min后快速关闭进出气口；（4）将缺氧小室放置于细胞培养箱中培养；（5）培养3.5 h后取出细胞培养皿，加入2 ml含或不含adsc-exo的完全培养基，继续培养24 h后收样本。
8.进一步，通过c11-bodipy检测sham组和mcao组的小胶质细胞的脂质ros水平的过程如下：（1）将原代小胶质细胞以2
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105/孔的密度接种于6孔板；（2）不同组细胞接受干预后，pbs缓冲液洗涤细胞2次；
（3）加入2 ml含有10μm c11-bodipy染料的完全培养基，37℃避光孵育30 min；（4）用0.25%胰酶消化细胞，并用pbs缓冲液洗涤2次；（5）pbs缓冲液重悬后，立即用流式细胞仪检测。
9.进一步，通过磁珠分选出小胶质细胞的过程如下：（1）用90μl预冷pbs缓冲液重悬分离出来的脑细胞，加入10μlcd11b磁珠，混匀后4℃避光孵育15min；（2）加入1 ml 预冷pb缓冲液清洗，300g，4℃离心5min；（3）500μl预冷pb缓冲液重悬细胞；（4）用3 ml预冷pb缓冲液润洗分选柱；（5）将分选柱安装至分选器后加入样本，待样本从分选柱全部流出加入3ml预冷pb缓冲液，待缓冲液从分选柱全部流出再加入3 ml预冷pb缓冲液，共加3次；（6）将分选柱从分选器中取出，加入5 ml预冷pb缓冲液后快速按压分选柱底部推柱，50ml离心管收集滤液，重复4-6次；（7）400g，4℃离心5 min，弃上清留细胞备用。
10.进一步，体外诱导原代小胶质细胞极化成不同亚型小胶质细胞的过程如下：所述原代小胶质细胞通过lps联合ifn-γ诱导24 h极化成m1型小胶质细胞；通过il-4联合tgf-β诱导24 h极化成m2型小胶质细胞。
11.进一步，不同亚型小胶质细胞进行mda检测的具体过程如下：（1）con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品的准备：先将血标本用于mda测定；然后脑组织加入裂解液进行充分匀浆，12000 g离心10 min后收集上清；最后测定con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品的蛋白浓度;（2）con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品测定：先加入100 μl裂解液、标准品或con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品后加入200 μl mda工作液，混匀；然后在100℃金属浴15 min；最后冷却至室温后，1000g室温离心10 min。取200 μl上清加入到96孔板中，酶标仪检测吸光度（od 532nm）；（3）mda含量的计算：血样品根据标准曲线直接获得浓度；con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品样品，通过计算mda和蛋白含量，得到单位蛋白的mda含量。
12.进一步，所述铁死亡诱导剂为铁死亡诱导剂rsl-3或铁死亡抑制剂fer-1。
13.由于采用上述技术方案，具有以下有益效果：本发明为不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，本发明首先在体外诱导原代小胶质细胞极化成不同亚型的小胶质细胞，并在此基础上给予铁死亡诱导剂或ogd/r干预，观察不同亚型小胶质细胞对铁死亡的敏感性。本发明将不同亚型小胶质细胞分为con组、ogd/r组、和ogd/r+ fer-1组，观察不同亚型小胶质细胞对于ogd/r诱发的铁死亡是否存在敏感性差异。mda检测表明，m0型和m2型小胶质细胞中ogd/r组较con组mda水平明显增高，且铁死亡抑制剂可回复mda水平；而m1型小胶质细胞中ogd/r组与con组mda水平无统计学差异。与m1型小胶质细胞ogd/r组mda水平相比，m0型和m2型ogd/r组均有统计学差异。因此本发明表明，不同亚型小胶质细胞对缺血再灌注引起的铁死亡具有不同的敏感性，不同亚型小胶质细胞对铁死亡敏感性不同，其中m1型小胶质细胞不敏感，m2型小胶质细
胞对铁死亡高度敏感。而m2型则高度敏感。
附图说明
14.下面结合附图对本发明作进一步说明：图1为本发明实施例不同亚型小胶质细胞对 ogd/r干预诱导的铁死亡敏感性的示意图。
15.图2为本发明实施例不同亚型小胶质细胞通过mda检测评估对铁死亡诱导剂干预诱导的铁死亡敏感性的示意图。
16.图3为本发明实施例不同亚型小胶质细胞通过cck-8检测评估对铁死亡诱导剂干预诱导的铁死亡敏感性的示意图。
17.图4为本发明实施例诱导小胶质细胞极化成m2型后给予铁死亡诱导剂或ogd/r干预，并观察adsc-exo的治疗效果对比图。
18.图5为本发明实施例adsc-exo浓度不同，m2型小胶质细胞ogd/r后存活率的对比图。
19.图6为本发明实施例cck-8实验确定了铁死亡抑制剂fer-1影响后m2型小胶质细胞铁死亡的存在及adsc-exo的抗铁死亡能力的对比图。
20.图7为本发明实施例cck-8实验确定了铁死亡诱导剂rsl-3和死亡抑制剂fer-1影响后m2型小胶质细胞铁死亡的存在及adsc-exo的抗铁死亡能力的对比图。
21.图8为本发明实施例c11-bodipy评估adsc-exo对0gd/r后m2型小胶质细胞脂质ros水平的影响折线图。
22.图9为本发明实施例c11-bodipy评估adsc-exo对0gd/r后m2型小胶质细胞脂质ros水平的影响柱形图。
23.图10为本发明实施例mda检测adsc-exo对rsl-3干预后m2型小胶质细胞铁死亡的影响图。
24.图11为本发明实施例elisa评估adsc-exo对0gd/r后小胶质细胞培养基中 tnf-a水平的影响图。
25.图12为本发明实施例elisa评估adsc-exo对0gd/r后小胶质细胞培养基中 l-10水平的影响图。
26.图13为本发明实施例通过将不同干预组小胶质细胞的条件培养基用于培养n2a细胞条件的培养基实验示意图。
27.图14为本发明实施例cck-8 评估 pbs 或adsc-exo干预 24 h 后小胶质细胞的条件培养基对n2a神经元干预 24h存活率的影响图。
28.图15为本发明实施例磁珠分选mcao后3d小鼠皮层脑组织中小胶质细胞的流程图。
29.图16为本发明实施例透射电子显微镜观察假手术组（sham组）小鼠皮层脑组织和mcao模型组（mcao组）小鼠皮层脑组织中小胶质细胞线粒体形态的结构图。
30.图17为本发明实施例c11-bodipy581/591探针评估小鼠皮层脑组织中小胶质细胞脂质ros水平的折线图。
31.图18为本发明实施例c11-bodipy581/591探针评估小鼠皮层脑组织中小胶质细胞脂质ros水平的柱形图。
32.图19为本发明实施例lps（100 ng/ml）+ ifn-γ（20 ng/ml）或 il-4（20 ng/ml）+ tgf-β（20 ng/ml）诱导24 h后，rt-qpcr检测不同干预组原代小胶质细胞m1和m2亚型标记分子表达水平的比较图。
实施方式
33.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
34.参看图1-2，不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，包括以下步骤：（a）先将若干只c57/bl6小鼠随机分为sham组和mcao组，然后通过磁珠分选出小胶质细胞，最后通过c11-bodipy检测sham组和mcao组的小胶质细胞的脂质ros水平，并通过透射电镜观察sham组和mcao组的小胶质细胞的细胞线粒体。
35.从上述可知：参看图15-18，采用磁珠法分选出mcao后3d小鼠缺血半暗带皮层脑组织中小胶质细胞，并通过透射电镜和c11-bodipy 581/591荧光探针检测小胶质细胞铁死亡情况（图15）。与sham组相比，mcao组小胶质细胞线粒体变小、膜密度增高、嵴减少甚至消失（图16），符合细胞铁死亡的电镜下特征。c11-bodipy检测结果显示，mcao组小胶质细胞fitc通道相对荧光强度增高（p 《 0.001，图17和图18），表明mcao组小胶质细胞脂质过氧化增强。以上结果表明i/r触发了梗死侧小胶质细胞发生铁死亡。
36.（b）先在体外诱导原代小胶质细胞极化成不同亚型小胶质细胞，并通过对不同亚型小胶质细胞给予铁死亡诱导剂，所述铁死亡诱导剂为铁死亡诱导剂rsl-3或铁死亡抑制剂fer-1，观察不同亚型小胶质细胞对铁死亡的敏感性。 参看图19，rt-qpcr显示原代小胶质细胞接受lps联合ifn-γ诱导后m1小胶质细胞标志物cd32和inos较对照组显著增高（p 《 0.001），接受il-4联合tgf-β诱导后m2小胶质细胞标志物cd206和arg-1较对照组显著增高（p 《 0.001，图19）。表明通过lps联合ifn-γ成功诱导原代小胶质细胞极化成m1型小胶质细胞，通过il-4联合tgf-β成功诱导原代小胶质细胞极化成m2型小胶质细胞。
37.（c）先将不同亚型小胶质细胞分为con组、ogd/r组、和ogd/r+ fer-1组，然后将con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞进行mda检测。参看图1，丙二醛（mda）检测不同亚型小胶质细胞对ogd/r（ogd/r 3/ 24h）诱导的铁死亡敏感性，n = 3。**p 《 0.01；***p 《 0.001。
38.具体的，将不同亚型小胶质细胞分为con组、ogd/r组、和ogd/r+ fer-1组，观察不同亚型小胶质细胞对于ogd/r诱发的铁死亡是否存在敏感性差异。mda检测表明，m0型和m2型小胶质细胞中ogd/r组较con组mda水平明显增高（m0：ogd/r组 vs. con组，p 《 0.01；m2：ogd/r组 vs. con组，p 《 0.001），且铁死亡抑制剂可回复mda水平；而m1型小胶质细胞中ogd/r组与con组mda水平无统计学差异（p 》 0.05）。与m1型小胶质细胞ogd/r组mda水平相比，m0型和m2型ogd/r组均有统计学差异（m0 vs. m1，p 《 0.01；m2 vs. m1，p 《 0.01）。因此，以上实验表明，不同亚型小胶质细胞对缺血再灌注引起的铁死亡具有不同的敏感性，其中m1型小胶质细胞不敏感，而m2型小胶质细胞则高度敏感。
39.在不同亚型小胶质细胞分为con组、ogd/r组、和ogd/r+ fer-1组前，本实施例将不同亚型小胶质细胞分为con组、铁死亡诱导剂rsl3干预组（rsl3组）、铁死亡诱导剂rsl3联合铁死亡抑制剂fer-1组（rsl3+ fer-1组），观察不同亚型小胶质细胞的存活率和脂质过氧化产物水平。
40.参看图2，丙二醛（mda）检测评估不同亚型小胶质细胞对铁死亡诱导剂rsl-3（500 nm，6 h）的敏感性，及铁死亡抑制剂fer-1（500nm，6 h）对不同亚型小胶质细胞的挽救作用，n=3。m0型和m2型小胶质细胞中rsl3组较con组mda水平明显增高（m0：rsl3组 vs. con组，p 《 0.001；m2：rsl3组 vs. con组，p 《 0.001），且铁死亡抑制剂可降低mda水平；而m1型小胶质细胞中rsl3组与con组mda水平无统计学差异（p 》 0.05）。与m1型小胶质细胞rsl3组mda水平相比，m0型和m2型rsl3组均有统计学差异（m0 vs. m1，p 《 0.001；m2 vs. m1，p 《 0.001）。
41.参看图3，m0型和m2型小胶质细胞中rsl3组较con组存活率明显降低（m0：rsl3组 vs. con组，p 《 0.001；m2：rsl3组 vs. con组，p 《 0.001），且可被铁死亡抑制剂挽救；而m1型小胶质细胞中rsl3组与con组存活率无统计学差异（p 》 0.05）。同时，与m1型小胶质细胞rsl3组存活率相比，m0型和m2型rsl3组均有统计学差异（m0 vs. m1，p 《 0.001；m2 vs. m1，p 《 0.001）。
42.进一步的，不同亚型小胶质细胞对i/r引发的铁死亡敏感性不同：m0型小胶质细胞和m2型小胶质细胞中rsl3组较con组存活率明显降低、mda水平明显增高，而m1型小胶质细胞中rsl3组与con组存活率、mda水平无统计学差异；m0型和m2型小胶质细胞中ogd/r组较con组mda水平明显增高，而m1型小胶质细胞中ogd/r组与con组mda水平无统计学差异。
43.进一步的，参看图10，脂质过氧化产物mda检测表明adsc-exo能够降低rsl3导致的m2型小胶质细胞mda水平（rsl3+adsc-exo组 vs. rsl3组，p 《 0.001）。
44.进一步，所述mcao组的小鼠进行大脑中动脉梗塞手术，所述sham组的小鼠进行相同的手术，不阻塞大脑中动脉。
45.进一步，所述ogd/r组的小胶质细胞处理过程如下：（1）将原代小胶质细胞以5x103/孔接种于96孔板，或以2x105/孔接种于6孔板中；（2）培养24 h后吸走孔中完全培养基，加入不含fbs的无糖dmem培养基；（3）放置于灭菌后的缺氧小室中，打开小室进出气口后灌入含有95%氮气+5%二氧化碳的二元混合气，当小室内氧气浓度低于1%并能稳定维持3min后快速关闭进出气口；（4）将缺氧小室放置于细胞培养箱中培养；（5）培养3.5 h后取出细胞培养皿，加入2 ml含或不含adsc-exo的完全培养基，继续培养24 h后收样本。
46.进一步，通过c11-bodipy检测sham组和mcao组的小胶质细胞的脂质ros水平的过程如下：（1）将原代小胶质细胞以2
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105/孔的密度接种于6孔板；（2）不同组细胞接受干预后，pbs缓冲液洗涤细胞2次；（3）加入2 ml含有10μm c11-bodipy染料的完全培养基，37℃避光孵育30 min；（4）用0.25%胰酶消化细胞，并用pbs缓冲液洗涤2次；（5）pbs缓冲液重悬后，立即用流式细胞仪检测。
47.进一步，通过磁珠分选出小胶质细胞的过程如下：（1）用90 μl预冷pbs缓冲液重悬分离出来的脑细胞，加入10μlcd11b磁珠，混匀后4℃避光孵育15min；（2）加入1 ml 预冷pb缓冲液清洗，300g，4℃离心5 min；（3）500μl预冷pb缓冲液重悬细胞；（4）用3 ml预冷pb缓冲液润洗分选柱；（5）将分选柱安装至分选器后加入样本，待样本从分选柱全部流出加入3ml预冷pb缓冲液，待缓冲液从分选柱全部流出再加入3 ml预冷pb缓冲液，共加3次；（6）将分选柱从分选器中取出，加入5 ml预冷pb缓冲液后快速按压分选柱底部推柱，50ml离心管收集滤液，重复4-6次；（7）400g，4℃离心5 min，弃上清留细胞备用。
48.进一步，通过透射电镜观察sham组和mcao组的小胶质细胞的细胞线粒体的过程如下：（1）收集小胶质细胞后用2.5%戊二醛固定2 h；（2）磷酸漂洗液漂洗3次后，1%锇酸固定液固定2 h；（3）依次经脱水、包埋、固化；（4）2%醋酸铀-枸橼酸铅双染色；（5）透射电镜观察并拍片。
49.进一步，体外诱导原代小胶质细胞极化成不同亚型小胶质细胞的过程如下：原代小胶质细胞通过lps联合ifn-γ诱导24 h极化成m1型小胶质细胞；通过il-4联合tgf-β诱导24 h极化成m2型小胶质细胞。
50.进一步，不同亚型小胶质细胞进行mda检测的具体过程如下：（1）con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品的准备：先将血标本用于mda测定；然后脑组织加入裂解液进行充分匀浆，12,000 g离心10 min后收集上清；最后测定con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品的蛋白浓度;（2）con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品测定：先加入100 μl裂解液、标准品或con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品后加入200 μl mda工作液，混匀；然后在100℃金属浴15 min；最后冷却至室温后，1000g室温离心10 min。取200 μl上清加入到96孔板中，酶标仪检测吸光度（od 532nm）；（3）mda含量的计算：血样品根据标准曲线直接获得浓度；con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品样品，通过计算mda和蛋白含量，得到单位蛋白的mda含量。
51.另外在上述步骤（3）中，丙二醛（mda）检测评估不同亚型小胶质细胞对铁死亡诱导剂rsl-3（500 nm，6 h）的敏感性可通过cck-8检测评估来替代。参看图3，通过cck-8检测评估不同亚型小胶质细胞对铁死亡诱导剂rsl-3（500 nm，6 h）的敏感性，及铁死亡抑制剂fer-1（500 nm，6 h）对不同亚型小胶质细胞的挽救作用，n= 3。
52.另外，根据上述的方法可知：不同亚型小胶质细胞对缺血再灌注引起的铁死亡具有不同的敏感性，其中m1型小胶质细胞不敏感，而m2型小胶质细胞则高度敏感。
53.进而的，adsc-exo是否能够降低m2型小胶质细胞铁死亡敏感性，本发明通过诱导
小胶质细胞极化成m2型后给予铁死亡诱导剂或ogd/r干预，并观察adsc-exo的治疗效果。参看图4，体外给予pkh-26标记的adsc-exo能被m0和m2型原代小胶质细胞摄取，这为体外给予adsc-exo干预提供了可行性依据。
54.cck-8实验显示，随着adsc-exo浓度的提升，m2型小胶质细胞ogd/r后存活率逐步提高，当adsc-exo浓度达到20 μg/ml时，效果最为显著（adsc-exo 20 μg/ml组 vs. pbs组，p 《 0.001, 图5），我们确定该浓度adsc-exo为最适浓度并用于后续实验。同时，我们在相同条件下给予铁死亡抑制剂或adsc-exo，进一步的，参看图6和图7，cck-8实验确定了ogd/r或铁死亡诱导剂rsl-3或死亡抑制剂fer-1影响后m2型小胶质细胞铁死亡的存在及adsc-exo的抗铁死亡能力。
55.进一步的，为了探索adsc-exo对m2型小胶质细胞铁死亡的调节作用能否抑制炎症微环境，进而对周围神经元产生影响，本发明进行了小胶质细胞的条件培养基实验。将小胶质细胞分为con组、pbs组和adsc-exo组，ogd/r后收集培养基进行炎症因子检测，elisa实验发现ogd/r后pbs组tnf-α（p 《 0.001）和il-10上升（p 《 0.01），而adsc-exo组较pbs组tnf-α下降（p 《 0.001），il-10进一步升高（p 《 0.001），表明adsc-exo能够抑制ogd/r小胶质细胞的炎症微环境（图11和图12）。如图13和图14所示，进一步通过将不同干预组小胶质细胞的条件培养基用于培养n2a细胞发现，与con组相比，ogd/r后的条件培养基降低了n2a细胞的存活率（p 《 0.001），而接受adsc-exo干预的小胶质细胞条件培养基则较pbs组提高了n2a细胞的存活率（p 《 0.01）。以上结果表明adsc-exo能够通过降低m2型小胶质细胞铁死亡敏感性，提高炎症微环境中抗炎因子的水平，并提高周围神经元的存活率。
56.以上仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此。任何以本发明为基础，为解决基本相同的技术问题，实现基本相同的技术效果，所作出地简单变化、等同替换或者修饰等，皆涵盖于本发明的保护范围之中。

技术特征：
1.不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，其特征在于包括以下步骤：（a）先将若干只小鼠随机分为sham组和mcao组，然后通过磁珠分选出小胶质细胞，最后通过c11-bodipy检测sham组和mcao组的小胶质细胞的脂质ros水平；（b）先在体外诱导原代小胶质细胞极化成不同亚型小胶质细胞，并通过对不同亚型小胶质细胞给予铁死亡诱导剂；（c）先将不同亚型小胶质细胞分为con组、ogd/r组、和ogd/r+ fer-1组，然后将con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞进行mda检测。2.根据权利要求1所述的不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，其特征在于：所述mcao组的小鼠进行大脑中动脉梗塞手术，所述sham组的小鼠进行相同的手术，不阻塞大脑中动脉。3.根据权利要求1所述的不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，其特征在于：所述ogd/r组的小胶质细胞处理过程如下：（1）将所述原代小胶质细胞以5x103/孔接种于96孔板，或以2x105/孔接种于6孔板中；（2）培养24 h后吸走孔中完全培养基，加入不含fbs的无糖dmem培养基；（3）放置于灭菌后的缺氧小室中，打开小室进出气口后灌入含有95%氮气+5%二氧化碳的二元混合气，当小室内氧气浓度低于1%并能稳定维持3min后快速关闭进出气口；（4）将缺氧小室放置于细胞培养箱中培养；（5）培养3.5 h后取出细胞培养皿，加入2 ml含或不含adsc-exo的完全培养基，继续培养24 h后收样本。4.根据权利要求1所述的不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，其特征在于：通过c11-bodipy检测sham组和mcao组的小胶质细胞的脂质ros水平的过程如下：（1）将所述原代小胶质细胞以2
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105/孔的密度接种于6孔板；（2）不同组细胞接受干预后，pbs缓冲液洗涤细胞2次；（3）加入2 ml含有10μm c11-bodipy染料的完全培养基，37℃避光孵育30 min；（4）用0.25%胰酶消化细胞，并用pbs缓冲液洗涤2次；（5）pbs缓冲液重悬后，立即用流式细胞仪检测。5.根据权利要求1所述的不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，其特征在于：通过磁珠分选出小胶质细胞的过程如下：（1）用90 μl预冷pbs缓冲液重悬分离出来的脑细胞，加入10μlcd11b磁珠，混匀后4℃避光孵育15min；（2）加入1 ml 预冷pb缓冲液清洗，300g，4℃离心5 min；（3）500μl预冷pb缓冲液重悬细胞；（4）用3 ml预冷pb缓冲液润洗分选柱；（5）将分选柱安装至分选器后加入样本，待样本从分选柱全部流出加入3ml预冷pb缓冲液，待缓冲液从分选柱全部流出再加入3 ml预冷pb缓冲液，共加3次；（6）将分选柱从分选器中取出，加入5 ml预冷pb缓冲液后快速按压分选柱底部推柱，50ml离心管收集滤液，重复4-6次；
（7）400g，4℃离心5 min，弃上清留细胞备用。6.根据权利要求1所述的不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，其特征在于：体外诱导原代小胶质细胞极化成不同亚型小胶质细胞的过程如下：所述原代小胶质细胞通过lps联合ifn-γ诱导24 h极化成m1型小胶质细胞；通过il-4联合tgf-β诱导24 h极化成m2型小胶质细胞。7.根据权利要求1所述的不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，其特征在于：不同亚型小胶质细胞进行mda检测的具体过程如下：（1）con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品的准备：先将血标本用于mda测定；然后脑组织加入裂解液进行充分匀浆，12000 g离心10 min后收集上清；最后测定con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品的蛋白浓度;（2）con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品测定：先加入100μl裂解液、标准品或con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品后加入200 μl mda工作液，混匀；然后在100℃金属浴15 min；最后冷却至室温后，1000g室温离心10 min。取200 μl上清加入到96孔板中，酶标仪检测吸光度；（3）mda含量的计算：血样品根据标准曲线直接获得浓度；con组、ogd/r组和ogd/r+ fer-1组的不同亚型小胶质细胞样品样品，通过计算mda和蛋白含量，得到单位蛋白的mda含量。8.根据权利要求1所述的不同亚型小胶质细胞对 ir 引发铁死亡敏感性的检测方法，其特征在于：所述铁死亡诱导剂为铁死亡诱导剂rsl-3或铁死亡抑制剂fer-1。

技术总结
本发明涉及小胶质细胞领域，具体涉及不同亚型小胶质细胞对IR引发铁死亡敏感性的检测方法，包括以下步骤：（a）先将若干只小鼠随机分为Sham组和MCAO组，然后通过磁珠分选出小胶质细胞，最后通过C11-BODIPY检测脂质ROS水平；（b）先在体外诱导原代小胶质细胞极化成不同亚型小胶质细胞，并通过对不同亚型小胶质细胞给予铁死亡诱导剂；（c）先将不同亚型小胶质细胞分为CON组、OGD/R组、和OGD/R+ Fer-1组，然后将不同亚型小胶质细胞进行MDA检测。不同亚型小胶质细胞对缺血再灌注引起的铁死亡具有不同的敏感性，不同亚型小胶质细胞对铁死亡敏感性不同，其中M1型小胶质细胞不敏感，M2型小胶质细胞对铁死亡高度敏感。而M2型则高度敏感。细胞对铁死亡高度敏感。而M2型则高度敏感。细胞对铁死亡高度敏感。而M2型则高度敏感。


技术研发人员：赵静 汪勇 初敏 张增雨 刘卓航
受保护的技术使用者：上海市闵行区中心医院
技术研发日：2023.05.27
技术公布日：2023/8/13