褐藻寡糖作为饲料添加剂在水产养殖中的应用

1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及褐藻寡糖在提高虹鳟鱼生产性能、营养成分和非特异性免疫的应用。


背景技术：

2.功能性寡糖因具有多种生物学活性，它作为一种新型功能性糖源被广泛应用在食品、保健品、饮料、医药、饲料添加剂等领域。目前《饲料添加剂品种目录》中可应用于动物养殖的寡糖一共7种，分别为低聚木糖(木寡糖)、低聚壳聚糖、半乳甘露寡糖、果寡糖、甘露寡糖、低聚半乳糖和壳寡糖。2011年12月褐藻酸寡糖被批准可应用于肉鸡和蛋鸡养殖中。功能性寡糖作为饲料添加剂具有微量、无毒、无残留、稳定等优良的理化性质，是一种良好的抗生素替代品。它应用在水产养殖中能够提高动物的生长性能，如提高成活率、增重率、特定生长率和蛋白质利用率、降低饵料系数、促进机体的脂质代谢；能够调节动物肠道微生态平衡，促进有益菌的增殖和肠道的发育；还能提高机体的免疫力和抗病力等作用。
3.褐藻寡糖属于功能性海洋寡糖，它具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。应用于水产养殖的研究相对较少，但却展现出优良的特性和潜力。在饲料添加剂应用领域中，作为抗生素替代，褐藻寡糖展现出巨大的潜力和前景，但还需要大量的研究探索，这都将有助于海洋寡糖的应用和推广扎实基础。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种褐藻寡糖作为饲料添加剂在水产养殖中的应用，所述用途能够促进虹鳟鱼的生长、降低饲料系数、改善鱼肉营养成分和提高非特异性免疫力。
5.本发明提供了一种褐藻寡糖作为饲料添加剂在水产养殖中的应用，所述褐藻寡糖分子骨架为d-甘露糖醛酸和l-古罗糖醛酸经β-(1，4)-糖苷键交替连接形成的线性寡聚糖，平均相对分子质量的分子量为1～5kda。
6.进一步的，褐藻寡糖作为饲料添加剂在水产养殖中的应用中在水产养殖中的应用对象为虹鳟鱼。
7.进一步的，所述褐藻寡糖在饲料添加剂中的添加量为饲料总重量的0.25％～0.5％。
8.在优选例中，所述褐藻寡糖作为饲料添加剂在水产养殖中的应用，能够：
9.在增加虹鳟鱼生长性能的应用，和/或；
10.在降低虹鳟鱼饲料系数的应用，和/或；
11.在增加虹鳟鱼粗脂肪含量的应用，和/或；
12.在增加虹鳟鱼氨基酸含量的应用，和/或；
13.在增加虹鳟鱼脂肪酸含量的应用，和/或；
14.在提高虹鳟鱼非特异性免疫的应用。
15.进一步的，所述增加虹鳟鱼生长性能为增加虹鳟鱼增重率、特定生长率、肥满度。
16.进一步的，所述增加虹鳟鱼氨基酸含量为增加氨基酸总量、必需氨基酸总量、非必需氨基酸总量和呈味氨基酸总量，优选的，为增加天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量。
17.进一步的，所述虹鳟鱼的脂肪酸为c14～c24的脂肪酸。
18.进一步的，所述增加虹鳟鱼脂肪酸含量为增加虹鳟鱼脂肪酸总量、饱和脂肪酸总量、单不饱和脂肪酸总量和不饱和脂肪酸的含量，优选的，增加亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸甲酯的含量。
19.进一步的，所述增加虹鳟鱼非特异性免疫的应用为增加虹鳟鱼血清的溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性和总抗氧化力的应用。
20.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
21.本发明的有益效果在于：
22.本发明提供了一种应用于水产养殖动物中可作为新饲料添加剂的物质，为褐藻寡糖。它可以促生长剂和免疫增强剂，促进虹鳟鱼的生长、降低饲料系数、改善鱼肉营养成分和提高非特异性免疫力，效果显著。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
25.为了使本发明目的、技术方案及优点更明确，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，以下所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
26.实验材料：
27.2冬龄的三倍体虹鳟鱼(oncorhynchus mykiss)，体质量(0.316
±
0.01)kg，来自于全国水产引育种中心。
28.褐藻寡糖(alginate oligosaccharides，aos)，其分子骨架为d-甘露糖醛酸和l-古罗糖醛酸经β-(1，4)-糖苷键交替连接形成的线性寡聚糖，平均相对分子质量的分子量为1～5kda，购于青岛国际寡糖制备中心。
29.基础饲料购自山东汉业生物科技有限公司；其他试剂、仪器设备为常规所用仪器设备。
30.实施例1褐藻寡糖促进虹鳟鱼的生长性能
31.1、实验分组与饲喂管理
32.试验虹鳟养殖于冷水微流水池(3.5m
×
3.5m)，水深0.8m，养殖水温13-14℃，ph8.2，溶解氧7.5～8.5。试验饵料现拌现喂，饱食投喂，一天2顿(8:00、16:00)，喂完立即换水1/5，试验周期共计37d。试验分为3组，每组3个平行，每个平行100尾。对照组：投喂基础饲料；褐藻寡糖低剂量组：基础饲料中添加褐藻寡糖0.25％；褐藻寡糖高剂量组：基础饲料中添加褐藻寡糖0.5％。
33.2、生长指标的测定
34.实验开始前和实验结束后鱼体禁食24h，分别称取各组鱼体总质量，计算其增重率(wgr)和特定生长率(sgr)；根据饲料投喂计算饲料系数(fcr)；根据鱼体质量和体长计算肥满度(cf)。根据下列公式计算以下指标：
35.增重率(wgr，％)＝(w
t-w0)/w0×
100
36.特性生长率(sgr，％/d)＝(ln w
t-lnw0)/37
×
100
37.饲料系数(fcr)＝wf/(w
t
–
w0)；
38.成活率(sr，％)＝成活尾数/总尾数
×
100；
39.肥满度(cf，g/cm3)＝(w/l3)
×
100
40.式中：w
t
代表末体质量(g)，w0代表初体质量(g)，37为饲养天数(d)，wf为投喂饲料的总质量(g)，w代表鱼体质量(g)，l代表鱼体长(cm)。
41.添加褐藻寡糖对虹鳟鱼生长性能的影响，如表1所示。各实验组增重率和特定生长率均高于对照组，且低剂量组与对照组差异显著(p《0.05)；各实验组饲料系数均低于对照组；各实验组肥满度均高于对照组。
42.表1褐藻寡糖对虹鳟生长性能的影响
[0043][0044]
注：不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
[0045]
实施例2褐藻寡糖对虹鳟鱼肉常规营养成分的影响
[0046]
基本营养成分的测定均选取虹鳟鱼背部肌肉为样品，其中水分含量的测定参考gb 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》；蛋白质含量的测定参考gb 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；脂肪含量的测定参考gb 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》；灰分含量的测定参考gb 5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》。
[0047]
水产品的基本营养成分是衡量水产品营养和品质的重要指标。由表2数据显示，虹鳟鱼肉中水分含量最高，各组均在75％左右，其次为粗蛋白。粗脂肪含量各实验组均极显著
高于对照组，高剂量组极显著高于低剂量组(p《0.01)。虹鳟鱼脂肪含量的增加使得鱼肉在生食或熏制过程中，更加嫩滑多汁、增加了滑爽的口感。
[0048]
表2虹鳟肌肉中基本营养成分含量(g/100g)
[0049][0050]
注：不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)。
[0051]
实施例3褐藻寡糖对虹鳟鱼肉氨基酸含量的影响
[0052]
水解氨基酸含量的测定采用高效液相色谱法进行。取肌肉样品0.5g加入20ml盐酸(v盐酸∶v纯水＝1∶1)，置于电热鼓风干燥箱中，110℃水解22h。取出冷却后，定容至25ml。取100μl样品置于真空干燥箱中，60℃干燥2h，离心管中充氮，准确加入50μl衍生试剂(乙醇:异硫氰酸苯酯：水：三乙胺＝7：1：1：1)，常温下衍生30min，加入流动相a(0.1mol/l无水乙酸钠：乙腈＝97：3，混匀后调ph至6.5)定容到0.5ml，混匀，过0.45μm有机膜上机。
[0053]
色谱条件：色谱柱为c
18
柱(4.6mm
×
250mm
×
5μm)，柱温40℃，流速1ml/min，检测波长254nm，进样量10μl，流动相为ab溶液梯度洗脱(a：0.1mol/l无水乙酸钠：乙腈＝97：3，混匀后调ph至6.5；b：乙腈：水＝80：20)。
[0054]
各组虹鳟鱼肌肉中共检出16种氨基酸，其中以谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸含量位于前三位。包括人体必需的8种氨基酸(赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸)，7种非必需氨基酸(谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)，1种半必需氨基酸(精氨酸)。与对照组相比，各实验组16种氨基酸含量均高于对照组，氨基酸总量、必需氨基酸总量、非必需氨基酸总量和呈味氨基酸总量也极显著高于对照组(p《0.01)，且高剂量组要优于低剂量组。
[0055]
6种呈味氨基酸中，谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸呈现鲜味和甜味，除甘氨酸外，其含量各实验组均极显著的高于对照组(p《0.01)；酪氨酸和苯丙氨酸则呈现苦味，其含量呈现同样的规律。但谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸在肌肉中的积累量显著高于酪氨酸和苯丙氨酸，说明饲料中添加褐藻寡糖能提高虹鳟鱼的鲜甜口感，具有更好的水产品鲜美品质。
[0056]
表3虹鳟肌肉中水解氨基酸含量单位：mg/kg
[0057][0058]
注：-代表未检测到，含量《21.80mg/kg；#代表必需氨基酸；*代表呈味氨基酸。不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)。
[0059]
实施例4褐藻寡糖对虹鳟鱼肉脂肪酸含量的影响
[0060]
水解脂肪酸含量的测定采用气相色谱-质谱联用(gc-ms)方法进行。脂肪的水解：取肌肉样品0.5g加2ml 95％乙醇和4ml水混匀，再加如10ml 8.3mol/l盐酸溶液，混匀，置于80℃水浴中水解40min，取出样品冷却至室温。脂肪的提取：水解后的样品加入10ml 95％乙醇，混匀；用100ml乙醚石油醚混合液分3次提取，合并提取液至平底烧瓶中；将石油醚乙醚层蒸干，获取脂肪。脂肪的皂化和脂肪酸甲酯化：在脂肪提取物中，继续加入4ml 2％氢氧化钠甲醇溶液，45℃水浴20min，加入4ml 14％三氟化硼甲醇溶液，继续水浴20min；温度降到室温，再加入3ml正己烷，震荡萃取2min，静置分层后取上清液，用0.45μm滤膜过膜后上机测试。
[0061]
色谱条件：tg-fame色谱柱(50m
×
0.25mm
×
0.20μm)；进样口温度260℃；载气流速0.63ml/min；分流比为100:1。升温程序：80℃保持1min，以20℃/min的速率升温至160℃，保
持1.5min，再以5℃/min的速率升温至230℃，保持6min。
[0062]
质谱条件：离子源温度280℃；传输线温度240℃；溶剂延迟时间4.00min；离子源为ei源70ev。
[0063]
各组虹鳟鱼肌肉中均检出22种脂肪酸，脂肪酸组成集中在c14～c24之间，其中饱和脂肪酸8种，单不饱和脂肪酸5种，多不饱和脂肪酸9种。各实验组虹鳟鱼肉中脂肪酸总量、饱和脂肪酸总量、单不饱和脂肪酸总量(除低剂量组外)和多不饱和脂肪酸总量均高于对照组，其中高剂量组均极显著高于对照组(p《0.01)，低剂量组与对照组差异不显著(p》0.05)。各组不饱和脂肪酸的含量要高于饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸的含量要高于单不饱和脂肪酸。此外，亚油酸(c18:2n6c)、花生四烯酸(ara)、二十碳五烯酸(epa)和二十二碳六烯酸甲酯(dha)因具有诸多生理学功能备受关注，从本研究中发现饲料中添加0.5％的褐藻寡糖能极显著增加鱼肉中两者的含量(p《0.01)，与对照组相比分别提高了72.07％、23.84％、30.65％、49.81％。
[0064]
表4虹鳟肌肉水解脂肪酸含量单位：g/100g
[0065]
[0066][0067]
注：-代表未检测到，含量《0.0033g/100g；不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)。
[0068]
实施例5褐藻寡糖对虹鳟鱼血清免疫酶活性的影响
[0069]
虹鳟鱼血清的溶菌酶(lzm)、酸性磷酸酶(acp)、碱性磷酸酶(akp)、超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活性和总抗氧化力(t-aoc)的测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，测定方法按照试剂盒说明书进行。
[0070]
与对照组相比，饲料中添加褐藻寡糖能提高虹鳟鱼血清中6种免疫酶活性和总抗氧化能力，其中高剂量组普遍高于低剂量组。2个实验组溶菌酶活性极显著高于对照组(p《0.01)。在抗氧化酶的研究中发现，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性高剂量组均极显著高于对照组(p《0.01)；谷胱甘肽过氧化物酶活性各实验组均显著高于对照组(p《0.05)；对总抗氧化活性的测定中发现，各实验组均极显著高于对照组(p《0.01)。以上数据表明，饲料中添加褐藻寡糖能够提高虹鳟鱼血清免疫酶活性和总抗氧化能力，提高虹鳟鱼非特异性免疫，进而可以提高鱼的抗病能力。
[0071]
表5褐藻寡糖对虹鳟鱼血清免疫酶活性的影响(n＝8)
[0072][0073]
注：不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)。
[0074]
以上实施例仅说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.褐藻寡糖作为饲料添加剂在水产养殖中的应用，其特征在于，所述褐藻寡糖分子骨架为d-甘露糖醛酸和l-古罗糖醛酸经β-(1，4)-糖苷键交替连接形成的线性寡聚糖，平均相对分子质量的分子量为1～5kda。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的在水产养殖中的应用对象为虹鳟鱼。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述褐藻寡糖在饲料添加剂中的添加量为饲料总重量的0.25％～0.5％。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为：1)在增加虹鳟鱼生长性能的应用，和/或；2)在降低虹鳟鱼饲料系数的应用，和/或；3)在增加虹鳟鱼粗脂肪含量的应用，和/或；4)在增加虹鳟鱼氨基酸含量的应用，和/或；5)在增加虹鳟鱼脂肪酸含量的应用，和/或；6)在提高虹鳟鱼非特异性免疫的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述增加虹鳟鱼生长性能为增加虹鳟鱼增重率、特定生长率、肥满度。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述增加虹鳟鱼氨基酸含量为增加氨基酸总量、必需氨基酸总量、非必需氨基酸总量和呈味氨基酸总量，优选的，为增加天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述虹鳟鱼的脂肪酸为c14～c24的脂肪酸。8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述增加虹鳟鱼脂肪酸含量为增加虹鳟鱼脂肪酸总量、饱和脂肪酸总量、单不饱和脂肪酸总量和不饱和脂肪酸的含量，优选的，增加亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸甲酯的含量。9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述增加虹鳟鱼非特异性免疫的应用为增加虹鳟鱼血清的溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性和总抗氧化力的应用。

技术总结
本发明公开了一种褐藻寡糖在水产养殖中的应用，它作为促生长剂和免疫增强剂应用于水产养殖时，褐藻寡糖的添加量为饲料总重量的0.25％～0.5％。本发明的有益效果：促进虹鳟鱼的生长、降低饲料系数、改善鱼肉营养成分和提高非特异性免疫力，效果显著。效果显著。


技术研发人员：汤伟 何增国 赵峡 李全才 张军 孙晓雯 唐涛 乔晓妮
受保护的技术使用者：青岛百奥安泰生物科技有限公司 中国海洋大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/13