青岛文昌鱼免疫相关AmphiERK1/2蛋白的制备及应用

青岛文昌鱼免疫相关amphierk1/2蛋白的制备及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种青岛文昌鱼免疫相关amphi erk1/2蛋白的制备及应用。


背景技术：

2.过去的十几年中，很多的分子证据都证实了头索动物是脊椎动物的姐妹类群这一说法(holland et al.,2004)。头索动物文昌鱼是现存的和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，其形体结构、发育模式和基因组都是脊椎动物最简单模型的代表，是研究原始适应性免疫系统起源与演化的理想的实验动物模型，所以可以通过研究它的免疫来揭示脊椎动物的免疫系统的起源及进化并识别相关基因。最近大量的免疫研究发现文昌鱼里不仅存在先天免疫，也存在适应性免疫基因的同源序列(danchin et al.,2004；dong et al.,2005；sato et al.,2003)。erk信号转导通路是mapk家族中最早发现也是目前研究的最为清楚的一条信号转导通路。weinstein等在使用抗酪氨酸磷酸化抗体时，用lps刺激巨噬细胞后，检测出细胞内有3种酪氨酸磷酸化蛋白，其中2种被确认为erk1和erk2(weinstein et al.,1992)，其同源性约为85％，而结合底物的核心区同源性更高。erk1和erk2广泛存在与各种物种和组织中，在某种程度上被多种配体和细胞外界刺激所激活，具有细胞种类的特异性。例如，在多种免疫细胞中erk2的表达占优势，而在一些神经内分泌细胞中两者的表达情况相同。


技术实现要素：

3.本发明的目的之一是提供一种从青岛文昌鱼中筛选的抗病免疫基因蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
4.本发明的目的之二是提供编码所述抗病免疫基因蛋白的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
5.本发明的目的之三是提供含有所述抗病免疫基因蛋白的基因的载体，以及含有编码所述抗病免疫基因蛋白的基因或含有所述载体的宿主细胞。
6.本发明的目的之四是提供所述抗病免疫基因蛋白在制备青岛文昌鱼抗病制剂中的应用。
7.本发明的目的之五是提供编码所述抗病免疫基因蛋白的基因或所述的载体在制备转基因青岛文昌鱼中的应用。
8.本发明从青岛文昌鱼为中首次筛选克隆了amphierk1/2基因，明确amphierk1/2在青岛文昌鱼里的表达及进化分析，为脊椎动物免疫系统的发育提供理论基础。
附图说明
9.图1为amphierk1/2蛋白在青岛文昌鱼成体组织的表达结果。其中：bs为branchial slit鳃裂；ee为external epithelium表皮；en为endostyle内柱；go为gonad生殖腺；hc为
hepatic caeca肝盲囊；in为intestine肠；mu为muscle肌肉；nc为neural cord神经管；no为notochord脊索；pg为pharyngeal gill咽鳃区；标尺：200μm。
10.图2为文昌鱼amphierk1/2氨基酸序列的比对分析。
11.图3为青岛文昌鱼amphierk1/2蛋白的进化分析。
具体实施方式
12.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
13.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
14.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
15.实施例1
16.1.青岛文昌鱼的来源和养殖
17.青岛文昌鱼(branchiostoma belcheri tsingtauense)性成熟个体采集于青岛附近沙子口海域，实验室内人工养殖：饲养于底层铺有10cm海沙的海水容器中，水温为22-15℃，盐度31.4，ph 8.0左右，空气泵供氧。每天喂以单细胞海藻，每周换水两到三次，定期清理海水容器中文昌鱼栖息沙层的卫生，使得所饲养的文昌鱼正常生长发育、产卵繁殖。
18.2.青岛文昌鱼总rna的提取
19.选取生活力强，个体较大(体长约4-5cm)的未经排精排卵的成体文昌鱼若干条，饲养于灭菌的过滤海水中，三天之内停喂饵料，使之排空消化道内的食物残渣和粪便。将新鲜成体文昌鱼放入1.5ml的eppendorf管中，加入1ml rnaiso plus(takara,shiga,japan；http://www.takarabio.com)，用研磨棒进行研磨直至组织完全破碎，保证rna样品260/280的比大于1.8(nanodrop 2000；thermo scientific,wilmington,de,usa；http://www.nanodrop.com)。cdna合成采用2ug总rna、moloney murine leukemia virus逆转录酶(promega,madison,wi,usa；http://www.promega.com)、ribonuclease inhibitor(promega)、oligo(dt)18引物和dntp。
20.3.amphierk1/2基因的扩增
21.以人、鼠等脊椎动物erk1/2的保守序列搜索ncbi数据库，发现了佛罗里达文昌鱼的同源性相对较高的未命名基因(xm_002226968)，暂将其命名为amphierk1/2。根据amphierk1/2基因的序列结合其它脊椎动物同源基因的保守序列用primer 5.0软件设计引物(表1)。引物的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。利用s1000 thermal cycler pcr仪、mwg thermal cycler pcr仪和mycycler thermal cycler pcr仪，takara的rtaq聚合酶进行退火温度梯度pcr反应。
22.表1克隆青岛文昌鱼amphierk1/2基因片段引物
[0023][0024]
4.amphierk1/2基因片段的测序
[0025]
pcr产物切胶回收根据琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书操作，pcr产物纯化回收根据普通dna产物纯化试剂盒说明书操作，pcr产物和pgm-t载体连接根据t4 dna连接酶说明书操作。试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司。质粒转化后采用蓝白斑(x-gal(40mg/ml，溶于二甲基甲酰胺)，sigma；iptg(2％，溶于水)，sigma)筛选阳性质粒，经重组子菌液pcr验证后提取质粒dna(质粒小提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司)。将含有各目的片段质粒的菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司分别进行测序。
[0026]
462bp的amphierk1/2基因片段1序列为：
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gagcagtaggttggagggtttaaggtctctgtgcagcacgttggcggagtggatgtacttgagtccccgcaggatttggtagaggaagtagcagacgtggtcgttactgagctgctgggtcttcaacagtttgtacaagtctgtttccatcaggcactgcacaatgtagctgccaacgtccttcatctcatcaatggaggctgatctgatgatgttctcaatgccaatcacgttctcatgtttaaaccttctgaggatcttgatctcgcgtagcgtcctctggcagtaagtctggtgctcgaacggactgatcttctttatggcgatgcgcttccccgtagtctggtcaaccgcagagcagaccatcccgtaagctccttctccgatgtactgaagtccgctgtaccgcggcccgacctcgaaactctgcccacgaaccacctcaacattcggtctgccagc(seq id no.2)
[0028]
此片段与佛罗里达文昌鱼amphierk1/2基因的同源序列一致性为92％。
[0029]
5.文昌鱼成体组织原位杂交
[0030]
原位杂交过程中所用到的玻璃器皿及金属工具都要在180℃烘烤4h后使用。塑料制品在0.1％的depc水浸泡过夜，高压灭菌烘干后使用，避免外源性rna酶污染。
[0031]
选取生活力强，个体较大(体长约4-5cm)的未经排精排卵的成体文昌鱼若干条，分别切取雄性和雌性的各部分体段，用新配制的4％多聚甲醛固定液室温固定1h或4℃固定过夜，然后经100％、95％、80％、70％系列梯度酒精(depc水配制)脱水，-20℃保存，用于石蜡包埋。用德国leica切片机将包埋块切成8μm薄片，经过贴片，烘片及脱蜡复水后，进行预杂交及杂交，经显色后封片，光镜观察并拍照。
[0032]
成体组织切片原位杂交结果显示，amphierk1/2在表皮(图1a)、肠(图1a)、脊索鞘(图1a)、性腺(图1b)、肝盲囊(图1c)、内柱(图1c)中都检测到强烈的表达信号，在神经管的室管膜细胞(图1a)、鳃裂(图1c)中检测到的表达信号相对弱一点(图1b)，而在肌肉(图1a、图1c)中则没有检测到表达信号。
[0033]
6.amphierk1/2蛋白序列、同源性和进化分析
[0034]
用得到的青岛文昌鱼amphierk1/2基因的全序列，在ncbi上进行blastx比对和orf finder，获得了开放阅读框的位置，然后用生物软件dnaman演绎其氨基酸序列。在生物网站上对演绎的蛋白序列的结构进行分析。根据ncbi genbank非冗余序列数据库(nr)中blastx的结果，结合ncbi蛋白数据库中检索，获得各物种中相应的同源蛋白的氨基酸序列，采用
dnaman生物软件构建进化树。
[0035]
amphierk1/2蛋白的氨基酸序列为：
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agrpnvevvrgqsfevgprysglqyigegaygmvcsavdqttgkriaikkispfehqt ycqrtlreikilrrfkhenvigieniirsasidemkdvgsyivqclmetdlykllktqqlsnd hvcyflyqilrglkyihsanvlhrdlkpsnlll(seq id no.1)。
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通过对佛罗里达文昌鱼amphierk1/2蛋白氨基酸序列在ncbi中进行blastp发现文昌鱼amphierk1/2与黄瓜根结线虫(meloidogyne incognita,abi96897)和红尾肉蝇(sarcophaga crassipalpis,baf75365)、甘蓝根结线虫(meloidogyne artiellia,cad56894)、赤拟谷盗(tribolium castaneum,xp_966833)、豌豆蚜(acyrthosiphon pisum,xp_001952106)、意蜂(apis mellifera,xp_393029)和家蚕(bombyx mori,np_001036921)的一致性为79％-81％；与盘鲍(haliotis discus discus,abo2669)、日本对虾(marsupenaeus japonicus,bah86598)、鲋鱼(carassius auratus,aca60748)和斑马鱼(danio rerio,aay57805)的一致性为78％-81％；与多刺海星(marthasterias glacialis,cad60453)的一致性为82％；与爪蟾(xenopus laevis,np_001081344)的一致性为81％；与鸡(gallus gallus,np_989481)的一致性为79％；与小鼠(mus musculus,np_036079)、家犬(canis familiaris,xp_860716)和牛(bos taurus,np_786987)等哺乳动物及人(homo sapiens,abd60303)的一致性为79％-81％，发现erk1/2蛋白之间具有较高的同源性，且都含有erk1/2的酶激活位点三肽模块tey(图2所示)。
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由图3的进化树可以看出，在amphierk1/2蛋白的进化过程中，佛罗里达文昌鱼amphierk1/2与多刺海星(marthasterias glacialis,cad60453)该蛋白的进化地位比较接近。文昌鱼的amphierk1/2蛋白处于脊椎动物与无脊椎动物该蛋白的进化地位之间。

技术特征：
1. 一种从青岛文昌鱼中筛选的抗病免疫基因amphierk1/2的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。2.编码权利要求1所述的蛋白的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.2所示。4.含有权利要求2或3所述的基因的载体。5.含有权利要求2或3所述的基因或含有权利要求4所述的载体的宿主细胞。6.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的载体在制备青岛文昌鱼抗病制剂中的应用。7.权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的载体在制备转基因青岛文昌鱼中的应用。

技术总结
本发明公开了一种青岛文昌鱼免疫相关AmphiERK1/2蛋白的制备及应用。本发明从青岛文昌鱼为中首次筛选克隆了AmphiERK1/2基因，明确了AmphiERK1/2在青岛文昌鱼里的表达及进化分析，为脊椎动物免疫系统的发育提供理论基础。础。础。


技术研发人员：魏金环 陈忠科
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/8/13