一种钩吻碱胶体金检测试纸、制备方法及应用与流程

1.本发明属于生物化工和生物检测技术领域，具体涉及一种钩吻碱半抗原、胶体金标记钩吻碱单克隆抗体以及钩吻碱胶体金快速检测试纸条的制备方法与应用。


背景技术：

2.钩吻(gelsemium elegans)为龙胆亚目马钱科木质藤本植物，又名断肠草、大茶药、胡蔓藤等，广泛分布于我国南方地区。其全株均有剧毒，误食少量即可致人死亡。由于钩吻植株的花、根分别与常用中草药金银花、五指毛桃等外观相似，民间因误食、误用等造成钩吻中毒和致死的事件频繁发生。钩吻中毒已成为我国南方地区常发的恶性中毒事件。因此，亟需开发出高特异性、高灵敏度、快速、简便的分析方法，为防范钩吻的误食误用及其中毒的诊断和鉴别提供技术支持。
3.生物碱类化合物是钩吻的毒性成分，其中钩吻碱(gelsemine)是钩吻植物的特征性成分，其在钩吻植株的根、茎、叶、花和果实中均有分布且含量较高。目前，检测钩吻碱的方法有分光光度法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。以上均为仪器分析法，其样本制备繁琐、仪器操作复杂、分析成本昂贵且耗费时间长，无法满足钩吻中毒预防的快速检测和事故现场检测需要。基于抗原抗体特异性识别的免疫分析法，如胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附法等具有简单快捷、特异性强、灵敏度高、稳定性好等特点，可以实现对毒性物质的快速检测。目前，尚无钩吻生物碱快速检测试纸条的相关报道。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种钩吻碱半抗原、胶体金标记钩吻碱单克隆抗体以及钩吻碱胶体金检测试纸条。
5.本发明的目的通过下述技术方案实现：
6.一种钩吻碱半抗原，所述钩吻碱半抗原的结构如式i所示：
[0007][0008]
所述钩吻碱半抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0009]
将3-巯基丙酸、安息香双甲醚和二氯甲烷在试管中混匀。称取钩吻碱于石英坩埚中，将以上溶液加入坩埚中。在磁力搅拌下，用紫外灯照射反应30～60min。反应完成后蒸干溶剂，经硅胶柱层析纯化得到钩吻碱半抗原。
[0010]
一种胶体金标记钩吻碱单克隆抗体，所述胶体金标记钩吻碱单克隆抗体为胶体金与钩吻碱单克隆抗体偶联得到；
[0011]
所述钩吻碱单克隆抗体由钩吻碱抗原通过动物免疫得到；
[0012]
所述钩吻碱抗原由钩吻碱半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白和鸡卵清白蛋白的一种或以上。
[0013]
一种钩吻碱胶体金检测试纸，所述胶体金检测试纸的组件包括试纸条、微孔和吸管，所述微孔内包括胶体金标记钩吻碱单克隆抗体，为胶体金与钩吻碱单克隆抗体偶联得到；
[0014]
所述胶体金的制备包括如下步骤：
[0015]
将氯金酸加热至沸腾，加入柠檬酸三钠溶液，待溶液颜色变成亮红色，继续煮沸15min，自然冷却至室温得到胶体金溶液；
[0016]
所述胶体金标记单克隆抗体的制备包括如下步骤：
[0017]
将胶体金溶液调至弱碱性，加入钩吻碱的单克隆抗体，随后加入牛血清白蛋白(bsa)继续反应得到胶体金标记单克隆抗体沉淀，离心、重悬即得胶体金标记单克隆抗体；
[0018]
所述试纸条的组件包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，所述底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次连接；
[0019]
所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线包被能与钩吻碱单克隆抗体结合的钩吻碱偶联抗原，所述质控线包被能与钩吻碱单克隆抗体结合的羊抗鼠igg二抗；所述包被划线为采用点膜仪制成，钩吻碱偶联抗原包被量为1.5μg/cm2，羊抗鼠igg二抗包被浓度为1.5μg/cm2；
[0020]
所述试纸条的组装为将样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次搭接在底板上，样品垫和吸收垫分别压在硝酸纤维素膜上方3mm；
[0021]
所述钩吻碱胶体金检测试纸条的检测原理是采用竞争法免疫层析技术，使待测样品中的钩吻碱和检测线上包被的钩吻碱抗原与胶体金标记的钩吻碱单克隆抗体发生竞争形式的结合。若待测样品中含有钩吻碱，在微孔温育过程中将与胶体金标记的钩吻碱单克隆抗体结合，从而抑制了胶体金标记的钩吻碱单克隆抗体与检测线上包被的钩吻碱抗原相结合，通过检测线和质控线颜色比对可得到检测结果。
[0022]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0023]
(1)本发明的钩吻碱半抗原和胶体金标记单克隆抗体，可应用于免疫层析方面的检测，为建立快速、简便、特异、灵敏的钩吻碱的检测方法提供了基础。
[0024]
(2)本发明的钩吻碱胶体金检测试纸条，应用胶体金免疫层析原理，通过试纸中检测线与质控线颜色比对来检测样品中钩吻碱的残留量，可快速准确地检测出样品是否含有钩吻碱，能够满足对钩吻中毒现场快速检测的需求，具有操作简便、检测快速、特异性强、成本低廉的特点，应用前景广阔。
附图说明
[0025]
图1是钩吻碱半抗原的制备流程图；
[0026]
图2是钩吻碱(a)和钩吻碱半抗原(b)的质谱图；
[0027]
图3是钩吻碱胶体金检测试纸条的结构示意图；
[0028]
图4是试纸条结果判定示意图。
具体实施方式
[0029]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0030]
实施例1、钩吻碱半抗原的制备
[0031]
将3-巯基丙酸(250mg，2.355mmol)、安息香双甲醚(35mg，0.137mmol)和二氯甲烷(9ml)在试管中混匀。称取钩吻碱(65mg，0.202mmol)于50ml石英坩埚中，将以上溶液加入坩埚中。在磁力搅拌下，用紫外灯照射反应30～60min。反应完成后蒸干溶剂，经硅胶柱层析纯化得到无色油状物。所得产物进行高分辨质谱分析，结果如图2所示，其精确质量数(m/z 429.4[m+h]
+
，c
23h28
n2o4s
+
)较钩吻碱质量数增加106da，表明目标物合成成功，与预期结果相符。
[0032]
实施例2、免疫原的制备
[0033]
称取钩吻碱半抗原10mg，加入无水n,n-二甲基甲酰胺1ml溶解。随后加入n-羟基丁二酰亚胺6mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐7mg，室温反应过夜，得到半抗原溶液a液。称取牛血清白蛋白35mg，加入0.1m硼酸缓冲液3.5ml溶解，滴加n,n-二甲基甲酰胺1ml，得到b液。将a液滴加到b液中，室温反应过夜，用生理盐水透析2～3d，得到钩吻碱-牛血清白蛋白偶联物，即为免疫原，离心分装，-20℃保存，备用。
[0034]
实施例3、包被原的制备
[0035]
称取钩吻碱半抗原10mg，加入无水n,n-二甲基甲酰胺1ml溶解。随后加入二异丙基乙胺6ul，冰浴条件下加入氯甲酸异丁酯5ul，0℃反应30min，得到半抗原溶液a液。称取卵清蛋白70mg，加0.1m硼酸缓冲液7ml溶解，滴加n,n-二甲基甲酰胺1ml，得到b液。将a液滴加到b液中，室温反应过夜，pbs缓冲液透析2～3d，得到包被原，离心分装，-20℃保存，备用。
[0036]
实施例4、钩吻碱单克隆抗体的制备
[0037]
将钩吻碱免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化，免疫6周龄balb/c小鼠，取免疫后的小鼠脾脏细胞与sp 2/0-ag14骨髓瘤细胞融合，经过筛选、克隆和亚克隆等程序获得能稳定分泌钩吻碱的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并制备腹水。腹水室温静置1h，4℃静置过夜，离心收集中间澄清层，采用饱和硫酸铵发进行纯化，得到钩吻碱单克隆抗体溶液，-20℃保存，备用。
[0038]
实施例5、钩吻碱单克隆抗体-胶体金标记物的制备
[0039]
取100ml 0.01％氯金酸溶液加热至沸腾，快速搅拌下加入1％柠檬酸三钠溶液2.0ml。待氯金酸水溶液变为亮红色，继续加热反应15min，自然冷却后，4℃避光保存，备用。在磁力搅拌下，用0.1mol/l k2co3溶液调节胶体金溶液ph 7.5，每毫升胶体金溶液中加入80μg钩吻碱单克隆抗体，混匀后室温反应10min，加入10％bsa水溶液。涡旋震荡混匀，静置10min，离心、洗涤、重悬，4℃保存，备用。
[0040]
实施例6、微孔试剂的制备
[0041]
将100μl钩吻碱单克隆抗体-胶体金标记物加入微孔板中，置于冷冻干燥机中预冻3h，真空干燥20h，得到微孔试剂。
[0042]
实施例7、钩吻碱胶体金检测试纸条的制备
[0043]
1.用点膜仪将钩吻碱包被原包被于硝酸纤维素膜的检测线(t线)处，羊抗鼠igg二抗包被于硝酸纤维素膜的质控线(c线)上，于37℃烘箱中干燥5h。
[0044]
2.以pvc板作背衬，按顺序复合上样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫(图3)。将复合好的塑料薄板切割成5mm
×
85mm的条带，放入带有干燥剂的容器中密封保存，备用。
[0045]
实施例8、样本中钩吻碱的检测
[0046]
1.样品前处理：取1g干燥的新鲜钩吻枝叶加入100ml超纯水，回流1h，汤剂恢复至室温，混匀后静置1min，上清液为钩吻样品a待测液；取1g干燥的新鲜钩吻枝叶加入1000ml超纯水，回流1h，汤剂恢复至室温，混匀后静置1min，上清液为钩吻样品b待测液；王老吉凉茶为待测液c。
[0047]
2.检测：取200μl待测液于红色试剂微孔中，抽吸5～10次混匀，室温孵育3min。将测试条插入微孔中，室温孵育6min。从微孔中取出测试条，轻轻刮去试纸条下端的样品垫，进行结果判读(图4)，超过5min后的结果判读无效。
[0048][0049]
3.结果判读：
[0050][0051]
4.特异性实验
[0052]
使用该试纸条检测质量浓度为50mg/kg的苯海拉明、马来酸氯苯那敏等药物标准品溶液。检测结果均呈阴性，表明该试纸条对以上药物无交叉，对钩吻碱的特异性较好。
[0053]
5.保质期实验
[0054]
用三批常规生产的试纸条做保质期实验，于室温环境下保存。每个月随机选取一
定数量的试纸条对含有钩吻碱0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg的质控样本进行检测，每组重复3次，连续测定18个月。前13个月内试纸条检测结果无异常，在第14～18个月的检测中，试纸条偶有假阳性结果，因此确定保质期为12个月。
[0055]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种钩吻碱半抗原，其特征在于，所述钩吻碱半抗原的结构如式i所示：2.根据权利要求1所述的钩吻碱半抗原，其特征在于，所述钩吻碱半抗原的制备包括如下步骤：将3-巯基丙酸、安息香双甲醚和二氯甲烷在试管中混匀，称取钩吻碱于石英坩埚中，将以上溶液加入坩埚中；在磁力搅拌下，用紫外灯照射反应30～60min，反应完成后蒸干溶剂，经硅胶柱层析纯化得到钩吻碱半抗原。3.一种胶体金标记钩吻碱单克隆抗体，其特征在于，所述胶体金标记钩吻碱单克隆抗体为钩吻碱单克隆抗体与胶体金偶联得到，所述钩吻碱单克隆抗体由钩吻碱全抗原通过动物免疫得到，所述钩吻碱全抗原由权利要求1所述钩吻碱半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白或鸡卵清白蛋白的一种或以上。4.根据权利要求1或2所述钩吻碱半抗原或权利要求3所述钩吻碱全抗原在检测钩吻碱中的应用。5.根据权利要求1或2所述钩吻碱半抗原或权利要求3所述钩吻碱全抗原在制备钩吻碱特异性抗体中的应用。6.根据权利要求3所述胶体金标记钩吻碱单克隆抗体或钩吻碱单克隆抗体在检测钩吻碱中的应用。7.根据权利要求3所述胶体金标记钩吻碱单克隆抗体或钩吻碱单克隆抗体在制备钩吻碱免疫层析试纸条中的应用。8.由权利要求3所述胶体金标记钩吻碱单克隆抗体或钩吻碱单克隆抗体在制备钩吻碱酶联免疫分析试剂盒中的应用。9.一种钩吻碱胶体金检测试纸条，其特征在于，所述胶体金检测试纸条的组件包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、微孔和吸管，所述微孔中含有权利要求3所述胶体金标记钩吻碱单克隆抗体。10.由权利要求9所述的钩吻碱胶体金检测试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线包被钩吻碱偶联抗原，所述质控线包被羊抗鼠igg二抗。

技术总结
本发明公开了一种钩吻碱半抗原、胶体金标记钩吻碱单克隆抗体以及钩吻碱胶体金快速检测试纸条的制备方法与应用，涉及生物化工和生物检测技术领域。所述钩吻碱半抗原的结构如I所示：所述钩吻碱胶体金检测试纸条应用胶体金免疫层析原理，通过试纸中检测线与质控线比色来检测样品中钩吻碱的残留量，可快速准确地检测出样品是否含有钩吻碱，能够满足对钩吻中毒现场快速检测的需求，具有操作简便、检测快速、特异性强、成本低廉的特点，应用前景广阔。应用前景广阔。


技术研发人员：王磊 叶文才 王炳志 杨星星 黎尼平 麻楠
受保护的技术使用者：深圳市易瑞生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/13