一种脂滴荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于细胞荧光成像技术领域，具体涉及一种脂滴荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.脂滴(ld)是哺乳动物中普遍存在的膜包裹的细胞器，主要存在于细胞质中，少部分存在于核内。ld对各种细胞活动都发挥着至关重要的作用。它可以用来储存脂质，防止细胞脂中毒。许多疾病也与ld生命周期和生理功能的失调有关。如肥胖、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、脂肪营养不良等。此外，ld与细胞内大部分细胞器相互作用，如细胞核、线粒体和内质网等等。ld对维持细胞器的正常功能也具有重要意义，它能在内质网应激时保护内质网，也可以在自噬过程中保护线粒体免受损伤。因此，发展活细胞及固定后的细胞中的ld成像探针在细胞生物学和生物医药研究中具有重要意义。
3.现有技术中的商业化ld探针bodipy 493/503以及nile red已经被广泛用于细胞ld的染色和成像分析，然而，由于上述探针对内质网有明显的染色信号，以及较低的斯托克位移，导致高背景信号，并且不适用于固定后细胞的染色。这限制了它们的应用，甚至得出不可靠的结论。


技术实现要素：

4.本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种脂滴荧光探针及其制备方法和应用。
5.本发明的技术方案如下：
6.一种脂滴荧光探针，其结构式为
7.上述脂滴荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
8.(1)将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶解于dmf中，然后加入3,5-双(三氟甲基)苯甲胺，于45-55℃搅拌反应3-5h，直至4-溴-1,8-萘二甲酸酐转化完全；
9.(2)在步骤(1)所得的物料中加入n,n-二甲基乙二胺，接着于65-75℃反应1-3h，接着去除溶剂，再经硅胶柱层析纯化获得中间化合物；
10.(3)在dcm中加入上述中间化合物、三乙胺和二碳酸二叔丁酯，室温反应10-15h，再经硅胶柱层析纯化获得所述脂滴荧光探针。
11.在本发明的一个优选实施方案中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐、3,5-双(三氟甲基)苯甲胺和n,n-二甲基乙二胺的摩尔比为1:1:5，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐和dmf的比例为10mmol:30ml。
12.在本发明的一个优选实施方案中，所述中间化合物、三乙胺和二碳酸二叔丁酯的
摩尔比为0.59:1.77:0.65，所述中间化合物与dcm的比例为0.59mmol:5ml。
13.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中，硅胶柱层析纯化的洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。
14.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中，硅胶柱层析纯化的洗脱剂为二氯甲烷:石油醚＝2:1。
15.上述脂滴荧光探针在细胞中脂滴实时荧光成像中的应用。
16.在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞为活细胞或4％多聚甲醛固定后的细胞。
17.一种细胞中脂滴实时荧光成像方法，使用上述脂滴荧光探针。
18.在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞为活细胞或4％多聚甲醛固定后的细胞。
19.本发明的有益效果是：
20.1、本发明能实现活细胞及固定后的细胞ld成像，能够特异性标记ld，反映ld的动态变化，解决传统商业化ld探针的高背景信号及不能用于固定细胞的染色等问题。
21.2、本发明合成工艺简单，产物稳定性高，易于推广。
22.3、本发明在细胞内保留时间长，毒性小。
附图说明
23.图1为本发明实施例3的ld-6f在不同极性下的荧光吸收光谱和发射光谱。
24.图2为本发明实施例5的ld-6f在细胞中标记ld的激光共聚焦显微图。
25.图3为本发明实施例6的ld-6f在细胞中与商业化ld探针bodipy 493/503以及nile red共定位的激光共聚焦显微图。
26.图4为本发明实施例7的ld-6f在细胞中与商业化ld探针bodipy 493/503以及nile red染色背景比较图(白色箭头所指为商业化ld探针的背景信号)。
27.图5为本发明实施例8的ld-6f光稳定性的激光共聚焦显微图。
28.图6为本发明实施例9的ld-6f和商业化ld探针bodipy 493/503对4％多聚甲醛固定细胞中ld染色的激光共聚焦显微图。
29.图7为本发明实施例10的ld-6f用于追踪活细胞中ld动态变化的激光共聚焦显微图。
30.图8为本发明实施例11中的ld-6f通过商业化试剂盒cck8检测探针的细胞毒性实验数据图。
具体实施方式
31.以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
32.实例例1制备荧光探针ld-6f
33.本实施例的合成路线如下：
[0034][0035]
具体包括如下步骤：
[0036]
(1)将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(2.75g，10.00mmol)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf，30.00ml)中，然后加入3,5-双(三氟甲基)苯甲胺(2.43g，10.00mmol)。上述反应体系在50℃加热条件下搅拌4h，经薄层色谱分析4-溴-1,8-萘二甲酸酐转化完全。在上述反应液体系中加入n,n-二甲基乙二胺(4.41g，50.00mmol)，将温度升高至70℃，加热反应2h，经薄层色谱分析反应完全，用油泵抽干溶剂。然后用硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20：1)分离纯化得到黄色固体产物s1(72％，3.67g)。
[0037]
(2)在二氯甲烷(dcm,5.00ml)中加入化合物s1(300.00mg，0.59mmol)和三乙胺(tea，179mg，1.77mmol)，然后加入二碳酸二叔丁酯(142.00mg，0.65mmol)，室温下反应过夜。将上述反应体系旋干，用硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/石油醚＝2：1)分离纯化得到黄色固体产物ld-6f(95％，340mg)。1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ8.60(d,j＝7.2hz,1h),8.48(dd,j＝24.0,8.2hz,2h),7.99(s,2h),7.75(s,1h),7.68(d,j＝8.5hz,1h),7.25
–
7.17(m,1h),5.44(s,2h),3.62
–
3.42(m,4h),3.13(d,j＝15.3hz,3h),2.75(d,j＝105.7hz,3h),1.46
–
1.33(m,9h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ163.85,140.02,133.12,132.95,131.77,131.50,131.50,130.34,129.25,126.52,124.35,122.64,122.18,121.48,116.62,115.37,114.83,113.31,79.74,54.11,46.49,46.10,42.67,41.96,28.38.maldi-tof ms calc’d for c
30h29
f6n3o4(m+na
+
)m/z 632.1954,found 632.401.
[0038]
实施例2配制浓度为2mm的ld-6f的标准溶液
[0039]
称取1.128mg的实施例1制得的ld-6f溶于1ml的dmso。即得2mmol/l(2mm)的ld-6f的标准溶液。
[0040]
实施例3收集ld-6f不同极性下的荧光发射光谱
[0041]
称取6.09mg的实施例1制得的ld-6f溶于1ml的1,4-二氧六环中。即得10mmol/l(10mm)的ld-6f的标准溶液。
[0042]
取上述标准溶液1μl稀释至1000μl包含有不同比例1,4-二氧六环的水溶液中，得10μm的荧光探针ld-6f溶液。取400μl上述溶液,检测荧光探针ld-6f(10μm)在不同极性下(v
1,4-二氧六环
：v
总
＝30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％)，激发波长为410nm的吸收光谱和荧光发射光谱。实验结果如图1所示，荧光探针ld-6f对极性有响应，成功标记了细胞中的ld。
[0043]
实施例4配制浓度为2μm ld-6f的细胞培养溶液
[0044]
取实施例2配制的1μl ld-6f标准溶液与1ml细胞培养溶液混合，得到含有2μmol/l(2μm)ld-6f的细胞培养液。
[0045]
实施例5共聚焦荧光显微镜评估ld-6f在细胞ld中的分布
[0046]
将含有实施例4配制的2μm ld-6f的细胞培养液与生长在35mm玻璃底培养皿上的mef细胞共同孵育1h，用新鲜的细胞培养液洗三遍，再用共聚焦荧光显微镜对细胞内荧光信号进行采集。
[0047]
从图2可以观察到ld-6f的斑点状细胞器，与ld形态一致，说明ld-6f在ld中富集，并能发射出蓝绿色荧光。
[0048]
实施例6共聚焦荧光显微镜评估ld-6f在细胞中的背景信号ld探针bodipy 493/503以及nile red的共定位标记
[0049]
将含有实施例4配制的2μm ld-6f、2μm bodipy 493/503以及1μm nile red的细胞培养液分别或先后与生长在35mm玻璃底培养皿上的野生型mef细胞(5盘)孵育0.5h，用新鲜的细胞培养液洗三遍，换上新鲜预热的细胞培养液，再用共聚焦荧光显微镜观察三种探针的荧光标记。从图3可以看出，三种探针都标记了ld，且ld-6f标记的ld荧光与bodipy 493/503以及nile red标记的ld荧光有共定位。
[0050]
实施例7共聚焦荧光显微镜评估ld-6f探针、商业化ld探针bodipy 493/503以及nile red在细胞中与商业化
[0051]
将实施例4配制的含有2μm ld-6f、2μm bodipy 493/503以及1μm nile red的细胞培养液分别与生长在35mm玻璃底培养皿上的野生型mef细胞(5盘)孵育0.5h，将含有2μm ld-6f的细胞培养液分别与生长在35mm玻璃底培养皿上的野生型mef细胞(5盘)孵育1h。然后用新鲜的细胞培养液洗三遍，换上新鲜预热的细胞培养液，再用共聚焦荧光显微镜观察三种探针的荧光标记。从图4可以看出，三种探针都标记了ld，然而，bodipy 493/503以及nile red标记ld时呈现高背景，但ld-6f标记的ld没有明显的背景信号。
[0052]
实施例8共聚焦荧光显微镜评估ld-6f在细胞ld中的光稳定性
[0053]
将实施例4配制的含有2μm ld-6f的细胞培养液与生长在35mm玻璃底培养皿上的mef细胞共同孵育1h，用新鲜的细胞培养液洗三遍，在共聚焦荧光显微镜上用激发光对细胞进行持续的照射，总计60min。从0min开始，每隔6min在5个焦平面上进行拍照，对细胞内荧光信号进行采集。从图5可以看出，ld-6f的荧光强度在整个过程中没有明显的减弱。
[0054]
实施例9 ld-6f用固定后细胞的染色以及染色后固定细胞的荧光显微成像
[0055]
将实施例4配制的含有2μm ld-6f的细胞培养液与生长在35mm玻璃底培养皿上的mef细胞共同孵育1h，用pbs洗三遍，然后加入1ml 4％多聚甲醛在室温下固定15min，再用pbs洗三遍后拍照；或将生长在35mm玻璃底培养皿上的mef细胞用pbs洗三遍，加入1ml 4％多聚甲醛在室温下固定15min，再用pbs洗三遍后，用含有2μm ld-6f的pbs染色1h，最后用pbs洗三遍后，在共聚焦荧光显微镜上拍照分析。从图6可以看出，不管是染色后固定还是固定后染色，ld-6f都能对活细胞的ld进行荧光显微成像，而商业化ld探针bodipy 493/503不能对固定后的细胞中ld进行正常染色。
[0056]
实施例10 ld-6f用于观察细胞ld变化的荧光显微成像
[0057]
a)血清饥饿诱导的ld变化
[0058]
将mef细胞铺于35mm玻璃底培养皿上，用全培养基培养24h后换上不含血清的培养液，继续培养24h。然后用pbs洗三遍，将含有2μm ld-6f的细胞培养液与mef细胞共同孵育1h，用pbs洗三遍。以不加血清的培养液培养0h的细胞作为对照，用激光共聚焦显微镜拍照分析。从图7可以看出，血清饥饿的细胞中ld探针的信号几乎消失；而没有饥饿的细胞中，有明显的探针信号。说明该探针追踪到了这一变化过程。
[0059]
b)油酸诱导的ld变化
[0060]
将hela细胞铺于35mm玻璃底培养皿上，24h后换上含有200μm油酸(oa)的细胞培养
液继续培养24h。然后用pbs洗三遍，将含有2μm ld-6f的细胞培养液与hela细胞共同孵育1h，用pbs洗三遍。以不加oa培养的细胞作为对照，用共聚焦荧光显微镜拍照分析。从图7可以看出，ld-6f在含oa培养的细胞中显示出更多的荧光斑点，表明有更多的ld产生；而没用oa培养的细胞中，ld-6f的信号明显更少。
[0061]
实施例11探针ld-6f的细胞毒检测
[0062]
本实施例采用商业化试剂盒cck-8detection kit(品牌cellcook，货号ct01b)进行探针的细胞毒性检测。根据试剂盒使用指南，简要操作如下：
[0063]
消化收集hela细胞，离心取上清，重悬后将其密度稀释至5000个/100μl的浓度。取96孔板，按100μl/孔将细胞铺于45个孔中。培养24h后将细胞分为3个大组，每个大组15个孔，再将这15个孔分为5个小组，每组3个孔。每个小组分别做如下处理：
[0064]
1.对照；2.加1μm ld-6f；3.加2μm ld-6f；4.加5μm ld-6f；5.加10μm ld-6f；
[0065]
处理1h后，用pbs洗三遍，再加入100μl细胞培养液，分别在培养0h、24h和48h时加入10μl cck-8，放在细胞培养箱孵育0.5h，然后用用酶标仪测
[0066]
450nm处的吸光度。另外，每个时间点均需设置3个孔的空白对照(仅加100μl的培养液)，同样按上述方法测出空白孔吸光度。
[0067]
按下面的计算公式算出细胞相对活力，即可评估ld-6f毒性大小：
[0068]
细胞相对活力＝[(as-ab)/(ac-ab)]
×
100％
[0069]
as：实验孔吸光度；
[0070]
ac：对照孔吸光度；
[0071]
ab：空白孔吸光度。
[0072]
结果如图8所示，可见ld-6f在细胞内保留时间长，毒性小。
[0073]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

技术特征：
1.一种脂滴荧光探针，其特征在于：其结构式为2.权利要求1所述的脂滴荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶解于dmf中，然后加入3,5-双(三氟甲基)苯甲胺，于45-55℃搅拌反应3-5h，直至4-溴-1,8-萘二甲酸酐转化完全；(2)在步骤(1)所得的物料中加入n,n-二甲基乙二胺，接着于65-75℃反应1-3h，接着去除溶剂，再经硅胶柱层析纯化获得中间化合物；(3)在dcm中加入上述中间化合物、三乙胺和二碳酸二叔丁酯，室温反应10-15h，再经硅胶柱层析纯化获得所述脂滴荧光探针。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐、3,5-双(三氟甲基)苯甲胺和n,n-二甲基乙二胺的摩尔比为1:1:5，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐和dmf的比例为10mmol:30ml。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述中间化合物、三乙胺和二碳酸二叔丁酯的摩尔比为0.59:1.77:0.65，所述中间化合物与dcm的比例为0.59mmol:5ml。5.如权利要求2至4中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，硅胶柱层析纯化的洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝20:1。6.如权利要求2至4中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，硅胶柱层析纯化的洗脱剂为二氯甲烷:石油醚＝2:1。7.权利要求1所述的脂滴荧光探针在细胞中脂滴实时荧光成像中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述细胞为活细胞或4％多聚甲醛固定后的细胞。9.一种细胞中脂滴实时荧光成像方法，其特征在于：使用权利要求1所述的脂滴荧光探针。10.如权利要求9所述的一种细胞中脂滴实时荧光成像方法，其特征在于：所述细胞为活细胞或4％多聚甲醛固定后的细胞。

技术总结
本发明公开了一种脂滴荧光探针及其制备方法和应用，其结构式为本发明能实现活细胞及固定后的细胞LD成像，能够特异性标记LD，反映LD的动态变化，解决传统商业化LD探针的高背景信号及不能用于固定细胞的染色等问题。题。题。


技术研发人员：韩家淮 邹小雪 温世雄 韩守法
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/8/13