一种用于果实基因组DNA提取的裂解液、试剂盒及提取方法与流程

一种用于果实基因组dna提取的裂解液、试剂盒及提取方法
技术领域
1.本发明涉及基因组dna提取技术领域，具体涉及一种用于果实基因组dna提取的裂解液、试剂盒及提取方法。


背景技术：

2.水果含有大量的膳食纤维，可以维持肠道的功能，维持正常的菌群，保持人体的营养均衡。长期坚持吃水果可以使人体的皮肤红润、有光泽，因为水果中还有大量的天然植物化合物，可以改善体内的激素代谢。水果中还含有多种的维生素、微量元素，长期吃水果可以预防人体的疾病发生，增进食欲。因此，水果已经成为人们生活中的一部分。
3.随着生物技术的发展以及人们对高品质水果需求的增长，为了培育出高品质的水果，近年来，越来越多的研究人员开始聚焦于水果果实的发育机理，挖掘决定果实品质的相关基因，再通过相应的技术来提高果实的品质。而这一切研究的前提是获得水果果实基因组dna。分析这些果实的dna，对生产抗病、高产、美味的果实有重要意义。
4.由于果实中纤维和酚类含量较多，目前市面上的果实基因组dna提取方法，研磨和裂解效果不佳，得到的dna纯度较低或者得率较低，不能满足后续实验分析要求，同时，对果实种类适用性不高。因此，有必要研发出一种对果实种类适应性广，果实基因组dna提取纯度和得率高的提取试剂盒和提取方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种用于果实基因组dna提取的裂解液、试剂盒及提取方法，本方法可以简单、快速地从常见果实中，比如苹果、梨、桃子、杏、葡萄、桔子等水果果实中提取高质量的、可直接应用于下游分子实验的dna。同时，该试剂盒及提取方法可搭配磁珠纯化体系，进行大批量的样本提取。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明一方面提供了一种用于果实基因组dna提取的裂解液，所述裂解液包括ctab、十二烷基硫酸钠（sds）、乙基苯基聚乙二醇（np-40）、nacl、tris-hcl、巯基乙醇和乙二胺四乙酸（edta）。
7.进一步地，所述裂解液中，ctab的质量浓度为0.5-1.5%，sds的质量浓度为0.5-1.5%，np-40的质量浓度为0.5-1.5%，nacl的浓度为1-3mol/l，tris-hcl的浓度为0.05-0.15mol/l，巯基乙醇的含量为0.1-0.3%，edta的浓度为0.05-0.15mol/l。
8.更进一步地，所述裂解液中，ctab的质量浓度为1-1.5%，sds的质量浓度为1-1.5%，np-40的质量浓度为1-1.5%，nacl的浓度为1-3mol/l，tris-hcl的浓度为0.05-0.15mol/l，巯基乙醇的含量为0.1-0.3%，edta的浓度为0.05-0.15mol/l。
9.优选裂解液为：ctab的质量浓度为1%，sds的质量浓度为1%，np-40的质量浓度为1%，nacl的浓度为2m，tris-hcl的浓度为0.1m，巯基乙醇的含量为0.2%，edta的浓度为0.1m。
10.本发明另一方面提供了一种果实基因组dna提取的试剂盒，包括研磨材料、前文所
述的裂解液、绑定液、漂洗液1、漂洗液2以及洗脱液。
11.进一步地，所述研磨材料为陶瓷研磨珠、钢珠和玻璃砂的混合材料。其中，陶瓷研磨珠直径1-3mm，钢珠直径4-6mm，优选地研磨材料组成为：0.2g 2mm陶瓷研磨珠、1颗5mm钢珠和0.1g的玻璃砂。
12.进一步地，所述绑定液包括磁珠溶液、peg8000和nacl，磁珠为硅基磁珠，peg8000的质量浓度为20-40%，nacl的浓度为1-3mol/l。优选绑定液为peg8000的质量浓度为30%，nacl的浓度为2mol/l。
13.进一步地，所述漂洗液1包括异硫氰酸胍、盐酸胍、乙醇和tris-hcl，异硫氰酸胍的浓度为1-3mol/l，盐酸胍的浓度为2-4mol/l，乙醇的体积浓度为50-70%，tris-hcl的浓度为0.3-0.8mol/l。优选地，漂洗液1异硫氰酸胍的浓度为2mol/l，盐酸胍的浓度为3mol/l，乙醇的体积浓度为60%，tris-hcl的浓度为0.5mol/l。
14.进一步地，所述漂洗液2包括乙醇和tris-hcl，乙醇的体积浓度为60-80%，tris-hcl的浓度为0.05-0.2mol/l。优选地，漂洗液2乙醇的体积浓度为70%，tris-hcl的浓度为0.1mol/l。
15.进一步地，所述洗脱液为5-15mmol/l的tris-hcl缓冲液。优选洗脱液为10mmol/l的tris-hcl缓冲液。
16.本发明第三方面提供了一种利用前文所述的果实基因组dna提取的试剂盒提取果实基因组dna的方法，包括以下步骤：s1，容器a中加入研磨材料和待测样本，加入裂解液，研磨1-3min，然后60-70℃水浴15-30min；s2，容器a冷却至室温，加入与裂解液等体积的氯仿，震荡混匀11000-13000rpm离心4-6min；s3，吸取s2中的上清液至容器b中，加入磁珠和绑定液后置于混匀仪上，室温振荡混匀40-90s；s4，将容器b放置在磁力架上，静置，磁珠完全吸附后，弃上清；s5，向完成s4的容器b中加入漂洗液1，将容器b从磁力架上取下，放入混匀仪上，振荡混匀，静置，磁珠完全吸附后，弃上清；s6，向完成s5的容器b中加入漂洗液2，将容器b从磁力架上取下，放入混匀仪上，振荡混匀，静置，磁珠完全吸附后，弃上清；s7，将完成s6的容器b室温下晾干；s8，向晾干的容器b中加入洗脱液，从磁力架上转移到混匀仪上，振荡混匀40-90s；s9，将完成s8的容器b置于磁力架上静置2-5min，磁珠完全吸附后，将上清溶液转至容器c中，容器c中的上清液即为提取得到的dna产物。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）由直径大小和分量不同的陶瓷研磨珠、钢珠和玻璃砂组成独特的混合研磨体系，更容易破坏果实内的纤维，同时使细胞充分破裂。
18.（2）裂解液中ctab、sds、np-40三种裂解成分组合，可以更有效地裂解细胞，提高dna的得率；本发明中的裂解液在对细胞进行裂解，释放核酸的同时液能对一些杂质进行络合，裂解液中的巯基乙醇抑制果实中的酚类氧化成醌和抑制核酸酶对dna的降解，进而保护
dna。
19.（3）市售提取试剂盒大多还是采用单管过柱的方式，本发明试剂盒适用范围广，提取时间较短，试剂盒中的绑定液可以使磁珠定向吸附核酸，与核酸结构性质类似的杂质则不被吸附，漂洗液1和漂洗液2可以有效去残余的盐类物质，洗脱液将磁珠吸附的核酸洗脱下来，维持dna稳定，该试剂盒可以利用磁珠纯化，结合相关仪器设备，实现半自动化批量提取，极大提高提取效率。
20.（4）采用本发明的试剂盒及方法提取得到的dna产物得率高，质量高，dna无降解，且无蛋白质、rna等杂带产生。
附图说明
21.图1为采用本发明方法对不同果实提取dna结果的凝胶电泳图；图2为本发明与市售试剂盒的研磨材料研磨前后效果对比图；图3为采用本发明方法和市售试剂盒对果实提取dna结果的凝胶电泳图；其中，图1中，其中m为15000bp marker，1-5分别为桔子、梨、桃子、葡萄和苹果；图3中，其中，m为15000bp marker，1-6为苹果果实，其中1-3为实施例13的提取结果，4-6为市售试剂盒提取结果；7-12为葡萄果实，其中7-9为实施例13的的提取结果，10-12为市售试剂盒提取结果；13-18为桃子果实，其中13-15为实施例13的提取结果，16-18为市售试剂盒提取结果。
具体实施方式
22.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。
23.本技术中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质（如分子量，熔体指数等）是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数（例如1.1，1.5等）的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10（例如1到5）的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本技术中。
24.关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然（例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体）。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
25.术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过
程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本技术中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本技术中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由
……
组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由
……
组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
26.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
27.实施例以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
28.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
29.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
30.实施例1一、试剂配制1、配制裂解液（1l）：称取15g ctab，15g sds，15g np-40，117g nacl，2ml巯基乙醇，0.292g edta和100ml 1mol/l tris-hcl，补无菌水至1l。
31.2、配制绑定液（100ml）：取磁珠溶液10ml，30g peg8000，11.7g nacl，补无菌水至100ml。
32.3、配制漂洗液1（1l）：称取236.3g异硫氰酸胍，286.6g盐酸胍，600ml无水乙醇，500ml 1mol/l tris-hcl，补无菌水至1l。
33.4、配制漂洗液2（1l）：取700ml无水乙醇，100ml1mol/l tris-hcl，补无菌水至1l。
34.5、配制洗脱液（1l）：取10ml 1mol/l tris-hcl，补无菌水至1l。
35.二、dna提取过程1.分别取1g果实苹果、葡萄、梨的样品（果皮和果肉）于含有研磨珠、玻璃砂和钢珠的ep管中，加入1ml裂解液，研磨2min（60hz），然后65℃水浴20min。
36.2.将ep管冷却到室温，加入0.5ml的氯仿，振荡混匀后，12000rpm离心5min。
37.3、吸取全部上清液到ep管b中，加入0.5ml绑定液。将ep管b放到混匀仪上，室温振荡混匀1min。
38.4、将ep管b放置于专用磁力架上，静置1min，磁珠完全吸附后，弃上清。
39.5、向弃完上清的ep管b中，加入0.6ml漂洗液1，将ep管b从磁力加上取下，放入混匀仪上，振荡混匀30s，静置30s，磁珠完全吸附后，弃上清。
40.6、向弃完上清的ep管b中，加入0.6ml漂洗液2，将ep管b从磁力加上取下，放入混匀仪上，振荡混匀30s，静置30s，磁珠完全吸附后，弃上清。
41.7、打开ep管b盖，室温晾干5min。
42.8、将ep管b从磁力架上取下，加入80μl洗脱液，将ep管b放到混匀仪上，振荡混匀1min。
43.9、将ep管b放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将全部上清溶液转至ep管c中，即为得到的果实样本的dna产物。
44.三、dna总量检测用qubit3.0测定提取后的浓度，并计算dna的总量。
45.实施例2在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为15g、10g、10g。
46.实施例3在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为10g、10g、10g。
47.实施例4在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为10g、5g、5g。
48.实施例5在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为5g、5g、5g。
49.实施例6在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为15g、15g、0g。
50.实施例7在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为10g、10g、0g。
51.实施例8在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为10g、5g、0g。
52.实施例9在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为5g、5g、0g。
53.实施例10在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为15g、0g、0g。
54.实施例11在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为10g、0g、0g。
55.实施例12在实施例1的基础上，其他条件不变，1l裂解液中ctab，sds，np-40的添加量分别为5g、0g、0g。
56.不同配方裂解液对果实提取dna的质量结果如下表：经过系列筛选对比，结果显示，裂解液中加入ctab、sds和np-40三种裂解成分时，果实dna提取的效果是最好的，当裂解液中加入10gctab，10gsds，10gnp-40时，果实提取的dna得率最高。
57.因此，我们后续实验采用此优化好的裂解液配方。
58.实施例13一、试剂配制1、配制裂解液（1l）：称取10g ctab，10g sds，10g np-40，117g nacl，2ml巯基乙醇，0.292g edta和100ml 1mol/l tris-hcl，补无菌水至1l。
59.2、配制绑定液（100ml）：取磁珠溶液10ml，30g peg8000，11.7g nacl，补无菌水至100ml。
60.3、配制漂洗液1（1l）：称取236.3g异硫氰酸胍，286.6g盐酸胍，600ml无水乙醇，500ml 1mol/l tris-hcl，补无菌水至1l。
61.4、配制漂洗液2（1l）：取700ml无水乙醇，100ml1mol/l tris-hcl，补无菌水至1l。
62.5、配制洗脱液（1l）：取10ml 1mol/l tris-hcl，补无菌水至1l。
63.二、dna提取过程1.取0.3g果实样品（果皮和果肉）于研磨材料组成为0.2g 2mm陶瓷研磨珠、1颗5mm钢珠和0.1g的玻璃砂的ep管a中，加入700
µ
l裂解液，研磨2min（60hz），然后65℃水浴20min。其中，果实样品分别采用了桔子、梨、桃子、葡萄和苹果。
64.2.将ep管a冷却到室温，加入700
µ
l氯仿，振荡混匀后，12000rpm离心5min。
65.3、吸取600
µ
l上清液到ep管b中，加入450
µ
l的绑定液。将ep管b放到混匀仪上，室温振荡混匀1min。
66.4、将ep管b放置于专用磁力架上，静置1min，磁珠完全吸附后，弃上清。
67.5、向弃完上清的ep管b中，加入800
µ
l的漂洗液1，将ep管b从磁力加上取下，放入混匀仪上，振荡混匀30s，静置30s，磁珠完全吸附后，弃上清。
68.6、向弃完上清的ep管b中，加入800
µ
l的漂洗液2，将ep管b从磁力加上取下，放入混匀仪上，振荡混匀30s，静置30s，磁珠完全吸附后，弃上清。
69.7、打开ep管b盖，室温晾干5min。
70.8、将ep管b从磁力架上取下，加入100
µ
l洗脱液，将ep管b放到混匀仪上，振荡混匀1min。
71.9、将ep管b放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将上清溶液转至ep管c中，即为得到的dna产物。
72.三、结果检测将采用本发明方法提取得到的桔子、梨、桃子、葡萄和苹果五个不同品种的果实dna结果进行检测，电泳结果如图1所示。其中m为15000bp marker，1-5分别为桔子、梨、桃子、葡萄和苹果。
73.从凝胶电泳结果可以看出，提取的果实基因组dna主带清晰，无降解，且无蛋白质、rna等杂带。结果表明该方法提取的果实基因组dna质量较高。
74.对比例1选取桃子、葡萄和苹果的果实样品，用市售dna提取试剂盒（白垩纪生物cna20990s），采用相同的方法进行dna提取。
75.结果对比分析（1）研磨效果取相同重量的实验材料在研磨仪60hz研磨2min后，本发明的研磨材料管中的样本被充分研磨，研磨后的样本组织质地均匀，漂浮的絮状较少，大多沉淀在裂解液中，市售研磨材料中液体表面漂浮着大量的絮状物质，少量沉淀在裂解液中，如图2所示，这显示说明本发明的研磨材料研磨更充分。
76.（2）提取效果将采用本发明试剂盒和市售试剂盒提取得到的桃子、葡萄和苹果的dna进行凝胶电泳，结果如图3。其中，m为15000bp marker，1-6为苹果果实，其中1-3为实施例13的提取结果，4-6为市售试剂盒提取结果；7-12为葡萄果实，其中7-9为实施例13的提取结果，10-12为市售试剂盒提取结果；13-18为桃子果实，其中13-15为实施例13的提取结果，16-18为市售试剂盒提取结果。
77.从图中可以看出，实施例13所用的本专利方法的dna得率要远远高于市售试剂盒，葡萄果肉的结果对比结果最为明显，表明该方法提取的果实基因组dna质量较高，且适用范围较广。
78.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

技术特征：
1.一种用于果实基因组dna提取的裂解液，其特征在于：所述裂解液包括ctab、sds、np-40、nacl、tris-hcl、巯基乙醇和edta。2.根据权利要求1所述的一种用于果实基因组dna提取的裂解液，其特征在于：所述裂解液中，ctab的质量浓度为0.5-1.5%，sds的质量浓度为0.5-1.5%，np-40的质量浓度为0.5-1.5%，nacl的浓度为1-3mol/l，tris-hcl的浓度为0.05-0.15mol/l，巯基乙醇的含量为0.1-0.3%，edta的浓度为0.05-0.15mol/l。3.根据权利要求1所述的一种用于果实基因组dna提取的裂解液，其特征在于：所述裂解液中，ctab的质量浓度为1-1.5%，sds的质量浓度为1-1.5%，np-40的质量浓度为1-1.5%，nacl的浓度为1-3mol/l，tris-hcl的浓度为0.05-0.15mol/l，巯基乙醇的含量为0.1-0.3%，edta的浓度为0.05-0.15mol/l。4.一种果实基因组dna提取的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括研磨材料、权利要求1-3任一项所述的裂解液、绑定液、漂洗液1、漂洗液2以及洗脱液。5.根据权利要求4所述的一种果实基因组dna提取的试剂盒，其特征在于：所述研磨材料为陶瓷研磨珠、钢珠和玻璃砂的混合材料。6.根据权利要求4所述的一种果实基因组dna提取的试剂盒，其特征在于：所述绑定液包括磁珠溶液、peg8000和nacl，磁珠为硅基磁珠，peg8000的质量浓度为20-40%，nacl的浓度为1-3mol/l。7.根据权利要求4所述的一种果实基因组dna提取的试剂盒，其特征在于：所述漂洗液1包括异硫氰酸胍、盐酸胍、乙醇和tris-hcl；异硫氰酸胍的浓度为1-3mol/l，盐酸胍的浓度为2-4mol/l，乙醇的体积浓度为50-70%，tris-hcl的浓度为0.3-0.8mol/l。8.根据权利要求4所述的一种果实基因组dna提取的试剂盒，其特征在于：所述漂洗液2包括乙醇和tris-hcl；乙醇的体积浓度为60-80%，tris-hcl的浓度为0.05-0.2mol/l。9.根据权利要求4所述的一种果实基因组dna提取的试剂盒，其特征在于：所述洗脱液为5-15mmol/l的tris-hcl缓冲液。10.一种利用权利要求4-9任一项所述的果实基因组dna提取的试剂盒提取果实基因组dna的方法，其特征在于：包括以下步骤：s1，容器a中加入研磨材料和待测果实样本，加入裂解液，研磨1-3min，然后60-70℃水浴15-30min；s2，容器a冷却至室温，加入与裂解液等体积的氯仿，震荡混匀11000-13000rpm离心4-6min；s3，吸取s2中的上清液至容器b中，加入磁珠和绑定液后置于混匀仪上，室温振荡混匀40-90s；s4，将容器b放置在磁力架上，静置，磁珠完全吸附后，弃上清；s5，向完成s4的容器b中加入漂洗液1，将容器b从磁力架上取下，放入混匀仪上，振荡混匀，静置，磁珠完全吸附后，弃上清；s6，向完成s5的容器b中加入漂洗液2，将容器b从磁力架上取下，放入混匀仪上，振荡混匀，静置，磁珠完全吸附后，弃上清；s7，将完成s6的容器b室温下晾干；s8，向晾干的容器b中加入洗脱液，从磁力架上转移到混匀仪上，振荡混匀40-90s；
s9，将完成s8的容器b置于磁力架上静置2-5min，磁珠完全吸附后，将上清溶液转至容器c中，容器c中的上清液即为提取得到的dna产物。

技术总结
本发明涉及基因组DNA提取技术领域，具体涉及一种用于果实基因组DNA提取的裂解液、试剂盒及提取方法，所述裂解液包括CTAB、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、NaCl、Tris-HCl、巯基乙醇和乙二胺四乙酸（EDTA）。该裂解液中CTAB、SDS、NP-40三种裂解成分组合，可以更有效的裂解细胞，提高DNA的得率；本发明中的裂解液在对细胞进行裂解，释放核酸的同时液能对一些杂质进行络合，裂解液中的巯基乙醇抑制果实中的酚类氧化成醌和抑制核酸酶对DNA的降解，进而保护DNA。进而保护DNA。进而保护DNA。


技术研发人员：吴昆林 殷楠楠 蒙艳婷 王建冬
受保护的技术使用者：杭州联川基因诊断技术有限公司
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/13