一种DNA甲基化检测的生物传感器及其制备方法和应用与流程

一种dna甲基化检测的生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种dna甲基化检测的生物传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的一类疾病；随着分子生物学的飞速发展，对于表观遗传学的认知和研究也越来越多，临床上已达到对肿瘤进行基因水平上的诊断及靶向治疗。
3.dna甲基化是指在dna甲基转移酶(dnmt)的催化作用下，以s-腺苷甲硫氨酸(sam)作为甲基供体，将甲基基团结合到胞嘧啶的c-5位，在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cpg)二核苷酸中形成5-甲基胞嘧啶(5-mc)的过程。研究结果表明，dna甲基化与癌症的发生有着密切的关系，在许多癌症中都发现存在dna甲基化异常的现象；因此，dna甲基化的检测对于恶性肿瘤的预测和预后具有重要意义。
4.人体的血浆中存在大量的游离dna(cfdna)，cfdna中通常包含肿瘤细胞坏死或者凋亡后释放的dna；由于检测血浆样本具有容易获取、快速简便且无创伤等优点，通过对血浆cfdna进行甲基化检测以实现恶性肿瘤的早期筛查和诊断具有重要的应用价值。通过电化学方法的dna甲基化检测系统，可以将cfdna甲基化水平的差异转化为电信号，从而可以快速、灵敏地检测dna中的甲基化差异；但是目前的电化学生物传感器检测dna甲基化普遍存在灵敏度低，特异性差的问题。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，可大幅提高生物传感器的灵敏度和特异性。
6.本发明的目的之二在于提供一种dna甲基化检测的生物传感器。
7.本发明的目的之三在于提供一种dna甲基化检测的生物传感器的应用。
8.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
9.一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
10.s1，将金电极进行镜面打磨后，得到预处理的金电极；
11.s2，将所述预处理的金电极进行活化，清洗并干燥，然后电化学沉积纳米金粒子，得到纳米金修饰的金电极；
12.s3，将所述纳米金修饰的金电极进行表面界面改性后，加入核酸适配体，得到适配体-纳米金修饰金电极；
13.s4，向适配体-纳米金修饰金电极中加入5-mc抗体和电信号复合物，得到dna甲基化检测的生物传感器。
14.进一步地，步骤s1中，具体为，采用粒径为0.01-0.1μm的氧化铝粉将金电极打磨成镜面后，对金电极依次用乙醇和水进行超声清洗，干燥，得到预处理的金电极。
15.进一步地，步骤s2中，将预处理的金电极置于活化液中进行活化，所述活化液为质量比为8-12：1的硫酸和过氧化氢组成的溶液，用纯水清洗并吹干，然后置于haucl4溶液中进行电化学沉积，得到纳米金修饰的金电极。
16.进一步地，步骤s3中，具体操作为，在所述纳米金修饰的金电极表面涂覆界面改性液，40-60℃下处理10-20min后清洗并干燥，然后加入核酸适配体并在3-6℃下孵育10-16h，加入bsa封闭液以封闭金电极表面的空白位点，得到适配体-纳米金修饰金电极。
17.进一步地，界面改性液由质量比为4-6：1的疏水性硫醇和亲水性硫醇组成；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)nch3，所述n＝4-8的整数；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)noh，所述n＝5-9的整数。
18.进一步地，所述核酸适配体为末端巯基修饰的dna探针。
19.进一步地，步骤s4中，具体操作为，向适配体-纳米金修饰金电极表面滴加5-mc抗体，35-40℃下孵育1-2h，然后滴加可与5-mc抗体结合的电信号复合物孵育0.5-2h，得到dna甲基化检测的生物传感器。
20.进一步地，所述电信号复合物为标记hrp酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氧酶或青霉素酰化酶的二抗。
21.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
22.一直dna甲基化检测的生物传感器，由所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法制备而成。
23.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
24.一直dna甲基化检测的生物传感器的应用，所述的dna甲基化检测的生物传感器在制备dna甲基化检测产品中的应用。
25.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
26.本发明的一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，在金电极表面沉积纳米金，可促进电子转移，提高电流强度，同时提高电极的比表面积，有助于核酸适配体的固定，并有利于负载大量的电信号复合物；对金电极进行表面疏水改性能提高对甲基化dna的吸附速率，所述核酸适配体可与靶标dna杂交，实现dna的特异性捕获，并通过金电极实现电信号传递；通过5-mc抗体可与捕获的甲基化dna进行特异性结合，进一步筛选靶标dna，提高特异性，电信号复合物与5-mc抗体结合实现电信号的放大，从而提高检测的灵敏度。
27.本发明的一种dna甲基化检测的生物传感器，可提高甲基化dna检测的灵敏度和特异性，提高检测效率。
附图说明
28.图1是本发明的实施例1中dna甲基化检测的生物传感器吸附甲基化nda的sem图。
29.图2是本发明的对照组的dna甲基化检测的生物传感器吸附甲基化nda的sem图。
30.图3是本发明的实施例1中dna甲基化检测的生物传感器吸附甲基化nda的cv曲线图。
具体实施方式
31.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的
前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
32.实施例1
33.一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
34.s1，将金电极进行镜面打磨后，得到预处理的金电极；
35.s2，将所述预处理的金电极进行活化，清洗并干燥，然后电化学沉积纳米金粒子，得到纳米金修饰的金电极；
36.s3，将所述纳米金修饰的金电极进行表面界面改性后，加入核酸适配体，得到适配体-纳米金修饰金电极；
37.s4，向适配体-纳米金修饰金电极中加入5-mc抗体和电信号复合物，得到dna甲基化检测的生物传感器。
38.进一步地，步骤s1中，具体为，采用粒径为0.01-0.1μm的氧化铝粉将金电极打磨成镜面后，对金电极依次用乙醇和水进行超声清洗，干燥，得到预处理的金电极。
39.进一步地，步骤s2中，将预处理的金电极置于活化液中进行活化，所述活化液为质量比为8-12：1的硫酸和过氧化氢组成的溶液，用纯水清洗并氮气吹干，然后置于haucl4溶液中进行电化学沉积，得到纳米金修饰的金电极。金属金的化学性质不活泼，通过活化液对金电极进行刻蚀活化可提高金电极的比表面积，同时使其表面形成游离键，提高金电极与纳米金的结合力。
40.进一步地，步骤s3中，具体操作为，在所述纳米金修饰的金电极表面涂覆界面改性液，40-60℃下处理10-20min后清洗并干燥，然后加入核酸适配体并在3-6℃下孵育10-16h，加入bsa封闭液以封闭金电极表面的空白位点，得到适配体-纳米金修饰金电极。
41.进一步地，界面改性液由质量比为4-6：1的疏水性硫醇和亲水性硫醇组成；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)nch3，所述n＝4-8的整数；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)noh，所述n＝5-9的整数。通过控制疏水性硫醇和亲水性硫醇比例可使金电极具有一定的疏水和亲水基团，能加强甲基化dna和非甲基化dna在金表面的吸附的差异化，从而提高检测的灵敏度。
42.进一步地，所述核酸适配体为末端巯基修饰的dna探针。巯基修饰的dna探针通过巯基与纳米金和金电极通过化学键结合，实现dna探针的固定。
43.进一步地，步骤s4中，具体操作为，向适配体-纳米金修饰金电极表面滴加5-mc抗体，35-40℃下孵育1-2h，然后滴加可与5-mc抗体结合的电信号复合物孵育0.5-2h，得到dna甲基化检测的生物传感器。
44.进一步地，所述电信号复合物为标记hrp酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氧酶或青霉素酰化酶的二抗。其中二抗为可与5-mc抗体特异性结合的抗体，作为优选，本发明的二抗采用兔抗鸡igg抗体。
45.一直dna甲基化检测的生物传感器，由所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法制备而成。
46.一直dna甲基化检测的生物传感器的应用，所述的dna甲基化检测的生物传感器在制备dna甲基化检测产品中的应用。
47.实施例1
48.一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
49.s1，将金电极进行镜面打磨后，得到预处理的金电极；
50.其具体操作为，采用粒径为0.01-0.1μm的氧化铝粉将金电极打磨成镜面后，对金电极依次用乙醇和水进行超声清洗10min，晾干，得到预处理的金电极。
51.s2，将所述预处理的金电极进行活化，清洗并干燥，然后电化学沉积纳米金粒子，得到纳米金修饰的金电极；
52.其具体操作为，采将预处理的金电极置于活化液中进行活化，所述活化液为质量比为8-12：1的硫酸和过氧化氢组成的溶液，用纯水清洗并氮气吹干，然后置于haucl4溶液中，于-0.2v恒电位下电化学沉积纳米金180s，得到纳米金修饰的金电极。
53.s3，将所述纳米金修饰的金电极进行表面界面改性后，加入核酸适配体，得到适配体-纳米金修饰金电极；
54.具体操作为：在所述纳米金修饰的金电极表面涂覆界面改性液，50℃下处理15min后清洗并干燥，然后加入5μmol/l核酸适配体和te缓冲液并在4℃下孵育12h，加入0.05％的bsa封闭液以封闭金电极表面的空白位点，得到适配体-纳米金修饰金电极。
55.其中，界面改性液由质量比为5：1的疏水性硫醇和亲水性硫醇组成；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)5ch3；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)5oh。
56.进一步地，所述核酸适配体为末端巯基修饰的dna捕获探针。巯基修饰的dna探针通过巯基与纳米金和金电极通过化学键结合，实现dna探针的固定。本实施例的dna探针可以根据目的基因采用碱基互补配对原理设计的单链dna(ssdna)探针或双链dna(dsdna)探针。
57.s4，向适配体-纳米金修饰金电极中加入5-mc抗体和电信号复合物，得到dna甲基化检测的生物传感器。
58.具体操作为，向适配体-纳米金修饰金电极表面滴加5mg/l的5-mc抗体，38℃下孵育1h，然后滴加10mg/l的hrp酶标igg抗体孵育1h，10mm的pbs缓冲液冲洗干净，氮气吹干，得到dna甲基化检测的生物传感器。
59.本发明的一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，在金电极表面沉积纳米金，可促进电子转移，提高电流强度，同时提高电极的比表面积，有助于核酸适配体的固定，并有利于负载大量的hrp酶标igg抗体；对金电极进行表面疏水改性能提高对甲基化dna的吸附速率，所述核酸适配体可与靶标dna杂交，实现dna的特异性捕获，并通过金电极实现电信号传递；通过5-mc抗体可与捕获的甲基化dna进行特异性结合，进一步筛选靶标dna，提高特异性，hrp酶标igg抗体与5-mc抗体特异性结合，hrp酶可催化氢醌形成苯醌，从而产生电流，通过检测该电流以进行甲基化dna的检测，从而实现电信号的放大，从而提高电化学分析的检测灵敏度。
60.性能测试
61.1、微观表征
62.取本发明实施例1的dna甲基化检测的生物传感器在表面涂覆甲基化dna，以未经过表面界面改性处理的电极片作为对照组，分别进行扫描电子显微镜检测，结果如图1-2所示。
63.参照图1-2，本发明的dna甲基化检测的生物传感器经过表面界面改性处理后，对甲基化dna的吸附性能明显增强，有利于提高甲基化的灵敏度。
64.2、电化学性能
65.用三电极体系检测实施例1的dna甲基化检测的生物传感器的电化学性能，所述生物传感器作为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂电极为对电极；得到的cv曲线如图3所示。参照图3，本发明的生物传感器在0.1～0.26v处具有一对明显的氧化还原峰，且两峰之间的电势差越为0.1v，说明本发明的生物传感器阻抗较低，电化学性能佳。
66.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

技术特征：
1.一种dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，将金电极进行镜面打磨后，得到预处理的金电极；s2，将所述预处理的金电极进行活化，清洗并干燥，然后电化学沉积纳米金粒子，得到纳米金修饰的金电极；s3，将所述纳米金修饰的金电极进行表面界面改性后，加入核酸适配体，得到适配体-纳米金修饰金电极；s4，向适配体-纳米金修饰金电极中加入5-mc抗体和电信号复合物，得到dna甲基化检测的生物传感器。2.如权利要求1所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤s1中，具体为，采用粒径为0.01-0.1μm的氧化铝粉将金电极打磨成镜面后，对金电极依次用乙醇和水进行超声清洗，干燥，得到预处理的金电极。3.如权利要求1所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤s2中，将预处理的金电极置于活化液中进行活化，所述活化液为质量比为8-12：1的硫酸和过氧化氢组成的溶液，用纯水清洗并吹干，然后置于haucl4溶液中进行电化学沉积，得到纳米金修饰的金电极。4.如权利要求1所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤s3中，具体操作为，在所述纳米金修饰的金电极表面涂覆界面改性液，40-60℃下处理10-20min后清洗并干燥，然后加入核酸适配体并在3-6℃下孵育10-16h，加入bsa封闭液以封闭金电极表面的空白位点，得到适配体-纳米金修饰金电极。5.如权利要求4所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：界面改性液由质量比为4-6：1的疏水性硫醇和亲水性硫醇组成；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)
n
ch3，所述n＝4-8的整数；所述疏水性硫醇的结构式为hs(ch2)
n
oh，所述n＝5-9的整数。6.如权利要求4所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述核酸适配体为末端巯基修饰的dna探针。7.如权利要求1所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤s4中，具体操作为，向适配体-纳米金修饰金电极表面滴加5-mc抗体，35-40℃下孵育1-2h，然后滴加可与5-mc抗体结合的电信号复合物孵育0.5-2h，得到dna甲基化检测的生物传感器。8.如权利要求1或7所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述电信号复合物为标记hrp酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氧酶或青霉素酰化酶的二抗。9.一直dna甲基化检测的生物传感器，其特征在于：由权利要求1-8任一项所述的dna甲基化检测的生物传感器的制备方法制备而成。10.一直dna甲基化检测的生物传感器的应用，其特征在于：权利要求9所述的dna甲基化检测的生物传感器在制备dna甲基化检测产品中的应用。

技术总结
一种DNA甲基化检测的生物传感器及其制备方法和应用，属于生物检测技术领域；包括以下步骤：S1，将金电极进行镜面打磨后，得到预处理的金电极；S2，将所述预处理的金电极进行活化，清洗并干燥，然后电化学沉积纳米金粒子，得到纳米金修饰的金电极；S3，将所述纳米金修饰的金电极进行表面界面改性后，加入核酸适配体，得到适配体-纳米金修饰金电极；S4，向适配体-纳米金修饰金电极中加入5-mC抗体和电信号复合物，得到DNA甲基化检测的生物传感器。本发明在金电极表面沉积纳米金，可促进电子转移，同时提高电极的比表面积；对金电极进行表面疏水改性能提高对甲基化DNA的吸附速率，从而提高检测的灵敏度。检测的灵敏度。检测的灵敏度。


技术研发人员：钟玙沄 陈斌
受保护的技术使用者：广州尔立简生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/8/5