基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针及制备与应用

1.本发明涉及稀土荧光材料领域，生物酶的分析检测领域，具体地说，涉及基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针的制备方法以及利用该探针对溶液中碱性磷酸酶活性的荧光检测方法。


背景技术：

2.碱性磷酸酶(alp)是一种广泛存在于生物组织和细胞中的水解酶，在碱性环境中具有优秀的催化能力，可以对蛋白质、磷酸和小分子等底物中的磷酸单酯进行去磷酸化作用。作为一种重要的生物标志物，其在人体中的正常水平为45-125u/l，许多疾病和癌症的发生都会导致其含量异常，例如骨质疏松、胆道阻塞、肝硬化、糖尿病以及骨癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌等等。因此，建立一种超灵敏检测碱性磷酸酶活性的方法对于临床疾病诊断和生物医学研究具有重要意义。
3.迄今为止，报道的已开发用来检测alp活性的方法有比色法、表面增强拉曼散射法、电化学分析法、荧光分析法等。其中，由于荧光分析法前处理简单、操作便捷、灵敏度高、选择性好、可实时监控，是一种更合适的alp监测方法。由于alp本身不具有荧光，所以需要在分析系统中引入合适的荧光物质作为探针。由稀土元素离子和有机配体自组装构建的稀土配位聚合物(ln cps)因多样可控的结构和良好的生物相容性而备受欢迎。稀土离子的f-f电子跃迁导致其具有独特的光学性能，例如大的stokes位移、窄的辐射带和长的荧光寿命，这些显著超越传统荧光材料的优势使ln cps已广泛应用于各种金属离子、阴离子和生物分子的检测。环丙沙星(cip)是人工合成的第三代氟喹诺酮类抗菌素，本身具有强而稳定的荧光。只有溶剂的极性和酸碱性会影响体系的平面刚性结构，进而影响荧光强度，在固定溶剂环境下，其荧光保持稳定可作为参比荧光。此外，纳米二氧化硅(sio2)具有可调的比表面积、孔容积与孔径大小，并且其化学组成仅包括si、o两种元素，具有优异的生物相容性。在合成缩聚的过程中封装亲水性的荧光材料极大地促进了荧光纳米材料的发展。
4.有鉴于此，有必要提供一种监测碱性磷酸酶活性的机理明确、结果可靠的比率型荧光探针，以解决碱性磷酸酶检测操作复杂、无法在生物系统中进行、设备昂贵的技术难题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，解决环丙沙星无法有效地负载于稀土配位聚合物材料上，形成比率型荧光探针的难题。本发明制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针将环丙沙星封装于二氧化硅粒子中，稀土铈配位聚合物在其表面上形成，构建为比率型荧光探针。利用基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针实现对低浓度碱性磷酸酶的检测，检测过程便捷，结果准确。
6.本发明的第一个方面提供了基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针的制备方法，包括下述步骤：
7.将环丙沙星(cip)分散于无水乙醇、去离子水和浓氨水的混合溶液中，环丙沙星、无水乙醇、去离子水、浓氨水的质量比为(1～1.5):(500～510):(150～160):(5～6)，超声30～40min后逐滴加入正硅酸乙酯，浓氨水和正硅酸乙酯的质量比为(5～6):(1～2)，室温下搅拌过夜，得到白色沉淀(cip@sio2)。然后将cip@sio2溶液和三磷酸腺苷(atp)溶液分散于tris-hcl溶液中，cip@sio2溶液、三磷酸腺苷溶液、tris-hcl溶液的质量比为(2～3):(4.3～5.6):(4～5)，搅拌5～10min后逐滴加入硝酸铈(ce(no3)3·
6h2o)溶液，三磷酸腺苷溶液和硝酸铈溶液的质量比为(1～1.5):(4～5)，搅拌40～60min，得到所述基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针溶液cip@sio
2-ce/atp-tris。
8.所述cip@sio2溶液的浓度为500～750mg ml-1
，优选为600mg ml-1
。
9.所述三磷酸腺苷(atp)溶液的浓度为80～120mm，优选为100mm。
10.所述tris-hcl溶液的浓度为40～60mm，优选为50mm。
11.所述硝酸铈(ce(no3)3·
6h2o)溶液的浓度为160～240mm，优选为200mm。
12.所述羟基环丙沙星(cip)、无水乙醇、去离子水、浓氨水的质量比为1.3:505.2:160:5.5。
13.所述浓氨水和正硅酸乙酯的质量比为5.5:1.5。
14.所述cip@sio2溶液、三磷酸腺苷(atp)溶液、tris-hcl溶液的质量比为2.3:4.5:4.1。
15.所述三磷酸腺苷(atp)溶液和硝酸铈(ce(no3)3·
6h2o)溶液的质量比为1.3:4.5。
16.本发明的第二个方面提供了一种所述制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针溶液在碱性磷酸酶检测中的应用，包括以下步骤：
17.将所述制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针溶液中加入alp溶液，然后滴加tris-hcl缓冲液，所述比率型荧光探针溶液(浓度是0.01～0.02g ml-1
，优选为0.012g ml-1
)、alp溶液、tris-hcl缓冲液的体积比为(0.8～1.2):(2～3):(70～80)，37℃孵育60min后检测alp浓度。
18.所述alp溶液的浓度为1～20u/l。
19.所述tris-hcl缓冲液的浓度为40～60mm，优选为50mm，ph为7～8。
20.由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
21.本发明制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针对碱性磷酸酶的检测具有稀土荧光探针stokes位移大、辐射带窄和荧光寿命长的光物理性能，环丙沙星强且稳定的发光性能以及纳米二氧化硅可调孔径结构和优异生物相容性的优势。
22.本发明制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针建立对碱性磷酸酶的检测方法，相对于比色法和电化学法等方法，具有检测限低、前处理简单、机理明确和检测成本低等优势。
附图说明
23.图1为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的透射电镜图(200nm)。
24.图2为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的扫描电镜图(200nm)。
25.图3为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的傅里叶变换红外光谱图。
26.图4为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的紫外-可见光谱图。
27.图5为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的x射线能谱图。
28.图6为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的高分辨率x射线光电子能谱图。
29.图7为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的测量x射线光电子能谱图。
30.图8为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的荧光光谱图。
31.图9为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液不同ph条件下荧光强度的折线图。
32.图10为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液在不同孵育时间下荧光强度的折线图。
33.图11为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的长期稳定性荧光强度的折线图。
34.图12为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液对alp选择性对比图。
35.图13为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的碱性磷酸酶滴定荧光光谱图。
36.图14为本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的碱性磷酸酶滴定标准曲线图。
具体实施方式
37.以下提供本发明基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针及制备与应用的具体实施方式：
38.实施例1
39.环丙沙星(cip)、硝酸铈(ce(no3)3·
6h2o，99.99％)、甘氨酸(gly)、亮氨酸(leu)、bsa、乳糖(lac)购自上海麦克林生化科技有限公司。浓氨水(nh3·
h2o)、金属盐(cucl2)、三磷酸腺苷(atp)、三羟甲基氨基甲烷(tris)购自上海凌峰化学试剂有限公司。组氨酸(his)、酪氨酸(tyr)、苯丙氨酸(phe)、精氨酸(arg)、丙氨酸(ala)购自阿拉丁化学试剂有限公司。正硅酸乙酯(teos)、乳清酸(vit b13)、胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)购自国药化学试剂有限公司。碱性磷酸酶(alp)购自默克化工技术(上海)有限公司。通过milli-q装置(millipore，bedford，ma，usa)制备去离子水。
40.第一步，称取331.34mg环丙沙星溶于201.5ml的混合溶液(无水乙醇：去离子水：浓氨水＝160ml：40ml:1.5ml)中，室温下超声30min，得到透明状液体。然后逐滴加入0.4ml正硅酸乙酯，室温下机械搅拌过夜。反应结束后通过离心收集产物(cip@sio2)，依次用无水乙
1s
的高分辨率光谱显示了两个主要的峰在284.7ev(c-oh/c-o-c)和286.5ev(c＝n)。n 1s
的高分辨率光谱显示了c-n/c＝n和n-h的存在。p
2p
的高分辨率光谱显示了po4的存在。
45.如图8所示，图8是本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的荧光光谱图。图中a是ce
3+
的荧光光谱图，b是cip的荧光光谱图，c是ce/atp-tris的荧光光谱图，d是加入alp后ce/atp-tris的荧光光谱图，e是cip@sio
2-ce/atp-tris的荧光光谱图，f是加入alp后cip@sio
2-ce/atp-tris的荧光光谱图。ce
3+
离子的荧光强度非常弱，几乎没有发光，与配体形成配位聚合物后在363nm处有一个强烈的发射峰。cip在435nm处有一个强且稳定的发射峰。alp加入后，铈配位聚合物的荧光强度减弱，环丙沙星的荧光强度不变。
46.第三步，将40μl第二步制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液置于7组5ml离心管中(每个离心管中放入40μl基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris))，每一个离心管中加入100μl浓度为20u/l的alp溶液(alp溶于去离子水中形成浓度为1000u/l的溶液，然后稀释到所需浓度)，然后1-7组分别滴加ph为7.10、7.40、7.70、8.00、8.30、8.60、9.00的tris-hcl缓冲溶液至3ml，37℃孵育60min后，利用荧光光谱仪测定其在363nm和435nm处的荧光强度。
47.第四步，将40μl第二步制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液置于5ml离心管中，离心管中加入100μl浓度为20u/l的alp溶液，滴加tris-hcl缓冲溶液(50mm,ph＝7.1)至3ml，37℃孵育，在0、10、20、30、45、60、80、110、120min时，利用荧光光谱仪测定其在363nm和435nm处的荧光强度。
48.图9是本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液在不同ph条件下荧光强度的折线图。图10是本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液在不同孵育时间下荧光强度的折线图。图中，a是铈配位聚合物在不同孵育时间下荧光强度的折线图；b是363nm和435nm处荧光强度比值在不同孵育时间下的折线图。图11是本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的长期稳定性荧光强度的折线图。图12是本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液对alp选择性对比图。图1～12说明制备稀土荧光探针的结构组成以及对碱性磷酸酶的检测作用。
49.应用例1
50.实施例1制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液对不同浓度碱性磷酸酶的荧光滴定：
51.量取40μl实施例1第二步制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液于13组5ml离心管中(一个离心管中放入40μl基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris))，分别加入100μl不同浓度的alp溶液，alp浓度依次为0、0.4、0.8、1、1.5、2、4、6、8、10、12、15、20u/l，然后分别滴加浓度为50mm、ph＝7.1的tris-hcl缓冲溶液至3ml，37℃孵育60min后，利用荧光光谱仪测定其在363nm和435nm处的荧光强度。
52.结果如图13和图14所示，图13是本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的碱性磷酸酶滴定荧光光谱图，荧光光谱仪的
参数如下：激发波长295nm，发射波长300～550nm。图14是本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液的碱性磷酸酶滴定标准曲线图，图14中荧光强度比值(i
435
/i
363
)和碱性磷酸酶浓度的标准曲线图，其线性关系为y＝0.0694x+1.458，其相关系数r2为0.9983。图13和图14说明了利用稀土荧光探针可以进一步说明对碱性磷酸酶溶液的检测作用。
53.应用例2
54.实施例1制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液对胎牛血清中碱性磷酸酶的加标回收荧光滴定：
55.以胎牛血清为真实样本，按照不同浓度加入alp标准溶液，用tris-hcl缓冲溶液稀释100倍。量取40μl实施例1第二步制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液于7组5ml离心管中(一个离心管中放入40μl基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris))，分别加入100μl实际样品(加入alp的浓度分别为0,2,4,6,8,10,16u/l)，然后分别滴加浓度为50mm、ph＝7.1的tris-hcl缓冲溶液至3ml，37℃孵育60min后，利用荧光光谱仪测定其在363nm和435nm处的荧光强度。
56.结果见表1，分析结果表明，alp的回收率为96.75～104.2％，说明稀土荧光探针对生物样品中alp的检测具有一定的实用性和可靠性。
57.表1本发明实施例制备的基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针(cip@sio
2-ce/atp-tris)溶液对胎牛血清中碱性磷酸酶的加标回收结果
[0058][0059]
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

技术特征：
1.一种基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针，其特征在于，所述参比荧光物质环丙沙星具有强且稳定的荧光，荧光强度仅与系统极性和ph值有关，所述纳米二氧化硅具有优异的生物相容性，所述比率型荧光探针由包括以下步骤制得：(1)将环丙沙星(cip)分散于无水乙醇、去离子水和浓氨水的混合溶液中，超声后逐滴加入正硅酸乙酯，室温下搅拌过夜，得到白色沉淀(cip@sio2)。(2)然后将cip@sio2溶液和三磷酸腺苷(atp)溶液分散于tris-hcl溶液中，搅拌5～10min后逐滴加入硝酸铈(ce(no3)3·
6h2o)溶液，继续搅拌40～60min获得上述基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述cip@sio2溶液的浓度为500～750mgml-1
，所述三磷酸腺苷(atp)溶液的浓度为80～120mm，所述tris-hcl溶液的浓度为40～60mm，所述硝酸铈(ce(no3)3·
6h2o)溶液的浓度为160～240mm。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述环丙沙星(cip)、无水乙醇、去离子水、浓氨水的质量比为(1～1.5):(500～510):(150～160):(5～6)，所述浓氨水和正硅酸乙酯的质量比为(5～6):(1～2)，所述超声分散时间30～40min。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述cip@sio2溶液、三磷酸腺苷(atp)溶液、tris-hcl溶液的质量比为(2～3):(4.3～5.6):(4～5)，所述三磷酸腺苷(atp)溶液和硝酸铈(ce(no3)3·
6h2o)溶液的质量比为(1～1.5):(4～5)。5.如权利要求1～4任一项所述的应用，一种基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针的应用方法，其特征在于，其中所述碱性磷酸酶检测应用包括以下步骤：在所述基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针溶液中加入碱性磷酸酶(alp)溶液，然后滴加tris-hcl缓冲溶液，所述比率型荧光探针溶液、alp溶液、tris-hcl缓冲溶液的体积比为(0.8～1.2):(2～3):(70～80)，36～38℃孵育55～65min后检测alp浓度。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，其中所述alp溶液的浓度为1～20u/l，所述tris-hcl缓冲溶液的浓度为40～60mm，ph为7～8。

技术总结
本发明公开了基于稀土铈配位聚合物的比率型荧光探针的制备及应用。一方面，通过物理掺杂将亲水性荧光物质环丙沙星(CIP)封装在纳米二氧化硅中，得到白色沉淀(CIP@SiO2)，然后将CIP@SiO2溶液和三磷酸腺苷(ATP)溶液分散于Tris-HCl溶液中，搅拌后滴入硝酸铈(Ce(NO3)3·


技术研发人员：张磊 孙梦谣 孙冰楠 于浩然 于博昊 张维冰
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/8/14