一种利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法及其应用

1.本发明属于微生物处理技术领域，具体涉及一种利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法及其应用。


背景技术：

2.虾青素是一种红橙色的酮类胡萝卜素，是迄今为止世界上发现的最强大的天然抗氧化剂。雨生红球藻(haematococcus pluvialis)是天然虾青素的主要微藻来源之一。雨生红球藻的养殖已经发展了成熟的生物技术，并在世界各地建立了大规模的生产设施。商业上从雨生红球藻中规模化提取虾青素的细胞破坏步骤涉及到机械过程，例如压榨和球磨，提取步骤通常通过乙醇提取或超临界co2提取方式进行，最终产品以软凝胶、胶囊、奶油、能量饮料、油、提取物、片剂糖等形式存在。然而，这种成熟的生产系统提供的虾青素仍然很昂贵，这主要是因为培养和精制过程复杂，而细胞壁破裂是精制步骤中的主要障碍。
3.科学界对于雨生红球藻的生命周期和非运动阶段不动孢子形成的刚性三层细胞壁已有足够的认识。成熟的囊肿细胞发育形成三个不同的壁层，分别由外三层鞘(tls)、次级壁和间隙组成。不同的层主要由藻胶生物聚合物和类纤维素多糖、甘露糖和纤维素的无定形结构以及甘露糖与纤维素的无定形排列组成。这种三层厚壁的物理化学结构对一般物理、化学和酶处理表现出高度抗性。
4.传统广泛使用的方法包括机械破碎、超声破碎、高压均质化和微波辅助提取等，能够破坏所有类型的微生物细胞，但不够经济和有效。研究人员遵循了两个基本思路来解决这一问题：第一个是开发新的设备和提取溶剂进行破壁提取，例如超临界(亚临界)流体提取、加速溶剂、纳米乳液和离子液体提取，这些技术依赖型的方法对于大规模应用来说仍然很昂贵；第二种是受到自然式的启发，例如萌发破壁、多酶降解、干扰厚细胞壁的形成通路等方法，这些方法节能、具有潜在的经济和环保特性，值得进一步努力改进以满足绿色工业需求。在后一种自然启发式策略中，多酶联合处理方法已被证实对雨生红球藻细胞壁降解有效。然而，因为反应速度慢、酶的大规模生产成本以及稳定性和重复使用问题，多种酶调配裂解细胞工艺的规模化实施仍然具有挑战性。


技术实现要素：

5.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法及其应用。在该方法中雨生红球藻中的目标虾青素(ast)和虾青素酯(ast-e)没有或几乎没有受到影响。同时，雨生红球藻细胞壁中碳水化合物和蛋白质可以转化为生物发酵产品，而不是作为提取完色素的废弃物或用作动物饲料或经再发酵产生生物乙醇。
6.本发明提供一种利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，包括以下步骤；
7.将麸曲添加至高温灭菌预处理的雨生红球藻(haematococcus pluvialis)或未经预处理的的雨生红球藻(haematococcus pluvialis)进行密封发酵处理，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。
8.可选的，当雨生红球藻未进行高温灭菌时，包括如下步骤：
9.1)将麸曲接种至碳源水溶液中进行预活化；
10.2)向步骤1)中预活化的麸曲溶液中添加未经预处理的雨生红球藻(haematococcus pluvialis)进行有氧共存培养；
11.3)步骤2)中有氧共存培养后进行密封发酵，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。
12.可选的，所述高温灭菌是指雨生红球藻经过80℃-160℃条件下进行灭菌＞0，≤120min；
13.可选的，所述高温灭菌是指雨生红球藻经过120℃条件下进行灭菌。
14.本发明发酵结束后获得的破壁雨生红球藻发酵液包括破壁的雨生红球藻和发酵液。
15.可选的，所述雨生红球藻可选择新鲜的成熟雨生红球藻(经板框压榨脱水)或经冷冻干燥得到的雨生球藻粉。
16.优选的，步骤1)中所述麸曲为安琪白酒曲、古田红曲米、米曲霉粉、毛霉曲粉、醋酸菌粉或黑曲霉中的至少一种；
17.和/或，所述麸曲的接种量为水的总质量的1-5wt％；
18.和/或，碳源水溶液中碳源的质量浓度为1-5wt％。
19.可选的，优选的，步骤1)中所述麸曲为安琪白酒曲；
20.可选的，所述麸曲的接种量为水的总质量的2wt％；
21.可选的，所述碳源水溶液中碳源的质量浓度为2wt％。
22.可选的，本发明对碳源的种类不做具体的限定，用于提供初始的菌群生长所需的营养物质即可，非典型限定的使用葡萄糖做碳源。
23.优选的，步骤1)中所述预活化温度为32-36℃，预活化时间为0.5-1.5h。
24.优选的，步骤1)中所述预活化温度为35℃，预活化时间为1h。
25.优选的，步骤2)中所述雨生红球藻的添加质量与所述麸曲的接种质量比为(2-4):2；
26.优选的，步骤2)中所述雨生红球藻的添加质量与所述麸曲的接种质量比为3:2。
27.优选的，步骤2)中所述有氧共存培养温度为25-30℃，有氧共存培养时间为1-3h。
28.优选的，步骤2)中所述有氧共存培养温度为25-30℃，有氧共存培养时间为1.5h。
29.优选的，步骤3)中所述密封发酵温度为25-30℃，密封发酵时间为≥5d。
30.优选的，步骤3)中所述密封发酵温度为28℃，密封发酵时间为5-10d。
31.和/或，所述密封发酵包括顶部空间氧气耗尽阶段和厌氧发酵阶段。
32.本发明提供一种类胡萝卜素的提取方法，采用上述所述的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法对雨生红球藻进行预处理。
33.优选的，对雨生红球藻预处理后还包括离心分离雨生红球藻、再乙醇或丙酮浸提的步骤，提取得到类胡萝卜素；
34.可选的，在乙醇或丙酮浸提步骤中，采用超声浸提。
35.超声可加快对于类胡萝卜素的溶出速度。
36.优选的，所述类胡萝卜素为虾青素和/或虾青素酯。
37.本发明还提供一种营养饮品，其原料包括上述所述的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法获得的破壁雨生红球藻发酵液或发酵上清液。
38.本发明技术方案，具有如下优点：
39.(1)本发明提供的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，包括：将麸曲添加至高温灭菌预处理的雨生红球藻(haematococcus pluvialis)或未经预处理的雨生红球藻(haematococcus pluvialis)中进行密封发酵处理，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液；本发明使用麸曲发酵对雨生红球藻进行破壁，最终可以有效破除雨生红球藻的细胞壁，同时几乎不影响虾青素等类胡萝卜素成分。
40.(2)本发明提供的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，当雨生红球藻未进行高温灭菌时，包括如下步骤：包括以下步骤；1)将麸曲接种至碳源水溶液中进行预活化；2)向步骤1)中预活化的麸曲溶液中添加雨生红球藻(haematococcus pluvialis)进行有氧共存培养；3)步骤2)中有氧共存培养后进行密封发酵，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。本发明使用麸曲发酵对雨生红球藻进行破壁，包括麸曲添加碳源预活化，碳源的添加为微生物群落的发育提供初始营养，满足了营养需求，麸曲群落得到增殖，分泌各种细胞壁降解酶，提供了连续水解的实现基础；同时麸曲为常见食品水解菌源，得到的发酵液发酵气味芳香、浓郁，可以用于开发营养饮品进行利用。预活化后加入雨生红球藻进行共存培养为有氧环境，使得微生物群落组成适应环境变化，对雨生红球藻的破壁具有帮助作用。本发明利用麸曲中微生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法可以有效破除雨生红球藻的细胞壁，同时几乎不影响虾青素等类胡萝卜素成分，得到的发酵液具有浓郁的芳香气味，可用于营养饮品开发。
附图说明
41.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
42.图1本发明实施例1的操作方法及结果，其中a为操作方法，b为以对比例1为参照的类胡萝卜素相对回收率，c为气味评价结果；图中s8代表实施例1，c1代表对比例1，r1、r2、r3分别代表三位评审员；
43.图2本发明实施例5的类胡萝卜素回收结果(以对比例1为参照)；图中s8代表实施例5，c1代表对比例1；
44.图3本发明对比例2的操作方法及结果，其中a为操作方法，b为以对比例1为参照的类胡萝卜素相对回收率，c为气味评价结果；图中c1代表对比例1，r1、r2、r3分别代表三位评审员；
45.图4本发明对比例3的操作方法及结果，其中a为操作方法，b为以对比例1为参照的类胡萝卜素相对回收率，c为气味评价结果；图中c1代表对比例1，r1、r2、r3分别代表三位评审员；
46.图5表示雨生红球藻细胞的表面形态；图中a1和a2是原始雨生红球藻粉的细胞表面形态的2个视野；b1和b2表示雨生红球藻粉在120℃下灭菌15min的细胞表面形态的2个视
野；c1和c2表示雨生红球藻粉在120℃下灭菌15min后静置7天后的细胞表面形态的2个视野；d1和d2是表示实施例5处理后的细胞表面形态的2个视野；e1、e2、e3表示实施例5处理后的细胞经乙醇提取(提取按照实施例4操作)后的细胞形态的3个视野；
47.图6本发明实施例1与对比例1相比ast和ast-e的变化倍数，其中“*”和“**”分别表示p《0.01和p《0.05；图中c1表示对比例1，fer表示实施例1，t60和t120为两个对照样品，即60℃和120℃灭菌后雨生红球藻冻干样品经研磨处理(按照对比例1实施)的虾青素及其酯相对丰度变化倍数(以对比例1为参照)；
48.图7本发明实施例1及预活化的安琪白酒曲溶液的差异挥发性组分鉴定和相对丰度；图中jiuqu_1、jiuqu_2和jiuqu_3分别表示预活化的安琪白酒曲溶液平行样品；f_l_1、f_l_2、f_l_3、f_l_4、f_l_5为实施例1的发酵上清液的平行样品。
49.图8是本发明实施例4中乙醇提取虾青素和/或虾青素酯的结果；图中的1、2、3、4、5、6、7、8分别表示第1次、第2次、第3次、第4次、第5次、第6次、第7次、第8次的提取结果；
50.图9是本发明实验例4中对雨生红球藻进行破壁的菌种或曲的筛选结果。
具体实施方式
51.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其它现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
52.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
53.下述实施例中的安琪白酒曲购自安琪酵母股份有限公司(中国湖北省宜昌市)；
54.雨生红球藻购自中科雨虹生物技术有限公司：新鲜雨生红球藻藻泥经干冰冷冻运输，随后分装进行冷冻干燥，获得冻干粉。冻干粉过40目和100目筛网，穿过40目网而被100目网保留的冻干粉保存备用。
55.实施例1
56.本实施例提供一种利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，如图1中的a所示，包括以下步骤；
57.1)将1g安琪白酒曲接种到50ml的葡萄糖水溶液(2wt％)中进行预活化，预活化温度35℃，预活化时间1h，对应图1中a的第i阶段；
58.2)将步骤1)中预活化的安琪白酒曲溶液均匀分装10ml到干净玻璃瓶中，向其中添加300mg雨生红球藻粉进行有氧共存培养，有氧共存培养温度25℃，有氧共存培养时间1.5h，对应图1中a的第ii阶段；
59.3)步骤2)中有氧共存培养后进行密封发酵，发酵温度为28℃，发酵时间为120h，密封发酵过程中包括顶部空间氧气耗尽阶段(对应图1中a的第iii阶段)和厌氧发酵阶段(对应图1中a的第iv阶段)，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。
60.实施例2
61.本实施例提供一种利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，包括以下步骤；
62.1)将0.5g安琪白酒曲接种到50ml的葡萄糖水溶液(1wt％)中进行预活化，预活化温度32℃，预活化时间1.5h；
63.2)向步骤1)中预活化的安琪白酒曲溶液均匀分装成10ml于干净玻璃瓶，向其中添加200mg雨生红球藻进行有氧共存培养，有氧共存培养温度25℃，有氧共存培养时间3h；
64.3)步骤2)中有氧共存培养后进行密封发酵，发酵温度为25℃，发酵时间为10d，密封发酵过程中包括顶部空间氧气耗尽阶段和厌氧发酵阶段，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。
65.实施例3
66.本实施例提供一种利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，包括以下步骤；
67.1)将2.5g安琪白酒曲接种到50ml的葡萄糖水溶液(5wt％)进行预活化，预活化温度36℃，预活化时间0.5h；
68.2)向步骤1)中预活化的安琪白酒曲溶液均匀分装成10ml于干净玻璃瓶，向其中添加500mg雨生红球藻进行有氧共存培养，有氧共存培养温度30℃，有氧共存培养时间1h；
69.3)步骤2)中有氧共存培养后进行密封发酵，发酵温度为30℃，发酵时间为6d，密封发酵过程中包括顶部空间氧气耗尽阶段和厌氧发酵阶段，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。
70.实施例4
71.本实施例提供了一种虾青素和/或虾青素酯的提取方法，包括：取实施例1中的破壁雨生红球藻发酵液经过离心分离，获得底部雨生红球藻沉淀，然后加入乙醇(用量9ml)浸提时间10min，同时浸提过程中采用超声辅助，经离心获得上清液，残渣再次加入乙醇9ml，重复7次可达到完全提取，结果如图8所示，由图中可以看到，随着提取次数的增加，残渣的颜色由红色逐渐褪色，红色为虾青素和/或虾青素酯，到第8次基本完全褪掉，表明虾青素和/或虾青素酯已经被完全提取出来，进一步说明实施例1中的方法能够对雨生红球藻进行破壁。
72.实施例5
73.本实施例提供一种对雨生红球藻进行破壁的方法，包括以下步骤：
74.采用高温杀菌(120℃，15min)，将300mg雨生红球藻和10ml水混合后杀菌，冷却后接种安琪白酒曲30mg，接种后开始密封发酵，发酵温度28℃，发酵时间120h，密封发酵过程中包括顶部空间氧气耗尽阶段和厌氧发酵阶段，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。进行电镜观察，结果如图5中d1和d2所示。
75.将获得的破壁雨生红球藻发酵液进行乙醇提取，按照实施例4的方法提取，然后进行电镜观察，结果如图5中e1、e2和e3所示。
76.同时设置对照，如图5中，a1和a2是原始雨生红球藻粉的细胞表面形态的2个视野；b1和b2表示雨生红球藻粉在120℃下灭菌15min的细胞表面形态的2个视野；c1和c2表示雨生红球藻粉在120℃下灭菌15min后静置7天后的细胞表面形态的2个视野。
77.上述结果表明，本发明的方法能够对雨生红球藻进行细胞破壁。
78.对比例1
79.本对比例提供一种对雨生红球藻进行研磨完全破壁的方法，包括以下步骤：
80.将300mg雨生红球藻使用20ml匀浆器研磨，加丙酮溶剂2-5ml，以100rpm转速保持
研磨棒与研磨套相对运动1h。研磨破碎的藻粉用丙酮定容至100ml，可作为完全提取实验对照。
81.对比例2
82.本对比例提供一种对雨生红球藻进行破壁的方法，包括如下步骤：
83.采用巴氏杀菌(60℃，30min)，将300mg雨生红球藻和10ml水混合后杀菌，冷却后接种安琪白酒曲30mg、60mg、90mg、120mg、150mg，接种后开始密封发酵，发酵温度28℃，发酵时间120h，密封发酵过程中包括顶部空间氧气耗尽阶段(对应图3中a的第iii阶段)和厌氧发酵阶段(对应图3中a的第iv阶段)，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。
84.对比例3
85.本对比例提供对雨生红球藻进行破壁方法，包括以下步骤：
86.采用巴氏杀菌(60℃，30min)，将300mg雨生红球藻和10ml(含1％葡萄糖)水混合后杀菌，冷却后接种安琪白酒曲30mg、60mg、90mg、12mg、150mg，接种后，进行有氧共存培养，温度25℃，有氧共存培养时间2h，对应图4中a的第ii阶段；有氧共存培养后开始密封发酵，发酵温度28℃，发酵时间120h，密封发酵过程中包括顶部空间氧气耗尽阶段(对应图4中a的第iii阶段)和厌氧发酵阶段(对应图4中a的第iv阶段)，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。
87.实验例1
88.将对比例1经研磨后直接使用丙酮溶液定容至100ml，取上清液备用。实施例1、实施例5、对比例2、3的发酵液经冷冻干燥得到干燥粉，直接使用100ml丙酮在100rpm搅拌下避光提取2h提取。对比例1为公认的完全破壁方法，将对比例1的上清液的液相分析得到的液相色谱图在14-28min区间内的积分总面积作为对照，将实施例1、实施例5、对比例2、3处理发酵液的上清液液相色谱图在14-28min区间内的积分总面积与对比例1比得到百分数值，平行实验取平均值，对比分析实施例1、实施例5、对比例2、3类胡萝卜素相对回收含量，结果如图1中的b、图2、图3中的b、图4中的b所示。以上结果说明，本发明实施例1类胡萝卜素相对回收含量显著高于对比例2、3的相对回收含量。
89.实施例1、实施例5、对比例2、3处理得到的产物中的上清液进行hplc色谱分析的方法如下：
90.取1ml上清液过0.22μm滤膜，进行液相色谱分析，hplc色谱分析条件：waters e2695配备2998pda检测器，使用色谱柱ymc c30 4.6
×
250mm；流动相体系与洗脱程序(a：水；b：甲醇；d：甲基叔丁基醚)：0min，4％a，81％b，15％d；15min，4％a，66％b，30％d；23-27min，4％a，16％b，80％d；29-35min，4％a，81％b，15％d。进样量20μl，检测波长480nm，柱温35℃，流速1ml/min。
91.实验例2
92.基于uhplc-ms的非靶向代谢组学分析雨生红球藻经过实施例1和对比例1(即原始雨生红球藻粉末)处理提取出的虾青素及其酯之间的化学差异。另外设置两个对照样品t60和t120分别代表常规热处理60℃和120℃对红球藻样品成分的改变。
93.如图6所示，不同处理方式得到的虾青素及其酯相之间的化学差异的全局视图，对比例1研磨处理的初始藻粉提取物记为c1，经实施例1处理的提取物记为fer，为和巴氏杀菌和高温灭菌处理后藻粉状态进行相互对比，还进行了巴氏杀菌(60℃，30min)和高温灭菌处
理(120℃，15min)处理的雨生红球藻经过研磨得到的提取物进行对比，分别记为t60、t120。与对比例1(c1)相比，虾青素及其酯相关分子的丰度变化倍数，在fer/c1组里变化倍数均小于2，表明大多数成分基本不发生明显改变。
94.实验例3
95.对实施例1获得的破壁雨生红球藻发酵液进行香气评价以及发酵上清液中挥发性组分和组分相对丰度鉴定。
96.香气评价测试标准及测试结果如图1中的c、图3中的c、图4中的c所示，实施例1中的香气评价最高，而对比例2和对比例3均较差。
97.实施例5处理结果，以对比例1(c1)为参照。经高温高压灭菌后加入酒曲虽能破壁，但不能保持良好气味，气味评分《10。
98.发酵上清液中(实施例1)挥发性组分和组分相对丰度鉴定如图7所示，对离心获得的上清液进行顶空固相微萃取gcms分析，以预活化的安琪白酒曲溶液作为对照，通过opls-da差异分析模型(s-plot，vip》1)筛选出差异挥发性物质成分37个，经nist2017谱库鉴定出各物质分子，根据差异挥发性分子各自的物理化学气味特征，本发明认为发酵上清液呈现出浓厚的甜香味是由辛酸乙酯、甲酸己酯、丁酸苯乙酯特征甜味挥发物质引起。
99.上述结果表明实施例5虽然能完全破壁但气味不好，高温灭菌处理对成分产生了影响，对比例3虽然能改善气味，但对比例2、对比例3均不能有效破除细胞壁。而本发明提供的破壁方法得到的发酵液气味芳香，有效破除细胞壁的同时几乎不影响雨生红球藻内的功能组分，可以实现生物发酵破除细胞壁，发酵液也有利于在营养饮品中开发应用。
100.实验例4
101.本实验例提供对雨生红球藻进行破壁的菌种或曲的筛选方法，包括以下步骤：
102.1)称取雨生红球藻藻粉(每份300mg)，加入纯水10ml，经121℃灭菌20min后取出于超净工作台中接菌或曲，于28℃培养箱中静置培养一周。使用的12种水解菌源包括乳酸菌(s1)、枯草芽孢杆菌(s2)、植物乳杆菌(s3)、毕氏酵母(s4)、面酵母(s5)、冠突散囊菌(s6)、黑曲霉
103.(s7)、安琪白酒曲(s8)、古田红曲米(s9)、米曲霉粉(s10)、毛霉曲粉(s11)、醋酸菌粉(s12)。单菌接入使用活化后的高浓度菌液，曲接入采用直接添加的方式。上述12种水解菌源均为市售产品。
104.2)将步骤1)中样品经过7天后冻干，称取30mg粉末加入丙酮6ml提取。
105.同时设置对照组c1、c2、c3，c1为原始雨生红球藻粉末；c2为120℃灭菌15分钟后的样品；c3为120℃灭菌15分钟后保存7天的样品。
106.筛选结果如图9所示，已经破壁的藻粉具有明显的深红色，如图9，可以看到s7-s12的水解曲可以对雨生红球藻进行破壁，其中s8安琪白酒曲颜色最深，对雨生红球藻的破壁效果最好。
107.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动或参数操作范围拓展。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，其特征在于，包括以下步骤；将麸曲添加至高温灭菌预处理的雨生红球藻(haematococcus pluvialis)或未经预处理的雨生红球藻(haematococcus pluvialis)中进行密封发酵处理，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。2.根据权利要求1所述的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，其特征在于，当雨生红球藻未进行高温灭菌时，包括如下步骤：1)将麸曲接种至碳源水溶液中进行预活化；2)向步骤1)中预活化的麸曲溶液中添加未经预处理的雨生红球藻(haematococcus pluvialis)进行有氧共存培养；3)步骤2)中有氧共存培养后进行密封发酵，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液；可选的，所述高温灭菌是指雨生红球藻经过80℃-160℃条件下进行灭菌＞0，≤120min；可选的，所述高温灭菌是指雨生红球藻经过120℃条件下进行灭菌15min。3.根据权利要求1或2所述的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，其特征在于，步骤1)中所述麸曲为安琪白酒曲、古田红曲米、米曲霉粉、毛霉曲粉、醋酸菌粉或黑曲霉中的至少一种；和/或，所述麸曲的接种量为水的总质量的1-5wt％；可选的，碳源水溶液中碳源的质量浓度为1-5wt％；可选的，步骤1)中所述麸曲为安琪白酒曲；可选的，所述麸曲的接种量为水的总质量的2wt％；可选的，所述碳源水溶液中碳源的质量浓度为2wt％。4.根据权利要求1或2所述的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，其特征在于，步骤1)中所述预活化温度为32-36℃，预活化时间为0.5-1.5h；可选的，步骤1)中所述预活化温度为35℃，预活化时间为1h；可选的，步骤2)中所述雨生红球藻的添加质量与所述麸曲的接种质量比为(2-4)：2；可选的，步骤2)中所述雨生红球藻的添加质量与所述麸曲的接种质量比为3:2。5.根据权利要求1-4任一项所述的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，其特征在于，步骤2)中所述有氧共存培养温度为25-30℃，有氧共存培养时间为1-3h。6.根据权利要求1-5任一项所述的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，其特征在于，步骤3)中所述密封发酵温度为25-30℃，密封发酵时间为≥5d。和/或，所述密封发酵包括顶部空间氧气耗尽阶段和厌氧发酵阶段；可选的，步骤3)中所述密封发酵温度为28℃，密封发酵时间为5-10d。7.一种类胡萝卜素的提取方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法对雨生红球藻进行预处理。8.权利要求7所述的类胡萝卜素的提取方法，其特征在于，对雨生红球藻预处理后还包括离心分离雨生红球藻、再乙醇或丙酮浸提的步骤，提取得到类胡萝卜素；可选的，在乙醇或丙酮浸提步骤中，采用超声浸提。9.根据权利要求7或8所述的类胡萝卜素的提取方法，其特征在于，所述类胡萝卜素为虾青素和/或虾青素酯。
10.一种营养饮品，其特征在于，其原料包括权利要求1-6任一项所述的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法获得的破壁雨生红球藻发酵液或发酵上清液。

技术总结
本发明属于微生物处理技术领域，具体涉及一种利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法及其应用。本发明提供的利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法，包括：将麸曲添加至高温灭菌预处理的雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)或未经预处理的雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)中进行密封发酵处理，发酵结束后获得破壁雨生红球藻发酵液。本发明利用生物发酵对雨生红球藻进行破壁的方法可以有效破除雨生红球藻的细胞壁，在后一种情况下发酵几乎不影响虾青素等类胡萝卜素成分。分。分。


技术研发人员：王立岩 张鹏 徐颖 胡章立
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/8/14