一种PCR引物和探针的设计方法与流程

一种pcr引物和探针的设计方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一种pcr引物和探针的设计方法。


背景技术：

2.除少数病毒外，dna是大多数生物体的主要遗传物质。细胞中的dna可能由于环境暴露于某些化学物质、紫外线辐射、其他遗传因素，甚至由于dna复制和修复过程的缺陷而发生变化。生物体、病毒基因组或染色体外dna的核苷酸序列的遗传改变称为突变。
3.基因突变是基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，可以发生在发育的任何时期，但通常发生在dna复制时期，特别是复制时出现的随机性差错，在自然界各物种中普遍存在，并具有随机性。机体细胞具备一系列进化保守而完善的dna损伤监视和修复体系，可修复dna损伤，基因突变不会发生，确保基因组稳定和遗传信息连续性。细胞dna损伤的修复机制一旦发生异常，基因突变的几率增大，将导致严重后果，如对环境因子高度敏感、个体癌症易感性显著增加等。
4.基因突变一般可分为碱基置换突变和移码突变两类。碱基置换突变也称为点突变，是指dna分子中一个碱基对被另一个不同的碱基对取代，可以是一种嘌呤被另一种嘌呤取代或是一种嘧啶被另一种嘧啶取代，也可以是嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤。dna片段中某一位点插入或丢失一个或几个(非3的倍数)碱基对时，造成插入或丢失位点以后的一系列编码顺序发生错位的突变是移码突变。dna复制出现差错时，不能够修复，无论是发生碱基置换突变还是移码突变，都能使多肽链中氨基酸组成或顺序发生改变，进而影响蛋白质或酶的生物功能，使细胞生理功能改变，导致细胞的异常分裂、分化或者被机体免疫系统清除。基因突变是多种因素相互作用的综合结果，机体的内部因素dna复制过程中，基因内部的脱氧核苷酸的数量、顺序、种类发生局部改变具有普遍性，即受年龄、性别等客观因素影响，又受物理、化学、生物等外部因素的作用，增加基因突变的可能性，改变了基因的遗传信息。
5.正是遗传特性的突然变化产生了可变性，使得进化得以继续。如果没有突变，生命就不可能从无机物质中逐渐发展。突变可以发生在不同的规模范围从小(单碱基)到大幅度(多基因)。由于突变引起的遗传变异，特别是在基因的编码区域，显示出极大的影响，导致各种疾病的发展和身体异常。一些突变对机体有益，如免疫球蛋白功能多样性的发展。对生物体有益的突变是由自然选择的，这种突变在基因库中积累。
6.因此，准确、快速地检测病毒核酸基因对于控制疾病大流行非常重要。一个新出现的序列变体可以逃避分子分析中的检测。这可能是一个罕见的事件，但如果它发生的影响可能是非常重大的。个体可能被错误地告知他们没有被感染，这可能会增加一种新变种的传播，这在例如sars-cov-2大流行期间更具挑战性，因为新的序列变体频繁出现。因此那些例如应用rt-qpcr诊断sars-cov-2的人意识到基因的突变对他们的监测和rt-qpcr的结果输出会产生重大影响。
7.病毒变异的遗传变化可能导致引物或探针序列不再完美地补充其靶向的遗传区
域。引物和探针结合区域的序列变化可能对pcr性能没有影响，也可能只是边缘影响或者是灾难性的影响。引物或探针的五个主区的序列错配很少影响分析性能，而三个主区的序列错配影响更大。
8.pcr易受引物和探针结合位点序列变异的影响，即使是很小的序列变化也可能导致检测失败和假阴性结果。针对单一病原体内两个或多个不同基因的突变位点进行针对性重叠碱基的引物和探针设计的出现为pcr检测提高了检测相关变异的可靠性，因为设计的重叠碱基的引物和探针巧妙地避开了核酸基因的突变位置，受到目标基因突变所带来的影响进一步降低，提高检测的性能。因此，如何准确地对含有突变位点的靶序列进行pcr检测，防止漏检，成为了目前核酸检测，特别是针对病毒的核酸检测要解决的重要问题。目前实验室检测的核酸扩增时间长达1小时以上，如何缩短扩增时间也是当务之急要解决的问题。


技术实现要素：

9.解决的技术问题：
10.本发明的一个方面，是针对现有技术中核酸pcr由于存在突变位点导致漏检，以及检测时间长的问题，提供了一种pcr引物和探针的设计方法。
11.具体地，本发明提供了一种用于跨越基因突变位点的超短扩增序列的引物和探针的设计方法。该技术不但灵敏度高，并且能有效缩短pcr的扩增时间，以及有效避免因基因突变导致的漏检。
12.技术方案：
13.一种pcr引物和探针的设计方法，包括以下步骤：
14.步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5’末端的上游设计正向引物，所述正向引物与所述探针的5’末端反方向间隔1～3bp碱基；
15.步骤2)在待扩增靶序列对应的探针的3’末端的下游设计反向引物，所述反向引物与所述探针的3’末端延5’方向存在3～5bp碱基的重叠区域。
16.一种pcr引物和探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
17.步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5’末端的上游设计正向引物，所述正向引物与所述探针的5’末端延3’方向存在3～5bp碱基的重叠区域；
18.步骤2)在待扩增靶序列对应的探针的3’末端的下游设计反向引物，所述反向引物与所述探针的3’末端正方向间隔1～3bp碱基。
19.在本发明中，所述突变包括但不限于点突变、缺失突变或插入突变。上述突变可以存在于，例如在本发明的一个实施方式中，在所述探针与待扩增靶序列的互补结合区域或所述重叠区域存在n个突变位点。同时，上述突变可以为多个，例如，n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
……
。
20.作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述正向引物的长度为15～18bp，所述反向引物的长度为13～18bp。
21.作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述探针的长度为17～22bp。
22.在本发明中，所述重叠区域的碱基，即探针和引物上相对应的碱基，其序列可以为相同，也可以为不同。当序列不同时，可有效避免探针和反向引物的竞争性结合，影响结合效率。
23.在本发明中，在所述探针的5’端标记有荧光基团，在所述探针的3’端标记有与所述荧光基团对应的淬灭基团。
24.作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述荧光基团为fam、vic、hex或mgb。更优选地，所述荧光基团为mgb。
25.为了使所设计的引物具有合适的tm值，作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述引物和探针的gc含量为40％～60％。更优选地，所述引物和探针的gc含量为45％～55％。
26.作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述引物和探针的tm值范围为50℃～62℃。
27.具体地，在本发明的某些实施方式中，反向引物可以通过适当的调整引物的长度和引入的错配碱基的类型以及3’端引入合适长度的无关序列等获得；探针序列可以通过调整探针的长度，标记不同的荧光基团或者在5’端引入无关序列。其中探针的总设计长度为17～22bp，扩增突变靶序列的总设计长度为53～58bp。
28.依照本发明设计的引物和探针进行pcr扩增反应时，反应液中的dna聚合酶，dntp，mg
2+
和体系缓冲液等组分与普通的pcr相同，并可根据不同的反应予以优化。
29.本发明的有益效果：
30.通过本发明中的超短扩增片段和跨越变异区域的引物探针重叠设计方法，可有效避免基因突变中的点突变，缺失突变以及插入突变对扩增敏感性的影响，而且由于扩增片段较短，使用比常规荧光pcr更短的变性和退火时间，即可获得较高的敏感性和扩增效率，为临床上提供一种更加高效准确的检测方法。
附图说明
31.图1为本发明实施例中的引物设计示意图；
32.图2a和图2b为本发明实施例中的扩增程序实验参数图，其中图2a为考核试剂的扩增程序实验参数图，图2b为对比试剂的扩增程序实验参数图。
具体实施方式
33.本发明公开了一种pcr引物和探针的设计方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
34.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
35.下面就本发明中出现的部分术语作以解释。
36.术语“pcr”即聚合酶链式反应，在本发明中涵盖所述反应的多个衍生形式，包括但不限于反转录酶pcr(reverse transcriptase pcr，rt-pcr)、实时pcr、巢式聚合酶连锁反
应(nested pcr)、定量pcr(quantitative pcr)、rt-qpcr、多重pcr(multiplexed pcr)等。本领域技术人员可以从本发明的上下文中辨别所采用的所述特定pcr的形式。
37.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
38.本实施例所使用的对比商品信息：广州达安基因股份有限公司新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)
39.实施例
40.实施例1：引物设计(方案一)
41.以新型冠状病毒(sars-cov-2)中的序列作为待扩增靶序列，按照图1的方案一所示，利用本发明方法设计引物。即，将突变碱基设计在探针的3’末端和反向引物的3’末端，引物和探针重叠3～5个碱基，其中突变碱基为重叠的3～5碱基的任何一个或几个。正向引物3’末端与探针间隔1～3个碱基。正向引物设计长度为18个碱基，探针设计为22个碱基，反向引物长度为18个碱基，去除探针和反向引物重叠的间接数量，扩增片段长度为53个碱基左右。
42.这种超短扩增片段和跨越变异区域的引物探针重叠设计方法，可有效避免变异碱基对扩增敏感性的影响，而且由于扩增片段较短，使用比常规荧光pcr更短的变性和退火时间，即可获得较高的敏感性和扩增效率，为临床上提供一种更加高效准确的检测方法。该技术不但有效缩短pcr的扩增时间，而且能有效避免因基因突变导致的漏检。为了鉴定病毒基因组的区域，需要对分子靶标的进一步分析以达到最高的诊断准确性。引物/探针集应通过进一步的实验进行评估，以便可以开发出更敏感和更特定的引物/探针。待测靶序列和设计好的引物和探针的序列信息如下：
43.待测靶序列：
[0044]5’
gctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagag caaaatgt(c/t)tggtaaaggccaacaacaacaa3’[0045]
正向引物：
[0046]
gctttgctgctgcttgac
[0047]
反向引物：
[0048]
gt(c/t)tggtaaaggccaac
[0049]
探针：
[0050]
ttgaaccagcttgagagcaaaat
[0051]
以上序列中：gt(c/t)t括号中代表已发生突变的位点(由原始的c突变为t)。
[0052]
利用设计好的引物和探针对sars-cov-2样本进行检测。反应体系荧光基团及检测通道的选择如表1所示。扩增程序参数如图2所示。
[0053]
表1荧光通道检测选择
[0054]
通道1(orf1ab)2(内标)4(e基因)检测荧光famhex/viccy5
[0055]
反应体系为30μl。
[0056]
实施例2：扩增时间的对比
[0057]
反应体系荧光基团及检测通道的选择如表1所示。扩增程序参数如图2所示。
[0058]
结果：
[0059]
考核试剂的引物探针(由实施例1中的方法设计)扩增理论时间为510s(不包含仪器升降温所需时间)。对比试剂的引物探针扩增理论时间为4500s(不包含仪器升降温所需时间)。
[0060]
根据考核试剂与对比试剂扩增的理论时间的对比，考核试剂的反应用时缩短了近90％，表明应用本发明方法设计的引物探针试剂能够大大提高目标基因的扩增效率，缩短检测所需时间。
[0061]
实施例3：新型冠状病毒(sars-cov-2)核酸检测扩增效率的对比验证
[0062]
反应体系荧光基团及检测通道的选择如表1所示。扩增程序参数如图2所示。同时使用市售的其他核酸检测试剂作为对比试剂。
[0063]
结果：如表2所示。
[0064]
表2考核试剂与对比试剂检测orf1ab和n基因的ct值及检测结果对比(方案一引物及探针)
[0065]
[0066]
[0067]
[0068][0069]
结果表明：在测试的结果中，考核试剂orf1ab和n基因的检测ct值明显小于对比试剂检测的ct值，说明考核试剂的高灵敏性、高特异性。当检测的样本浓度较低时，仍能有效的检出。应用本发明所设计的引物和探针短时间能够进行完全变性和退火，重叠碱基超短序列引物和探针的研发能够确保高扩增效率，缩短扩增的时间，大幅度的缩短核酸检测的时间，特异性高，灵敏度高，检测速度快等特点。
[0070]
实施例4：针对特定位点的突变，验证本发明引物探针设计方法(方案一)对突变变异株有效检出进行试验验证
[0071]
质控品样本用阴性咽拭子样本进行稀释，制备咽拭子中值样本、低值样本(最低检测限样本)。结果如表4所示。采用本发明方法设计的考核试剂(方案一)进行检测，研究考核试剂检测样本的低值精密度、中值精密度、最低检测限，以验证考核试剂检测性能的有效性。本组低值样本浓度稀释至50copies/ml。
[0072]
表4
[0073]
[0074][0075]
研究结果表明，检测n基因突变株，咽拭子低值检出率100％，平均值32.99，标准差0.59，精密度cv(％)为1.80％，符合检出率≥95％，cv≤5％技术要求。咽拭子中值样本精密度cv(％)为0.54％；符合≤5％的技术要求。检测结果均未对本引物探针的n基因最低检出限50copies/ml构成影响，检测结果的精密度均＜5％，符合技术要求，说明了本发明设计方法的有效性，可有效避免漏检情况的发生。
[0076]
实施例5：引物设计(方案二)
[0077]
以新型冠状病毒(sars-cov-2)中的序列作为待扩增靶序列，按照图1的方案二所示，利用本发明方法设计引物。即，将突变碱基设计在探针的5’末端和正向引物的5’末端，引物和探针重叠3～5个碱基，其中突变碱基为重叠的3～5碱基的任何一个或几个。反向引物3’末端与探针间隔1～3个碱基。正向引物设计长度为18个碱基，探针设计为22个碱基，反向引物长度为18个碱基，去除探针和反向引物重叠的间接数量，扩增片段长度为53个碱基左右。
[0078]
这种超短扩增片段和跨越变异区域的引物探针重叠设计方法，可有效避免变异碱基对扩增敏感性的影响，而且由于扩增片段较短，使用比常规荧光pcr更短的变性和退火时
间，即可获得较高的敏感性和扩增效率，为临床上提供一种更加高效准确的检测方法。该技术不但有效缩短pcr的扩增时间，而且能有效避免因基因突变导致的漏检。为了鉴定病毒基因组的区域，需要对分子靶标的进一步分析以达到最高的诊断准确性。引物/探针集应通过进一步的实验进行评估，以便可以开发出更敏感和更特定的引物/探针。待测靶序列和设计好的引物和探针的序列信息如下：
[0079]
待测靶序列：
[0080]5’
tcaactccaggcagcagta(gggg/aacc)
[0081]
aacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctctt3’[0082]
正向引物：
[0083]
caactccaggcagcagta(gggg/aacc)
[0084]
反向引物：
[0085]
ggcggtgatgctg
[0086]
探针：
[0087]
aacttctcctgctagaatggctg
[0088]
以上序列中：(gggg/aacc)括号中代表已发生突变的位点(由原始的gggg突变为aacc)。
[0089]
利用设计好的引物和探针对sars-cov-2样本进行检测。反应体系荧光基团及检测通道的选择如表1所示。扩增程序参数如图2所示。反应体系为30μl。
[0090]
实施例6：扩增时间的对比
[0091]
反应体系荧光基团及检测通道的选择如表1所示。扩增程序参数如图2所示。
[0092]
结果：
[0093]
考核试剂的引物探针(由实施例5中的方法设计)扩增理论时间为500s(不包含仪器升降温所需时间)。对比试剂的引物探针扩增理论时间为4500s(不包含仪器升降温所需时间)。
[0094]
根据考核试剂与对比试剂扩增的理论时间的对比，考核试剂的反应用时缩短了近90％，表明应用本发明方法设计的引物探针试剂能够大大提高目标基因的扩增效率，缩短检测所需时间。
[0095]
实施例7：针对特定位点的突变，验证本发明引物探针设计方法(方案二)对突变变异株有效检出进行试验验证
[0096]
本实施例将实施例5中方法设计新型冠状病毒(sars-cov-2)的引物探针序列进行生物信息序列比对产生需要验证的n基因突变株，将产生突变的突变株序列进行合成并验证，并对本发明方法设计的引物探针的最低检出限和精密度的研究(咽拭子样本)。结果如表5所示。研究结果表明，检测n基因突变株，检测结果均未对本引物探针的n基因最低检出限50copies/ml构成影响，检测结果的精密度均＜5％，符合技术要求，说明了本发明设计方法的有效性，可有效避免漏检情况的发生。
[0097]
将合成的n基因突变株序列样本用阴性咽拭子样本进行稀释，制备咽拭子中值样本、低值样本(最低检测限样本)。采用本发明方法设计的考核试剂进行检测，研究考核试剂检测样本的低值精密度、中值精密度、最低检测限，以验证考核试剂检测性能的有效性。本组低值样本浓度稀释至50copies/ml。
[0098]
表5
[0099][0100][0101]
实施例8：引物设计(方案三)
[0102]
以新型冠状病毒(sars-cov-2)中的序列作为待扩增靶序列，按照图1的方案三所示，利用本发明方法设计引物。即，将突变碱基设计在探针的5’末端和正向引物的5’末端，引物和探针重叠3～5个碱基，其中突变碱基为重叠的3～5碱基的任何一个或几个。反向引物3’末端与探针间隔1～3个碱基。正向引物设计长度为18个碱基，探针设计为22个碱基，反向引物长度为18个碱基，去除探针和反向引物重叠的间接数量，扩增片段长度为53个碱基左右。
[0103]
这种超短扩增片段和跨越变异区域的引物探针重叠设计方法，可有效避免变异碱基对扩增敏感性的影响，而且由于扩增片段较短，使用比常规荧光pcr更短的变性和退火时间，即可获得较高的敏感性和扩增效率，为临床上提供一种更加高效准确的检测方法。该技术不但有效缩短pcr的扩增时间，而且能有效避免因基因突变导致的漏检。为了鉴定病毒基
因组的区域，需要对分子靶标的进一步分析以达到最高的诊断准确性。引物/探针集应通过进一步的实验进行评估，以便可以开发出更敏感和更特定的引物/探针。待测靶序列和设计好的引物和探针的序列信息如下：
[0104]
待测靶序列：
[0105]5’
taccgtctgcggtatgtggaaaggtta(t/c)
[0106]
ggctgtagttgtgatcaactccgcgaacccatgcttcagtcagctgatgca caat 3’[0107]
正向引物：
[0108]
gcggtatgtggaaaggtt
[0109]
反向引物：
[0110]
atgcttcagtcagctgat
[0111]
探针：
[0112]
a(t/c)ggctgtagttgtgatcaactccgcg
[0113]
以上序列中：(t/c)括号中代表已发生突变的位点(由原始的t突变为c)。
[0114]
利用设计好的引物和探针对sars-cov-2样本进行检测。反应体系荧光基团及检测通道的选择如表1所示。扩增程序参数如图2所示。反应体系为30μl。
[0115]
实施例9：扩增时间的对比
[0116]
反应体系荧光基团及检测通道的选择如表1所示。扩增程序参数如图2所示。
[0117]
结果与实施例6相同。
[0118]
实施例10：针对特定位点的突变，验证本发明引物探针设计方法(方案三)对突变变异株有效检出进行试验验证。
[0119]
本实施例将实施例8设计的新型冠状病毒(sars-cov-2)的引物探针序列进行生物信息序列比对产生需要验证的o基因突变株，将产生突变的突变株序列进行合成并验证，并对本发明方法设计的引物探针的最低检出限和精密度的研究(痰液样本)。结果如表6所示。
[0120]
将合成的o基因突变株序列样本用阴性稀释液进行稀释，制备痰液中值样本、低值样本(最低检测限样本)。采用本发明方法设计的考核试剂进行检测，研究考核试剂检测样本的低值精密度、中值精密度、最低检测限，以验证考核试剂检测性能的有效性。本组低值样本浓度稀释至50copies/ml。
[0121]
表6
[0122]
[0123][0124]
研究结果表明，检测o基因突变株，咽拭子低值检出率100％，平均值30.68，标准差0.30，精密度cv(％)为0.98％，符合检出率≥95％，cv≤5％技术要求。咽拭子中值样本精密度cv(％)为0.21％；符合≤5％的技术要求。检测结果均未对本引物探针的o基因最低检出限50copies/ml构成影响，检测结果的精密度均＜5％，符合技术要求，说明了本发明设计方法的有效性，可有效避免漏检情况的发生。
[0125]
实施例11：引物设计(方案四)
[0126]
以新型冠状病毒(sars-cov-2)中的序列作为待扩增靶序列，按照图1的方案四所示，利用本发明方法设计引物。即，将突变碱基设计在探针的3’末端和反向引物的3’末端，引物和探针重叠3～5个碱基，其中突变碱基为重叠的3～5碱基的任何一个或几个。正向引物3’末端与探针间隔1～3个碱基。正向引物设计长度为18个碱基，探针设计为22个碱基，反向引物长度为18个碱基，去除探针和反向引物重叠的间接数量，扩增片段长度为53个碱基左右。
[0127]
这种超短扩增片段和跨越变异区域的引物探针重叠设计方法，可有效避免变异碱基对扩增敏感性的影响，而且由于扩增片段较短，使用比常规荧光pcr更短的变性和退火时间，即可获得较高的敏感性和扩增效率，为临床上提供一种更加高效准确的检测方法。该技术不但有效缩短pcr的扩增时间，而且能有效避免因基因突变导致的漏检。为了鉴定病毒基因组的区域，需要对分子靶标的进一步分析以达到最高的诊断准确性。引物/探针集应通过进一步的实验进行评估，以便可以开发出更敏感和更特定的引物/探针。待测靶序列和设计好的引物和探针的序列信息如下：
[0128]
待测靶序列：
[0129]5’
gtatgtggaaaggttatggctgtagttgtgatcaactccgcgaaccc atgcttcagtc(a/g)gctgatgcacaatcgtt3’[0130]
正向引物：
[0131]
ggttatggctgtagttgt
[0132]
反向引物：
[0133]
tgatgcacaatcgt
[0134]
探针：
[0135]
aactccgcgaacccatgcttcagtc(a/g)gc
[0136]
以上序列中：(a/g)括号中代表已发生突变的位点(由原始的a突变为g)。
[0137]
利用设计好的引物和探针对sars-cov-2样本进行检测。反应体系荧光基团及检测通道的选择如表1所示。扩增程序参数如图2所示。反应体系为30μl。
[0138]
实施例12：扩增时间的对比
[0139]
反应体系荧光基团及检测通道的选择如表1所示。扩增程序参数如图2所示。
[0140]
结果与实施例2相同。
[0141]
实施例13：针对特定位点的突变，验证本发明引物探针设计方法(方案四)对突变变异株有效检出进行试验验证。
[0142]
本实施例将实施例11中设计的新型冠状病毒(sars-cov-2)的引物探针序列进行生物信息序列比对产生需要验证的o基因突变株，将产生突变的突变株序列进行合成并验证，并对本发明方法设计的引物探针的最低检出限和精密度的研究(痰液样本)。
[0143]
将合成的o基因突变株序列样本用阴性稀释液进行稀释，制备痰液中值样本、低值样本(最低检测限样本)。结果如表7所示。采用本发明方法设计的考核试剂进行检测，研究考核试剂检测样本的低值精密度、中值精密度、最低检测限，以验证考核试剂检测性能的有效性。本组低值样本浓度稀释至50copies/ml。
[0144]
表7
[0145][0146]
研究结果表明，检测o基因突变株，咽拭子低值检出率100％，平均值30.57，标准差0.41，精密度cv(％)为1.33％，符合检出率≥95％，cv≤5％技术要求。咽拭子中值样本精密度cv(％)为0.29％；符合≤5％的技术要求。检测结果均未对本引物探针的o基因最低检出限50copies/ml构成影响，检测结果的精密度均＜5％，符合技术要求，说明了本发明设计方法的有效性，可有效避免漏检情况的发生。
[0147]
以上各组结果表明，本发明设计的重叠碱基引物和探针，在检测咽拭子低值样本检出率100％，精密度为1.80％，符合低值样本检出率≥95％的要求；咽拭子中值样本精密度cv(％)为0.54％，符合中值样本精密度cv(％)≤5％的要求，考核试剂各性能指标均符合要求，以验证考核试剂检测性能的有效性，对各阳性参考品和阴性参考品能够准确检出，充分说明应用本发明方法所设计的引物探针具有良好的有效性和稳定性，应用前景广阔。重叠碱基超短序列引物和探针的研发能够确保高扩增效率，缩短扩增的时间，大幅度的缩短核酸检测的时间，特异性高，灵敏度高，检测速度快等特点。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种pcr引物和探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5’末端的上游设计正向引物，所述正向引物与所述探针的5’末端反方向间隔1～3bp碱基；步骤2)在待扩增靶序列对应的探针的3’末端的下游设计反向引物，所述反向引物与所述探针的3’末端延5’方向存在3～5bp碱基的重叠区域。2.一种pcr引物和探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5’末端的上游设计正向引物，所述正向引物与所述探针的5’末端延3’方向存在3～5bp碱基的重叠区域；步骤2)在待扩增靶序列对应的探针的3’末端的下游设计反向引物，所述反向引物与所述探针的3’末端正方向间隔1～3bp碱基。3.根据权利要求1或2所述的设计方法，其特征在于，在所述探针与待扩增靶序列的互补结合区域或所述重叠区域存在n个突变位点，其中，n≥1。4.根据权利要求1或2所述的设计方法，其特征在于，所述正向引物的长度为15～18bp，所述反向引物的长度为13～18bp。5.根据权利要求1或2所述的设计方法，其特征在于，所述探针的长度为17～22bp。6.根据权利要求1或2所述的设计方法，其特征在于，在所述探针的5’端标记有荧光基团，在所述探针的3’端标记有与所述荧光基团对应的淬灭基团。7.根据权利要求6所述的设计方法，其特征在于，所述荧光基团为fam、vic、hex或mgb，优选为mgb。8.根据权利要求1或2所述的设计方法，其特征在于，所述待扩增靶序列的长度为53～58bp。9.根据权利要求1或2所述的设计方法，其特征在于，所述引物和探针的gc含量为40％～60％，优选为45％～55％。10.根据权利要求1或2所述的设计方法，其特征在于，所述引物和探针的t
m
值范围为50℃～62℃。

技术总结
本发明公开了一种PCR引物和探针的设计方法，包括以下步骤：步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5’末端的上游设计正向引物，所述正向引物与所述探针的5’末端反方向间隔1～3bp碱基；步骤2)在待扩增靶序列对应的探针的3’末端的下游设计反向引物，所述反向引物与所述探针的3’末端延5’方向存在3～5bp碱基的重叠区域。通过本发明中的超短扩增片段和跨越变异区域的引物探针重叠设计方法，可有效避免基因突变中的点突变，缺失突变以及插入突变对扩增敏感性的影响，而且由于扩增片段较短，使用比常规荧光PCR更短的变性和退火时间，即可获得较高的敏感性和扩增效率，为临床上提供一种更加高效准确的检测方法。效准确的检测方法。效准确的检测方法。


技术研发人员：杨晓涵 王维 彭闯 高智强 王海滨 窦瑞艳 唐洁 石风
受保护的技术使用者：北京纳捷诊断试剂有限公司
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/8/14