一种可定量产毒型艰难梭菌增殖状态的荧光PCR引物组合及方法与流程

一种可定量产毒型艰难梭菌增殖状态的荧光pcr引物组合及方法
技术领域
1.本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种可定量产毒型艰难梭菌增殖状态的荧光pcr引物组合及方法。


背景技术：

2.艰难梭菌(clostridioides difficile)是人体肠道中常见的一种专性厌氧的，革兰氏阳性芽孢杆菌。正常情况下肠道菌群能够拮抗并限制艰难梭菌在肠道中的繁殖及毒素产生，使其不表现致病性。但临床上广谱抗生素、免疫抑制剂、化疗药物等的大量使用则会引起人体肠道微生态失调，产毒型艰难梭菌大量增殖，产生毒素进而导致艰难梭菌感染(clostridioides difficile infection,cdi)的发生。cdi会导致不同程度的腹泻、腹痛，严重时则可导致结肠穿孔、伪膜性结肠炎、中毒性巨结肠甚至死亡。近年来，随着抗生素广泛使用，cdi发病率显著增加，已经成为影响公共卫生安全的重大威胁。因此，早期正确的诊断对于疾病的治疗以及感染的控制尤为重要。
3.目前，常用cdi检测方法包括细胞毒性试验，产毒素培养，酶免疫反应和核酸扩增法。这些方法依赖于生物学或免疫学技术，以艰难梭菌产生的毒素蛋白(tcd a、tcd b)，谷氨酸脱氢酶(gdh)或其相应的编码基因(tcda、tcdb、gdh)为检测目标来判定艰难梭菌产毒菌株的存在。其中，细胞毒性试验以及产毒素培养法被视作艰难梭菌感染诊断的金标准，但细胞或细菌培养需要耗费较长的时间，难以在实际临床工作中广泛应用。酶免疫法虽然快速便捷，但其灵敏度较低，当样本量较少时(如水样便样本)，容易造成假阴性的结果。因此，灵敏度极高的核酸扩增法逐渐引起重视。但目前已有的核酸扩增方法仅以艰难梭菌存在与否作为检测标准，由于其超高的灵敏度，难以将艰难梭菌的无症状定植与实际感染区分开来，极易产生假阳性结果，进而造成过度治疗。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有方法的不足，提供一种精确定量样本中产毒型艰难梭菌增殖状态的荧光pcr引物组合及方法，有效区分艰难梭菌无症状定植及感染状态，改善传统核酸扩增法假阳性率高的缺陷，简化诊断流程，提高诊断的准确性。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
6.本发明首先提供了一种产毒型艰难梭菌增殖状态的荧光pcr引物组合，其包括通用引物515f和806r，以及特异性引物cd16f和cd16r；各引物序列如下：
7.515f：5
’‑
gtgycagcmgccgcggtaa-3’；
8.806r：5
’‑
ggactacnvgggtwtc taat-3’；
9.cd16f：5
’‑
ttgagcgatttacttcggtaaaga-3’；
10.cd16r：5
’‑
ccatcctgtactggctcacct-3’。
11.本发明还提供了一种产毒型艰难梭菌增殖状态的定量检测试剂盒，其包括所述的
引物组合。
12.进一步的，所述试剂盒还包括含有细菌16s rdnav4保守区及艰难梭菌16srdna特异性扩增序列的标准化克隆质粒、以及荧光pcr反应试剂。
13.进一步的，所述荧光pcr反应试剂至少包括含sybr green染料的酶混合液。
14.本发明还公开了一种可定量产毒型艰难梭菌增殖状态的荧光pcr检测方法，其包括如下步骤：
15.1)提取待检样品的dna；提取完成后，对dna样本进行稀释，稀释倍数为10倍以上；
16.2)采用所述的荧光pcr引物组合对步骤1)得到的稀释液进行荧光pcr反应，通用引物515f/806r和特异性引物cd16f/cd16r分别对总细菌及产毒型艰难梭菌进行定量；pcr扩增程序为：预变性95℃，30s；变性95℃，5s，退火54℃，30s，延伸72℃，30s，40个循环；
17.3)样本检测及结果判读
18.通过上述荧光pcr反应分别定量样本中总细菌量ct
total
以及产毒型艰难梭菌数量ct
cd
；根据总细菌量ct
total
数值对样本质量进行评估，对于有效样本，用δct＝ct
cd-ct
total
作为艰难梭菌丰度指标。
19.根据本发明的优选方案，步骤3)中，对样本质量进行评估时，将ct
total
＞25、无ct
total
值或δct＜0的样本认定为无效样本。
20.根据本发明的优选方案，步骤3)中，对于有效样本，若δct≤8，判读为产毒型艰难梭菌过度增殖；若8＜δct≤13，判读为存在产毒型艰难梭菌，疑似处于过度增殖状态；若δct＞13，判读为存在产毒型艰难梭菌，艰难梭菌携带；若ct
cd
＞35或无ct
cd
值，判读为不存在产毒型艰难梭菌。
21.根据本发明的优选方案，步骤2)中，荧光pcr反应体系为：10μl含sybr green染料的酶混合液，8.2μl双蒸水，所述上下游引物各0.4μl，引物终浓度0.2μm，待测dna样品1μl。
22.根据本发明的优选方案，步骤2)中，荧光pcr反应体系为：10μl含sybr green染料的酶混合液，8.2μl双蒸水，所述上下游引物各0.4μl，引物终浓度0.2μm，待测dna样品1μl。
23.本发明的有益效果是：
24.(1)本发明基于产毒型艰难梭菌16s rdna特异性序列设计的定量引物cd16f/r具有更高的检测灵敏度，对产毒型艰难梭菌基因组dna最低检出限可达到fg/ml级别，降低假阴性结果的出现。
25.(2)本发明能够在同一批次反应中同时定量总细菌数以及产毒型艰难梭菌数，确定产毒型艰难梭菌是否处于增殖状态，大大降低了传统方法仅检测艰难梭菌存在与否而造成的假阳性率高的缺陷。
26.(3)本发明能够通过总细菌定量结果对样本质量进行评估，有效避免因样本取样量不够或质量低下而导致的假阴性结果，尽可能降低漏检、错检情况的发生。
27.(4)本发明所提供的一种基于sybr green荧光染料的荧光pcr方法，操作简便快捷，无需探针设计及合成，成本更为低廉。试剂盒附带的标准化克隆质粒能够作为阳性对照，保证反应的稳定性及结果可靠性。
附图说明
28.图1为总细菌定量引物标准化克隆质粒扩增标准曲线；
(seq id no.10所示)，以产毒型艰难梭菌r20291纯菌基因组dna(初始提取浓度为370.12μg/ml)及其系列梯度稀释液作为检测对象，对各引物检测灵敏度进行评估。样本稀释梯度、dna浓度及各引物检测结果如表2所示。结果表明，目前已有艰难梭菌定量引物tcdb-f/r对艰难梭菌dna检出限约为37pg/ml，本发明基于tcdb毒素基因序列所设计的另外两对引物tcdb11/12和tcdb31/32的最低检出限同样位于3.7～37pg/ml之间。但基于产毒型艰难梭菌16s rdna特异性序列所设计的cd16f/r引物对艰难梭菌dna检出限可达到370fg/ml。以上结果综合表明，虽然基于艰难梭菌毒素基因序列设计定量引物是目前的主流，本发明所设计的cd16f/r能够将检测灵敏度提高约百倍，故本试剂盒采用cd16f/r作为产毒型艰难梭菌定量引物。
42.表2.各引物灵敏度评估结果
[0043][0044]
注：
“‑”
代表未检出艰难梭菌。
[0045]
(2)标准化克隆质粒构建及拷贝数计算：使用普通taq酶扩增出515f/806r及cd16f/r的产物片段，并使用ta克隆方法分别将其连接至t载体上，获得标准化克隆质粒p515和pcd16。使用nanodrop 2000测定质粒浓度并计算其拷贝数，计算结果如表3所示。使用无菌水对获得标准化克隆质粒进行稀释，获得109～102copies/μl的10倍梯度系列稀释液，作为后续pcr反应样品，对pcr反应条件进行优化。
[0046]
表3.标准化克隆质粒浓度及拷贝数计算
[0047]
质粒名称浓度(ng/μl)质粒长度(bp)拷贝数(copies/μl)p51582.233922.2
×
10
10
pcd1676.132542.1
×
10
10
[0048]
(3)荧光pcr反应体系及程序
[0049]
荧光定量pcr反应在cfx96 touch real-time pcr仪(bio-rad，usa)中进行。pcr反应体系：10μl含sybr green染料的酶混合液，8.2μl双蒸水，所述上下游引物各0.4μl(终浓度0.2μm)，待测dna样品1μl。pcr扩增程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s，退火54℃，30s，延伸72℃，30s，40个循环。
[0050]
结果表明，在该反应条件下，总细菌定量引物515f/806r(图一)及艰难梭菌特异性引物cd16f/r(图二)均可以保持良好的扩增效率(e值在95％～105％之间)，扩增ct值能够
在109～102个拷贝数范围内与样本浓度保持线性关系(r2＞0.99)，计算公式分别为：
[0051][0052][0053]
以上结果综合表明该试剂盒能够对样本中总细菌及艰难梭菌含量进行精确定量，检测范围广且灵敏度高。
[0054]
实施例2.粪便样本提取及上样稀释范围
[0055]
(1)收集艰难梭菌感染者粪便样本，使用商品化粪便基因组dna提取试剂盒(qiagen，germany)提取样本总dna，提取步骤参照试剂盒说明书。提取完成后，对dna样本进行10倍梯度稀释，获得10-1
～10-7
系列稀释液。
[0056]
(2)采用实施例1中的荧光pcr反应体系及方法，以515f/806r总细菌定量引物为例，对获得的dna样本原液及稀释液进行定量。结果表明，dna原液对于荧光pcr反应存在强烈抑制，导致荧光值偏低(图三)，此时样本dna原液、10-1
稀释液、10-2
稀释液ct值分别为13.70、14.77、17.96，不符合线性关系，故ct值不可信。而如图四所示，样本dna10-1
～10-7
系列稀释液ct值与样本浓度线性关系良好(r2＝0.997)，说明采用本发明pcr方法时，dna提取后应至少进行10倍稀释后再进行检测，在10-1
～10-7
稀释区间内，结果均真实可信。
[0057]
实施例3.粪便样本内源性干扰实验
[0058]
(1)使用商品化细菌基因组dna提取试剂盒(qiagen，germany)提取艰难梭菌r20291纯菌基因组dna，提取步骤参照试剂盒说明书。提取完成后，对dna样本进行10倍梯度稀释，获得10-1
稀释液、10-2
稀释液、10-3
稀释液和10-4
稀释液。将纯菌dna各梯度稀释液与粪便样本dna的10-1
稀释液1:1混合均匀，以检测粪便样本中是否存在内源性干扰物质。同时，纯菌dna各梯度稀释液与无菌水1:1混合作为对照。
[0059]
(2)采用实施例1中的荧光pcr反应体系及方法，对获得的dna混合样本进行检测，以评估粪便dna样本中可能存在的内源性干扰物质对pcr结果精确性的影响。实验结果表明(表4)，在本发明所设置的反应条件下，纯菌基因组dna与粪便样本混合后，ct值变异系数小于1％，表明粪便样本中的内源性物质对于反应结果不会造成影响。
[0060]
表4.内源性物质干扰分析结果
[0061]
纯菌dna稀释倍数ct(纯菌+无菌水)ct(纯菌+粪便)变异系数10117.5817.470.99310220.6520.550.99510324.0024.171.00710427.2727.291.001
[0062]
实施例4.临床样本检测
[0063]
(1)临床样本设置：设置60例艰难梭菌传统pcr检测结果阳性的临床样本，其中按照现有诊断标准，艰难梭菌感染样本30例(感染组cd1-30)，艰难梭菌携带样本30例(携带组nd1-30)。所有临床粪便样本均经过浙江大学医学院附属第一医院检验科的抗原毒素检测、分离培养和pcr的验证。
[0064]
(2)粪便样本dna提取：使用粪便基因组dna提取试剂盒(qiagen，germany)提取样本总dna，提取步骤参照试剂盒说明书。样本dna提取结果如表5所示，由于临床样本个体间
差异性，样本dna浓度在3.7-364.5ng/μl之间不等。根据dna纯度(a260/280：1.8～2.0)剔除少量低质量样本后，参照实施例2结果，将dna样本稀释10倍后进行pcr检测。
[0065]
表5.临床样本dna提取结果
[0066]
携带组浓度(ng/μl)a260/280a260/230感染组浓度(ng/μl)a260/280a260/230nd1174.41.870.95cd1151.51.90.65nd252.51.841.34cd243.61.810.96nd3145.61.871.28cd334.31.850.97nd422.81.860.28cd445.41.841.12nd5187.71.851.26cd520.91.940.43nd6336.91.892.24cd6231.71.871.38nd7276.91.881.69cd725.21.961.46nd89.11.840.34cd880.51.861.76nd91311.851.87cd9341.921.12nd102711.881.65cd1026.21.910.96nd11131.11.870.71cd1147.11.891.54nd12331.860.3cd12364.51.881.97nd13165.41.840.93cd1322.11.820.61nd1465.71.871.1cd14213.81.861.88nd1528.41.910.29cd15591.810.27nd16103.71.881.14cd1618.91.880.11nd172401.881.44cd1715.51.870.05nd1864.11.890.91cd18113.41.831.52nd191691.870.24cd1922.51.810.94nd2041.31.860.32cd2028.21.850.35nd21239.11.881.95cd21105.21.830.35nd2270.51.840.2cd22323.31.871.74nd23418.21.881.02cd233.71.420.2nd24250.51.91.74cd243.91.580.06nd2593.71.871.3cd25241.840.55nd26256.91.891.81cd2695.81.860.52nd27201.41.881.87cd2722.21.810.3nd2881.21.90.33cd2869.31.881.06nd29131.11.871.2cd2938.91.860.31nd305.72.040.03cd30671.871.5
[0067]
(3)荧光pcr反应：采用实施例1中的荧光pcr反应体系及方法，对获得的dna样本稀释液进行定量，分别获得样本中总细菌及产毒型艰难梭菌的ct值。根据ct
total
数值剔除少部分低质量或无效样本，最终纳入分析的样本数量为携带组n＝29，感染组n＝26。总细菌及艰难梭菌拷贝数可根据实施例1中标准曲线计算得出，产毒型艰难梭菌丰度可根据如下公式计算：
[0068]
[0069]
经换算变形后为：
[0070][0071]
为简便，可直接用δct＝ct
cd-ct
total
作为艰难梭菌丰度指标，以判断艰难梭菌增殖状态，判读标准如表6所示。
[0072]
表6.艰难梭菌检测结果判读标准
[0073][0074]
注：“/”代表不必参考相应数值。
[0075]
根据图5可知，艰难梭菌感染组δct＝ct
cd-ct
total
数值在1.66～12.77之间，其中超过50％的样本数值小于8，100％的样本数值小于13；艰难梭菌携带组δct＝ct
cd-ct
total
数值在8.50～23.97之间，其中超过80％的样本数值大于13。以上结果表明，本发明能够准确鉴别出80％以上的艰难梭菌携带样本，极大地改善了传统pcr方法难以区分艰难梭菌无症状携带及感染的缺陷，简化后续检测流程，有效降低临床过度诊断情况的发生。
[0076]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种产毒型艰难梭菌增殖状态的荧光pcr引物组合，其特征在于包括通用引物515f和806r，以及特异性引物cd16f和cd16r；各引物序列如下：515f：5
’‑
gtgycagcmgccgcggtaa-3’；806r：5
’‑
ggactacnvgggtwtctaat-3’；cd16f：5
’‑
ttgagcgatttacttcggtaaaga-3’；cd16r：5
’‑
ccatcctgtactggctcacct-3’。2.一种产毒型艰难梭菌增殖状态的定量检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括含有细菌16s rdnav4保守区及艰难梭菌16s rdna特异性扩增序列的标准化克隆质粒、以及荧光pcr反应试剂。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光pcr反应试剂至少包括含sybr green染料的酶混合液。5.一种可定量产毒型艰难梭菌增殖状态的荧光pcr检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)提取待检样品的dna；提取完成后，对dna样本进行稀释，稀释倍数为10倍以上；2)采用权利要求1所述的荧光pcr引物组合对步骤1)得到的稀释液进行荧光pcr反应，通用引物515f/806r和特异性引物cd16f/cd16r分别对总细菌及产毒型艰难梭菌进行定量；pcr扩增程序为：预变性95℃，30s；变性95℃，5s，退火54℃，30s，延伸72℃，30s，40个循环；3)样本检测及结果判读通过上述荧光pcr反应分别定量样本中总细菌量ct
total
以及产毒型艰难梭菌数量ct
cd
；根据总细菌量ct
total
数值对样本质量进行评估，对于有效样本，用δct＝ct
cd-ct
total
作为艰难梭菌丰度指标。6.根据权利要求5所述的荧光pcr检测方法，其特征在于，步骤3)中，对样本质量进行评估时，将ct
total
＞25、无ct
total
值或δct＜0的样本认定为无效样本。7.根据权利要求5所述的荧光pcr检测方法，其特征在于，步骤3)中，对于有效样本，若δct≤8，判读为产毒型艰难梭菌过度增殖；若8＜δct≤13，判读为存在产毒型艰难梭菌，疑似处于过度增殖状态；若δct＞13，判读为存在产毒型艰难梭菌，艰难梭菌携带；若ct
cd
＞35或无ct
cd
值，判读为不存在产毒型艰难梭菌。8.根据权利要求5所述的荧光pcr检测方法，其特征在于，步骤2)中，荧光pcr反应体系为：10μl含sybr green染料的酶混合液，8.2μl双蒸水，所述上下游引物各0.4μl，引物终浓度0.2μm，待测dna样品1μl。9.根据权利要求5所述的荧光pcr检测方法，其特征在于，步骤2)中，荧光pcr反应体系为：10μl含sybr green染料的酶混合液，8.2μl双蒸水，所述上下游引物各0.4μl，引物终浓度0.2μm，待测dna样品1μl。

技术总结
本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种可定量产毒型艰难梭菌增殖状态的荧光PCR引物组合及方法。引物组合包括1对总细菌定量引物515F和806R，以及1对艰难梭菌特异性引物CD16F和CD16R。本发明通过设计并优化相关反应条件，能够同时精确定量样本中总细菌及产毒型艰难梭菌丰度，以此判断产毒型艰难梭菌是否处于过度增殖状态。本发明能够显著改善已有PCR检测方法假阳性率高的缺陷。检测方法假阳性率高的缺陷。检测方法假阳性率高的缺陷。


技术研发人员：王娜 陈云波 宋志强
受保护的技术使用者：济南微生态生物医学省实验室
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/8/14