一种全酶法从头合成DNA的方法与流程

一种全酶法从头合成dna的方法
技术领域
1.本技术属于分子生物学领域，具体涉及一种全酶法从头合成dna的方法。


背景技术：

2.oligo dna/dna合成技术始于1955年，发展至今已近70年，发展经历过：一代的固相柱式合成方法，二代的固相芯片合成方法，三代的生物酶法合成。
3.其中一代、二代是完全化学合成法，在合成过程中需要使用大量有毒化学物质，原料利用率低，产生大量的有毒废弃化学物。一代技术是目前最成熟的技术，已商业化，最大合成长度一般不超过200nt。二代、三代技术仍未大规模商业化，主要原因仍是技术不稳定，成本太高，需要特殊改造的酶或dntps。
4.三代合成技术仍停留在实验室阶段，主要有以下技术问题：
①
tdt末端转移酶介导的酶促合成，其中使用了修饰的dntps，每合成一个碱基都需要使用化学方法进行脱保护，才能继续下一轮合成，因此这个方法只能称为半酶dna合成方法。此外该方法使用的修饰dntps生产成本高，因此不适合商用。
②
tdt末端转移酶偶联dntps法，该方法需要将tdt酶和dntps进行偶联，这将会极大的增加成本，因为首先要合成带有偶联基团的dntps，再将特殊的dntps偶联在酶上，但酶往往有多个偶联位点，偶联在不同的位点上，会导致酶的活性的改变，因此需要不断尝试，增加成本。


技术实现要素：

5.基于此，本技术提供一种全酶法从头合成dna的方法，以解决现有技术中成本高，操作复杂的技术问题。
6.本技术的技术方案是提供一种全酶法从头合成dna的方法，所述方法包括：
7.(1)提供固相载体，所述固相载体上固定有起始dna，所述起始dna含有第一粘性末端。
8.(2)提供多聚体dna单元，所述多聚体dna单元包括第二粘性末端、新增碱基对和待识别的dna序列。
9.(3)所述起始dna的第一粘性末端和所述多聚体dna单元的第二粘性末端通过dna连接酶催化反应互补配对连接。
10.(4)将所述待识别dna序列通过酶切形成新的粘性末端。
11.(5)循环操作步骤(2)至步骤(4)，在每个所述新的粘性末端上连接新的多聚体dna单元，直至完成目标dna的合成。
12.在其中一个实施例中，步骤(3)和步骤(4)之间还包括将未参加催化反应的起始dna从所述固相载体上切除。
13.在其中一个实施例中，采用核酸外切酶进行切除。
14.在其中一个实施例中，所述核酸外切酶包含t5核酸外切酶和大肠杆菌外切酶ⅲ中的一种或多种。
15.在其中一个实施例中，所述多聚体dna单元的合成方法包括亚磷酰胺三酯合成法、酶切质粒法和酶切pcr扩增产物法中的一种或多种。
16.在其中一个实施例中，所述多聚体dna单元与所述起始dna为茎环结构；
17.所述多聚体dna单元由一条5’端磷酸化修饰oligo链自身碱基互补形成。
18.在其中一个实施例中，所述新增碱基对的数量为1～5；优选地，新增碱基对的数量为2或3。
19.根据上述的dna合成的方法，步骤(1)中，所述固相载体修饰有羧基，所述起始dna修饰有氨基，所述起始dna通过所述氨基和所述羧基的偶联反应固定在所述载体上；或其他将起始dna与固相载体偶联的方式。
20.在其中一个实施例中，偶联反应的催化剂包括碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺中的一种或者多种。
21.在其中一个实施例中，所述起始dna上设有与所述多聚体dna单元不同的限制性内切酶识别位点，在目标合成完成后，通过酶切释放目标dna。
22.在其中一个实施例中，所述dna连接酶为t4 dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶中的一种或多种。
23.在其中一个实施例中，酶切包括采用限制性内切酶或cas核酸酶；
24.优选地，采用限制性内切酶，所述限制性内切酶为iis型限制性内切酶。
25.进一步地，所述iis限制性内切酶选自bsai、bbsi、btgzi、bsmbi、aari、acc36i、bbvi、bcci、bcodi、bfuai、bsmai、bsmbi、bsmfi、bspmi和bspqi中的一种或多种。
26.本技术提供的全酶法从头合成dna的方法，在合成步骤中只需使用3种常见类型的分子生物学酶、多聚体dna单元、固相载体即可完成合成，仅依靠生物酶催化反应，而不需要任何非酶参与的化学反应的步骤，不需要特殊的场地，原料易制备，具有成本低，合成效率高的特点。
附图说明
27.图1为氨基修饰的起始dna固定到载玻片上的示意图；
28.图2为多聚体dna单元通用样式的示意图；
29.图3为第1号多聚体dna单元样式的示意图；
30.图4为第2号多聚体dna单元样式的示意图；
31.图5为第16号多聚体dna单元样式的示意图；
32.图6为第1024号多聚体dna单元样式的示意图；
33.图7为载体孔板的示意图；
34.图8为表1中多聚体dna单元a1的完整结构示意图；
35.图9为在固相载体的孔位上加入t4 dna连接酶-多聚体dna单元混合体系，进行酶连反应的示意图；
36.图10为t5核酸外切酶，切除未能参与反应的起始dna，使其不能参与到下一轮反应的示意图；
37.图11为加入iis限制性内切酶bspqi进行酶切，产生新的粘性末端的示意图：
38.图12为已合成了2个碱基：aa；此时即可进入第二轮反应的示意图；
39.图13为bsai限制性内切酶进行酶切，释放合成的dna的示意图；
40.图14为从头合成laczα基因时第一段从5
’‑3’
方向合成，形成dna的示意图；
41.图15为从头合成laczα基因时第二段从3
’‑5’
方向合成，形成dna的示意图；
42.图16为从头合成laczα基因时图14第二段dna旋转方向后的示意图；
43.图17为从头合成laczα基因时载体点样矩阵示意图；
44.图18为从头合成laczα基因时合成效果检测电泳图；
45.图19为从头合成laczα基因时扩增产物鉴定电泳图；
46.图20为从头合成laczα基因时测序峰图验证图。
具体实施方式
47.下面结合实施方式和实施例，对本技术作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本技术而不用于限制本技术的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本技术公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本技术内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本技术更为充分地理解，应理解，本技术可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
48.除非另有定义，本技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
49.术语
50.本技术中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
51.本技术中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本技术的技术方案、解决本技术的技术问题、实现本技术预期的技术效果为准。
52.本技术中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本技术保护范围的限制。
53.本技术中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本技术保护范围的限制。
54.本技术中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个的整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
55.本技术中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
56.本技术的技术方案是提供一种全酶法从头合成dna的方法，所述方法包括：
57.(1)提供固相载体，所述固相载体上固定有起始dna，所述起始dna含有第一粘性末端。如图1所示，氨基修饰起始dna，因碱基组合方式无穷尽，无法一一列举，此处仅列举符合生产实际的一组组合。
58.(2)提供多聚体dna单元，所述多聚体dna单元包括第二粘性末端、新增碱基对和待识别dna序列。
59.(3)所述起始dna的第一粘性末端和所述多聚体dna单元的第二粘性末端通过dna连接酶催化反应互补配对连接。
60.(4)将所述待识别dna序列通过酶切形成新的粘性末端。
61.(5)循环操作步骤(2)至步骤(4)，在每个所述新的粘性末端上连接新的多聚体dna单元，直至完成目标dna的合成。
62.在一个具体的示例中，步骤(3)和步骤(4)之间还包括将未参加催化反应的起始dna从所述固相载体上切除；优选使用核酸外切酶进行切除。对于参加过多轮循环的情况，则是将起始dna链(已在之前的循环中延长，但当前循环中，未成功参加催化反应)切除。
63.在一个具体的示例中，所述核酸外切酶包含但不限于t5核酸外切酶和大肠杆菌外切酶ⅲ等具有5
’‑3’
或3
’‑5’
活性的核酸外切酶中的一种或多种。
64.在一个具体的示例中，所述多聚体dna单元的合成方法包括亚磷酰胺三酯合成法、酶切质粒法或酶切pcr扩增产物法。因多聚体dna单元的长度的不同，可以自由选择制备方法。其中优选传统的化学法合成效率高，制备成本低。
65.在一个具体的示例中，多聚体dna单元与所述起始dna为茎环结构；所述多聚体dna单元由一条5’端磷酸化修饰oligo链自身碱基互补形成。
66.在一个具体的示例中，所述新增碱基对的数量为1～5；优选地，新增碱基对的数量为2或3。
67.在一个具体的示例中，步骤(1)中的固相载体可以为羧基修饰的玻璃或羧基磁珠，通过偶联反应固定所述起始dna。例如固相载体修饰有羧基，具有粘性末端的起始dna修饰有氨基，两者通过偶联反应连接，更具体地，所述起始dna为茎环结构，其“环”部修饰有氨基，与固相载体偶联。可以理解，也可以采用其它方式将起始dna与载体相偶联。
68.可选地，偶联反应的催化剂包括碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺中的一种或者多种。
69.下述以化学合成的方法制备多聚体dna单元的一个实例进行描述：
70.多聚体dna单元是：一条5’端磷酸化修饰的oligo dna，然后在室温或低于37℃条件下，通过自身碱基互补配对形成带有粘性末端的dna，多聚体dna单元的通用样式如图2所示，包括粘性末端、新增碱基对和待识别dna序列。
71.其中粘性末端是可变的，可以是单个碱基n(即4种组合：a、t、c、g中的一种)；或2个碱基nn(即16种组合：aa、at、ac、ag、ta、tt、tc、tg、ga、gt、gc、gg、ca、ct、cg、cc)；或3个碱基nnn(即64种组合：aaa、aat、aag、aac......cct、ccg、ccc)；或4个碱基nnnn组合(即256种组合)或更多。
72.其中新增碱基对的数量也是可变的，可以是单个碱基n(即4种组合：a、t、c、g中的一种)；或2个碱基nn(即16种组合：aa、at、ac、ag、ta、tt、tc、tg、ga、gt、gc、gg、ca、ct、cg、
cc)；或3个碱基nnn(即64种组合：aaa、aat、aag、aac......cct、ccg、ccc)；或4个碱基nnnn组合(即256种组合)；此处新增碱基对只体现了一条链的序列，另一条链为互补序列。新增碱基对是用来合成目标dna的，其序列根据目标dna序列来确定。
73.粘性末端和新增碱基对因组合方式太多，只列举最符合实际生产的代表性类型(3个碱基粘性末端nnn+2碱基对的新增碱基nn组合)。其中3碱基粘性末端组合为nnn，新增碱基对末端组合为nn，因此共有4*4*4*4*4＝1024种组合，如：aaaaa、aaaat、aaaag、aaaac......ccccc。
74.其中，待识别dna序列是茎环结构，酶切识别位点位于“茎”部，酶切后所述待识别dna序列会形成新的粘性末端，该粘性末端紧邻上述新增碱基对，用于和下一个循环的多聚体dna单元连接。
75.具体如下：第1号多聚体dna单元如图3所示，第2号多聚体dna单元如图4所示，第16号多聚体dna单元如图5所示，第1024号多聚体dna单元如图6所示。
76.显然合成1024种单体工程量较大，且不利于自动化，因此需要对单体进行适当的组合混合：由于t4 dna连接酶具有保真度，即只有接头部位的碱基完全互补配对才能被连接，因此对于3碱基的粘性末端，其第1位和第3位碱基可以设置为n，而中间位置设置为a/t/c/g中的一种，即：nan、ntn、ngn、ncn四种组合。再与新增碱基n或nn或nnn或nnnn等组合，如：新增单个碱基组合为：a、t、c、g；新增两个碱基：aa、at、ac、ag、ta、tt、tc、tg、ga、gt、gc、gg、ca、ct、cg、cc。
77.具体的，以3个碱基粘性末端，2个新增碱基对进行示例，可以缩减为64种组合，将这64种组合放置在如图7所示的96孔板中，以便于自动化操作。
78.在各孔中放入上述多聚体dna单元，注意，其中的bspqi识别序列及茎环结构未在表1中进行完全描述，其中的a1的完整结构如图8所示，a2则是在a1基础上调整新增碱基对的组合，以此类推，可以知道a3、a4......h8的多聚体dna单元的序列组成和结构。
79.表1
[0080][0081]
理论基础：每一孔中dna浓度设置为1.6μm，则每一种确定的粘性末端的dna分子浓度为10nm，即每孔中每1μl包含有具体的每一个确定的粘性末端的dna分子数量为：6.02*10
10
个分子，即602亿个分子，这相当于1kb的双链dna数量为61.8ng，足量反应。
[0082]
假设起始反应的分子数为10亿个，合成效率限制步骤为：t4 dna酶连和bspqi酶切。根据公知常识记载，t4 dna酶连效率约95％，bspqi酶切效率为99％，则合成一个50bp的dna理论上可以得到2.1亿个分子，合成一个200bp的dna，理论上可以得到205万个分子，均完全足够后续反应(荧光定量pcr扩增灵敏度可以达到500～1000copy/ml，因此完全可以作为模板而用来扩增获得大量全长基因)。
[0083]
对应的，合成如下5’端磷酸化修饰的oligo dna，设计的oligo dna可在低温条件下自身碱基互补配对，形成3碱基粘性末端的多聚体dna单元：
[0084]
孔号序列如表2所示(“p
‑”
表示磷酸化)
[0085]
表2
[0086][0087][0088]
在一个具体的示例中，所述起始dna上设有与所述多聚体dna单元限制性内切酶的识别酶切位点，在目标合成完成后，通过酶切释放目标dna，并携带有粘性末端，方便后续连接载体拼接。
[0089]
在一个具体的示例中，所述dna连接酶为包括但不限于t4 dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶等具有dna连接酶功能的酶中的一种或多种。
[0090]
在其中一个实施例中，酶切包括采用限制性内切酶或cas核酸酶。
[0091]
可选地，采用限制性内切酶，所述内切酶为iis型限制性内切酶。
[0092]
进一步可选地，所述iis限制性内切酶选自包括但不限于bsai、bbsi和bspqi等iis型限制性内切酶中的一种或多种。
[0093]
原理：本技术是提供一种全酶法、模块化从头合成dna的方法，在合成步骤中只需使用3种常见类型的分子生物学酶、多聚体dna单元、固相载体即可完成合成：包括但不限于：
①
dna连接酶或具有连接酶属性的酶，如：t4 dna连接酶、大肠杆菌dna连接酶等；
②
iis
型限制性内切酶，如：bsai、bbsi、bspqi等；
③
核酸外切酶，如：t5核酸外切酶、大肠杆菌外切酶ⅲ等。
[0094]
该方法理论上每个循环中可以通过选用不同的多聚体dna单元来添加1bp或2bp或3bp或4bp或5bp或6bp等1个或多个碱基对。因为是双链合成，因此可以从5
’‑3’
开始合成，也可以从3
’‑5’
开始合成。考虑到实际生产应用，每个循环的反应优选添加2bp，粘性末端优选3bp或4bp。
[0095]
下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本技术而不用于限制本技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本技术中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
[0096]
具体的核心原料制备：耗材(固相载体)：将氨基修饰的起始dna偶联到羧基修饰的玻片上，目前市场上已有商品化羧基功能化载玻片产品，可以购买也可以自制。或其它方式将起始dna偶联。多聚体dna单元采用酶法或化学法合成。
[0097]
目标dna合成步骤：
[0098]
①
在固相载体(已与起始dna偶联)的孔位上加入t4 dna连接酶-多聚体dna单元进行酶连反应，添加待合成的碱基；此步骤即完成新的碱基对添加。
[0099]
②
超纯水洗去t4 dna连接酶体系和未参与反应的多聚体dna单元。
[0100]
③
加入t5核酸外切酶，切除未能参与反应的起始dna，使其不能参与到下一轮反应。
[0101]
④
超纯水洗去t5核酸外切酶体系。
[0102]
⑤
加入iis限制性内切酶bspqi进行酶切，产生新的粘性末端。
[0103]
⑥
超纯水洗去iis限制性内切酶bspqi酶切体系。
[0104]
步骤
⑥
完成后即回到初始状态，可进行第二步反应，重复步骤
①②③④⑤⑥
即可再次添加新的碱基对。
[0105]
因此：3步酶催化反应，6个动作即可添加上新的碱基对。
[0106]
具体合成过程：
[0107]
合成步骤
②
：在固相载体的孔位上加入t4 dna连接酶-多聚体dna单元混合体系，进行酶连反应如图9所示。
[0108]
合成步骤
③
：t5核酸外切酶，切除未能参与反应的起始dna，使其不能参与到下一轮反应，具体示例如图10所示，已经参与反应的起始dna不具有裸漏的5’端，不能被t5核酸外切酶切割而被保留；未能参与反应的起始dna具有裸漏的5’端被t5核酸外切酶切割而被清除，不会参与到下一轮反应，因此不会产生错误的合成。
[0109]
合成步骤
⑤
：加入iis限制性内切酶bspqi进行酶切，产生新的粘性末端如图11所示。超纯水洗涤后，一轮反应结束，可以得知已合成了2个碱基：aa；此时即可进入第二轮反应的步骤
①
，如图12所示。
[0110]
可以理解的是第二轮反应将添加两个碱基对gc，即2轮反应合成了aagc这4个碱基，经过25轮合成后即可获得50bp的双链dna，50轮合成即可获得100bp的双链dna，100轮合成则可获得200bp的双链dna。
[0111]
最后，使用bsai限制性内切酶进行酶切，释放合成的dna，如图13所示，并在5’端形
成4碱基的粘性末端。而其3’端经过bspqi酶切已产生一个3碱基的粘性末端，方便下一步pcr扩增。
[0112]
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差，涉及的试剂均可从商业化途径获得。
[0113]
实施例1
[0114]
以从头合成laczα基因为例进行实施例描述，全长324bp，序列为如seq id no.17所示：
[0115]
atgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatag(seq id no.1)。
[0116]
在载玻片的一个单独的孔位上合成324bp较费时，本技术通过分割成数段后，再通过粘性末端进行酶连组装成全长基因。
[0117]
将324bp分割为大约等长的6段，由于合成工艺的设计，每一段合成的dna释放后，其中一端为4碱基粘性末端，另一端为3碱基粘性末端。
[0118]
第一段：atgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccc(seq id no.2)
[0119]
第二段：ccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaa(seq id no.3)
[0120]
第三段：ggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagc(seq id no.4)
[0121]
第四段：agctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagc(seq id no.5)
[0122]
第五段：cagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggt(seq id no.6)
[0123]
第六段：ggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatag(seq id no.7)
[0124]
第一段从5
’‑3’
方向合成，形成如下dna，其5’端为4碱基粘性末端，3’端为3碱基粘性末端如图14所示。
[0125]
第二段要与第一段dna酶连，因此第二段的5’端必须为3碱基粘性末端，3’端为4碱基粘性末端。因此第二段dna需要从3
’‑5’
方向合成，形成如图15所示的dna，以此和合成6段dna后进行组装。
[0126]
为了方便理解，将上述合成的第二段dna旋转方向，描述为如图16所示的dna，可以理解的是这两段dna是同一个dna，只是描述时选取的方向不一样。同样的，合成6段dna后进行组装。
[0127]
实施例2：起始dna偶联到玻璃片
[0128]
取一块羧基功能化载玻片，在适当位置进行起始dna偶联，制备成4行*12列＝48点
阵。
[0129]
一、配制0.1m mes buffer ph 5.0，25℃。
[0130]
二、使用一中mes buffer将氨基修饰起始dna稀释到10μm。
[0131]
所述起始dna序列为，5
’‑3’
：p-cgagacctgttt(nh2)ggcaggtc，在自身碱基互补配对作用下形成3碱基的粘性末端的颈环结构。
[0132]
三、使用万分之一天平称取10mg edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，加入1ml超纯水溶解，现配现用。
[0133]
四、配制230mm nhs：称取26mg nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)，加入1ml超纯水溶解，现配现用。
[0134]
五、取50μl步骤三中edc，22μl和步骤四中的nhs，再加入928μ步骤二中的起始dna，混匀后立即将混合液点样到载玻片上，形成4行*12列＝48点阵，每个点10μl。放置室温反应4h。
[0135]
实施例3：合成dna
[0136]
多聚体dna单元通过t4酶连到载玻片上的起始dna上。
[0137]
为制备大量的dna以便于后续聚丙烯酰胺凝胶电泳检测合成的产物，本次实验的每一段dna都使用一整块实施例1中制备的玻璃板，即每一段dna合成48孔。在实际生产中，每一段合成一孔即可。
[0138]
1号板的48个点全部合成第一段dna，2号板的48个点全部合成第二段dna，6号板合成第6段dna，以此类推。
[0139]
本次实验使用单通道和8通道移液器手动进行操作。
[0140]
一、配制多聚体dna单元-t4酶连体系如表3所示：
[0141]
表3
[0142]
10
×
t4连接酶buffer100μlt4 dna连接酶100μl多聚体dna单元100μlddh2o700μl
[0143]
不同孔位的多聚体dna单元需要配制不同的反应体系，需要更换多聚体dna单元。可放置-20℃冻存，4℃可放置3天使用而不影响性能。
[0144]
二、配制t5核酸外切酶体系如表4所示：
[0145]
表4
[0146]
10
×
buffer4100μlt5外切酶100μlddh2o800μl
[0147]
三、配制bspqi酶切体系如表5所示：
[0148]
表5
[0149]
10
×
buffer 3.1100μlbspqi内切酶100μlddh2o800μl
[0150]
四、配制bsai酶切体系如表6所示：
[0151]
表6
[0152]
10
×
t4连接酶buffer100μlbsai内切酶100μlddh2o800μl
[0153]
后续可以直接加入t4 dna连接酶进行连接，可放置-20℃冻存，4℃可放置3天使用而不影响性能。
[0154]
五、取10μl多聚体dna单元-t4 dna连接酶酶连体系(即步骤一中所述混合液)到各点阵上，37℃连接5min，如图17所示。图1为含有染料的2
×
dnaloading缓冲液进行点样演示。
[0155]
六、10μl超纯水洗去点阵上的反应体系，吹洗3次。
[0156]
七、取10μlt5核酸外切酶体系到各点阵上，37℃反应5min。
[0157]
八、10μl超纯水洗去点阵上的反应体系，吹洗3次。
[0158]
九、加入bspqi酶切体系10μl，37℃酶切5min，形成新的粘性末端。
[0159]
十、重复步骤五、六、七、八、九。
[0160]
十一、在各点位上加入bsai酶切体系10μl，37℃切割10min，释放dna；
[0161]
十二、洗脱的dna不需要纯化直接酶连：6块玻璃板上合成的dna，各取2μl合并于0.2ml pcr管中，再加入1μl t4 dna连接酶混匀，共13μl体系，放置pcr仪中37℃连接4h形成全长的完整的目标基因：laczα基因。
[0162]
合成效果检测：分别对每一块玻璃板上的dna进行合并，80℃水浴锅中水浴热失活20min。自然降温后使用dna真空离心浓缩仪浓缩到约25μl，加入5μl 6
×
dnaloading buffer混匀，使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定，结果如图18所示。
[0163]
实施例4：扩增目标基因：
[0164]
使用热启动pcr mix对目标基因进行扩增：
[0165]
合成引物f：atgaccatgattacgccaagc(seq id no.8)
[0166]
合成引物r：ctatgcggcatcagagcagat(seq id no.9)
[0167]
扩增体系如表7所示：
[0168]
表7
[0169]2×
tsingke master mix25μl引物f2μl引物r2μl步骤十二中的连接产物1μlddh2o20μl
[0170]
pcr程序如表8所示：
[0171]
表8
[0172][0173]
取10μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图19所示，结果显示条带大小符合预期，对剩余的pcr产物使用首尾引物进行一代测序，如图20所示，峰图可以完全比对上。
[0174]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，便于具体和详细地理解本技术的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。此外应理解，在阅读了本技术的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本技术作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本技术提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本技术所附权利要求的保护范围内。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供固相载体，所述固相载体上固定有起始dna，所述起始dna含有第一粘性末端；(2)提供多聚体dna单元，所述多聚体dna单元包括第二粘性末端、新增碱基对和待识别dna序列；(3)所述起始dna的第一粘性末端和所述多聚体dna单元的第二粘性末端通过dna连接酶催化反应互补配对连接；(4)将所述待识别dna序列通过酶切形成新的粘性末端；(5)循环操作步骤(2)至步骤(4)，在每个所述新的粘性末端上连接新的多聚体dna单元，直至完成目标dna的合成。2.根据权利要求1所述的全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)之间还包括将未参加催化反应的起始dna从所述固相载体上切除；优选地，采用核酸外切酶进行切除；进一步地，所述核酸外切酶包含t5核酸外切酶和大肠杆菌外切酶ⅲ中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，所述多聚体dna单元的合成方法包括亚磷酰胺三酯合成法、酶切质粒法和酶切pcr扩增产物法中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，所述多聚体dna单元与所述起始dna为茎环结构；优选地，所述多聚体dna单元由一条5’端磷酸化修饰oligo链自身碱基互补形成。5.根据权利要求1所述的全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，所述新增碱基对的数量为1～5；优选地，新增碱基对的数量为2或3。6.根据权利要求1所述的全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固相载体修饰有羧基，所述起始dna修饰有氨基，所述起始dna通过所述氨基和所述羧基的偶联反应固定在所述载体上；或其他将起始dna与固相载体偶联的方式。7.根据权利要求6所述的全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，偶联反应的催化剂包括碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺中的一种或者多种。8.根据权利要求1～7任一项所述的全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，所述起始dna上设有与所述多聚体dna单元不同的限制性内切酶识别位点，在目标合成完成后，通过酶切释放目标dna。9.根据权利要求1～7任一项所述的全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，所述dna连接酶为t4 dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶中的一种或多种。10.根据权利要求1～7任一项所述的全酶法从头合成dna的方法，其特征在于，酶切包括采用限制性内切酶或cas核酸酶；优选地，采用限制性内切酶，所述限制性内切酶为iis型限制性内切酶；进一步地，所述iis限制性内切酶选自bsai、bbsi、btgzi、bsmbi、aari、acc36i、bbvi、bcci、bcodi、bfuai、bsmai、bsmbi、bsmfi、bspmi和bspqi中的一种或多种。

技术总结
本申请属于分子生物学领域，具体提供一种全酶法从头合成DNA的方法，本申请所提供的全酶法从头合成DNA的方法在合成步骤中只需使用3种常见类型的分子生物学酶、多聚体DNA单元、固相载体即可完成合成，仅依靠生物酶催化反应，而不需要任何非酶参与的化学反应的步骤，不需要特殊的场地，原料易制备，从而解决现有技术中成本高，操作复杂的技术问题，具有成本低，合成效率高的特点。合成效率高的特点。合成效率高的特点。


技术研发人员：肖晓文 赵春德 王早霞
受保护的技术使用者：北京擎科生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/8/14