融合蛋白LbtA5及其在制备恶性黑色素瘤药物中的应用

融合蛋白lbta5及其在制备恶性黑色素瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及融合蛋白lbta5及其在制备恶性黑色素瘤药物中的应用。


背景技术：

2.肿瘤的死亡率一直居高不下，世界每年死于癌症的约有600万人，在总死亡人数中占四分之一，更是我国的高发疾病之一。据统计，到2021年，全球有996万人死于癌症之手。癌症严重威胁人类生存，恶性肿瘤如今依旧是医学领域难以征服的高地。
3.恶性黑色素瘤(malignant melanoma，mm)是一种极其恶性的肿瘤，源于恶性化的黑色素细胞，是最为致命的皮肤癌之一，占到肿瘤发生的3％。在美国常见癌症诊断中，mm排名第五，有2万新增病例发生在中国。即使mm的5年相对存活率高达92％，但对于局部病变和转移的mm，其5年存活率仅为65％和25％；而发生转移的黑色素瘤患者高达4.3％。
4.综合疗法如手术切除、化疗、放疗等，是恶性黑色素瘤常用的治疗方法。然而事实上，黑色素瘤5年生存率并未达到理想水平。由于mm具有化学耐药性和快速转移性，最常用的化疗方案也未能显著提高转移性黑色素瘤患者的总生存率。黑色素瘤中晚期患者对放射治疗不敏感，并且会加重肌体不良反应，所以放疗仅能作为辅助治疗手段。因此，在黑色素瘤中晚期，化学疗法是唯一选择。但不幸的是，黑色素瘤药物的研发长期以来一直处于停滞不前的状态。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供融合蛋白lbta5及其在制备恶性黑色素瘤药物中的应用。
6.本发明保护一种融合蛋白，命名为融合蛋白lbta5，包括如下两个区段：膜联蛋白a5和lebestatin。
7.膜联蛋白a5(annexin a5)，用anv表示。
8.lebestatin(lbt)：具有41个氨基酸的小肽，是整合素α1β1的受体拮抗剂。
9.具体的，所述融合蛋白中自n端至c端，依次包括如下两个区段：lebestatin和膜联蛋白a5。
10.具体的，膜联蛋白a5如seq id no：1中第46-364位所示。
11.具体的，lebestatin如seq id no：1中第1-41位所示。
12.具体的，所述融合蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
13.(a1)seq id no：1所示的蛋白质；
14.(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
15.(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
16.具体的，所述融合蛋白如seq id no：3所示。
17.具体的，所述融合蛋白如seq id no：4所示。
18.本发明还保护以上任一所述融合蛋白在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的应用。
19.本发明还保护以上任一所述融合蛋白在制备针对黑色素瘤细胞的增殖抑制剂和/或迁移抑制剂中的应用。
20.本发明还保护以上任一所述融合蛋白在制备用于抑制黑色素瘤肿瘤组织中的血管增生的药物中的应用。
21.本发明还保护一种用于治疗黑色素瘤的药物，其活性成分包括以上任一所述融合蛋白。
22.本发明还保护一种针对黑色素瘤细胞的增殖抑制剂和/或迁移抑制剂，其活性成分包括以上任一所述融合蛋白。
23.本发明还保护一种用于抑制黑色素瘤肿瘤组织中的血管增生的药物，其活性成分包括以上任一所述融合蛋白。
24.以上任一所述黑色素瘤为恶性黑色素瘤。
25.以上任一所述黑色素瘤细胞为恶性黑色素瘤细胞。
26.实施例2的结果表明：外源添加单独的anv对于ht29细胞与配体ln结合、pc12细胞与配体col
‑ⅳ
结合无显著影响；融合了anv的重组蛋白lbta5对于ht29细胞粘附ln无影响，但对于pc12细胞粘附col
‑ⅳ
依然和lbt一样具有较强的细胞粘附抑制性；证明了lbta5并未改变lbt的细胞粘附抑制效应，有效保留了lbt对整合素α1β1特异性结合能力，这对于lbta5展示复合生物学功能具有重要意义，也对研究新型的抗肿瘤药物提供了新思路。
27.实施例3的结果表明：(1)mtt实验结果表明：lbta5及anv均有抑制b16-f10细胞增殖的活性，且呈时间和剂量依赖性；但从时间角度讲，lbta5的抑制效果在24h时便表现明显，48h有极显著抑制性，而anv在48h时也表现出了一定的抑制作用；(2)在对b16-f10细胞进行形态学观察时发现，经不同浓度lbta5及anv处理后，细胞形态未发生显著变化，结合流式检测结果表明，lbta5和anv并未诱导体外培养b16-f10细胞凋亡；(3)划痕实验表明：一定浓度的lbta5和anv可有效抑制体外培养b16-f10细胞的迁移，当蛋白浓度为1nm时，lbta5抑制细胞迁移效果较anv有显著提高。
28.实施例4的结果表明：(1)给药期间小鼠体重稳定上升，生活状态良好，说明了药物具有较低的毒副作用；(2)与阴性对照组小鼠相比，注射目的蛋白干预下的小鼠肿瘤生长受到一定的抑制，lbta5组的抑制效果始终优于anv组，这说明融合蛋白lbta5比anv有着更强的抗肿瘤效应；(3)利用he染色进行组织学观察，阴性对照组肿瘤细胞排列致密整齐，而经药物处理的肿瘤组织中细胞松散，且坏死区域胞核消失，甚至成破碎的细胞碎片，随着药物浓度翻倍，这种现象更加明显；lbta5相较anv有更强的破坏肿瘤组织的作用；(4)使用lbta5和anv治疗的小鼠肿瘤组织中，血管密度明显降低，且呈剂量依赖性；经lbta5治疗的小鼠肿瘤组织中未见明显血管，说明lbta5较anv在抑制血管生成方面有更明显的作用。
29.实施例5的结果表明：阴性对照组的组织切片未见绿色荧光，而注射了荧光素标记蛋白的组织切片出现绿色荧光，且荧光密度和强度呈现剂量依赖性，当达到一定注射量时，lbta5靶向肿瘤组织的作用增强，强于anv。这为目的蛋白作用于肿瘤组织提供了直接证据，推测可能是通过有效抑制小鼠黑色素瘤肿瘤组织中的血管增生方式，发挥拮抗黑色素瘤肿瘤的生物学效应。
30.本发明对于恶性黑色素瘤治疗药物的开发具有重大价值。
附图说明
31.图1为实施例1中lbta5重组菌制备gst-lbta5蛋白溶液的过程中样本1至样本5的12％ sds-page蛋白电泳图。
32.图2为实施例1中anv重组菌制备gst-anv蛋白溶液的过程中样本1至样本5的12％ sds-page蛋白电泳图。
33.图3为实施例1中lbta5蛋白溶液制备过程中的12％ sds-page蛋白电泳图。
34.图4为实施例1中anv蛋白溶液制备过程中的12％ sds-page蛋白电泳图。
35.图5为实施例2的步骤二中处理后细胞在37℃、5％ co2条件下培养24h后，用普通光学显微镜在100倍拍摄的照片(ht29细胞粘附ln)。
36.图6为实施例2的步骤二中600nm处od值结果(ht29细胞粘附ln)。
37.图7为实施例2的步骤三中处理后细胞在37℃、5％ co2条件下培养24h后，用普通光学显微镜在100倍拍摄的照片(pc12细胞粘附col
‑ⅳ
)。
38.图8为实施例2的步骤三中600nm处od值结果(pc12细胞粘附col
‑ⅳ
)。
39.图9为实施例3中mtt法测定蛋白对b16-f10细胞增殖的影响的结果。
40.图10为实施例3中蛋白对细胞形态学影响的观察照片。
41.图11为实施例3中蛋白对b16-f10细胞凋亡的影响的结果(anv处理b16-f10细胞24h后的流式分析图)。
42.图12为实施例3中蛋白对b16-f10细胞凋亡的影响的结果(lbta5处理b16-f10细胞24h后的流式分析图)。
43.图13为实施例3中蛋白对b16-f10细胞迁移的影响的结果。
44.图14为实施例4中小鼠体重变化的结果。
45.图15为实施例4中小鼠肿瘤大小变化的结果。
46.图16为实施例4中肿瘤组织he染色的照片。
47.图17为实施例4中免疫组化检测lbta5对肿瘤血管生成的影响的结果照片。
48.图18为实施例5中倒置荧光显微镜在100倍下观察拍摄荧光分布的照片。
具体实施方式
49.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
50.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，细胞的培养条件均为：37℃，5％ co2。胶原蛋白ⅳ(col-iv)：sigma。层粘连蛋白(ln)：sigma。pc12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)、ht29细胞(人结肠癌细胞)、b16-f10细胞(小鼠黑色素瘤细胞)：均为北京鼎国昌盛生物技术有限公司产品。dmem培养基：中科迈晨科技有限公司。pp酶(带有gst标签)：上海碧云天生物技术有限公司，产品编号为p2303；pp酶特异识别短肽leu-glu-val-leu-phe-gln/gly-pro中的gin和gly残基而进行切割，从而去除蛋白中的gst标签。每1000ml tm表达培养基的组成：
tryptone 12g、yeast extract24g、nacl 10g、50％甘油9.3ml、1mol/l tris溶液12ml，用蒸馏水定容至1000ml。
51.实施例1、lbta5蛋白和anv蛋白的制备
52.一、构建重组质粒
53.pjj-lbta5重组质粒：用seq id no：2所示的双链dna分子取代pgex-6p-1载体中bamhⅰ和xhoⅰ酶切识别序列之间的小片段，得到pjj-lbta5重组质粒(6061bp)。seq id no：2所示的双链dna分子(命名为lebestatin-annexina5基因)编码seq idno：1所示的蛋白质(命名为lebestatin-annexina5蛋白，简称为lbta5蛋白)。seq id no：1中，第1至41位氨基酸残基组成lebestatin(lbt)，第42-45位氨基酸残基组成连接肽，第46-364位氨基酸残基组成annexin a5。
54.pjj-anv重组质粒：用seq id no：2中第136-1095位所示的双链dna分子取代pgex-6p-1载体中bamhⅰ和xhoⅰ酶切识别序列之间的小片段，得到pjj-anv重组质粒(5926bp)。seq id no：2中第136-1095位所示的双链dna分子(命名为anv基因)编码seq id no：1中第46-364位氨基酸残基组成annexin a5(命名为anv蛋白)。
55.二、制备重组菌
56.将pjj-lbta5重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)，得到lbta5重组菌。
57.将pjj-anv重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)，得到anv重组菌。
58.三、制备并纯化gst-lbta5蛋白和gst-anv蛋白
59.1、挑取重组菌(lbta5重组菌或anv重组菌)单菌落，接种到含50μg/ml氨苄青霉素的液体lb培养基，37℃、190rpm振荡培养12h。
60.2、完成步骤1后，将菌液以1％接种量接种至1l含50μg/ml氨苄青霉素的tm表达培养基，37℃、190rpm振荡培养至od
600nm
值达到0.6左右(此时取样作为样本1)。
61.3、完成步骤2后，在体系中加入iptg并使其在体系中的浓度为100μmol/l，25℃、190rpm振荡培养12h。
62.4、完成步骤3后，6000rpm离心15min，弃除上清，收集菌体沉淀。
63.5、gst亲和层析法纯化gst-lbta5蛋白和gst-anv蛋白
64.(1)样品处理：称2g步骤4获得的菌体沉淀，用30ml pbs缓冲液重悬，在冰上超声破碎(超声条件：功率600w，每循环超3s停27s，共50个循环)(此时取样作为样本2)，然后4℃、12000rpm离心15min(上清液取样作为样本3，沉淀取样作为样本4)，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。
65.(2)装柱：将6ml层析柱固定在铁架台上，保持垂直，吸取6ml介质混合液沿柱壁缓缓加入柱中，静置待介质自然沉降。介质混合液即glutathione sepharose
tm 4b，美国cytiv。
66.(3)平衡：用pbs缓冲液至少平衡20个柱体积，流速1ml/min，调节紫外检测仪读数为零。
67.(4)上样：步骤(1)得到的滤液缓缓加入柱中，流速0.5ml/min，收集上样流穿。
68.(5)洗杂：用pbs缓冲液洗涤柱子以去除未结合蛋白，流速1ml/min，直到检测仪示数不变。
69.(6)洗脱：用10mm gsh溶液洗脱柱子，流速0.5ml/min,收集洗脱峰，直到检测仪示
数不变。10mm gsh溶液：每0.15g gsh溶于50ml pbs缓冲液。
70.(7)重复步骤(3)至(6)，将步骤(4)中收集的上样流穿二次过柱，提高蛋白纯化得率。
71.(8)浓缩：将收集的洗脱液(洗脱峰对应的过柱后溶液)置于截留量为30kd的超滤管中，5000rpm超滤10-15min，并用pbs缓冲液置换体系，收集浓缩后的蛋白溶液(取样作为样本5)，于-20℃保存待用。
72.lbta5重组菌通过上述步骤得到的浓缩蛋白溶液，命名为gst-lbta5蛋白溶液。lbta5重组菌进行上述步骤2至5时，得到的样本1至样本5的12％ sds-page蛋白电泳图见图1，泳道1至泳道5依次对应样本1至样本5。目的蛋白大量存在于上清蛋白和全蛋白中，菌体沉淀中存在较少，经过亲和层析纯化得到纯度为96％、大小符合gst-lbta5蛋白理论值的目的蛋白。
73.anv重组菌通过上述步骤得到的浓缩蛋白溶液，命名为gst-anv蛋白溶液。anv重组菌进行上述步骤2至5时，得到的样本1至样本5的12％ sds-page蛋白电泳图见图2，泳道1至泳道5依次对应样本1至样本5。说明目的蛋白大量存在于上清蛋白和全蛋白中，菌体沉淀中存在极少，经过亲和层析纯化得到纯度为95％、大小符合gst-anv蛋白理论值的目的蛋白。
74.四、制备并纯化lbta5蛋白和anv蛋白
75.1、pp酶切
76.在gst-lbta5蛋白溶液中加入pp酶(pp酶与gst-lbta5的摩尔比为1：600)，4℃酶切过夜。
77.在gst-anv蛋白溶液中加入pp酶(pp酶与gst-anv的摩尔比为1：800)，4℃酶切过夜。
78.2、lbta5蛋白和anv蛋白的纯化
79.(1)平衡：用1
×
pbs缓冲液平衡层析柱(填充介质为glutathione sepharose
tm
4b)，流速1ml/min，调节紫外检测仪读数为零。
80.(2)穿透：将步骤1的酶切产物以流速0.5ml/min加入柱子，然后用pbs缓冲液洗涤柱子，收集穿透液。
81.(3)浓缩：将收集的穿透液置于截留量为10kd的超滤管中，5000rpm超滤半小时，收集浓缩后的蛋白溶液，保存于-20℃。
82.gst-lbta5蛋白溶液的酶切产物进行步骤2得到的浓缩后蛋白溶液，命名为lbta5蛋白溶液。lbta5蛋白溶液制备过程中的12％ sds-page蛋白电泳图见图3，泳道1至泳道3依次对应gst-lbta5蛋白溶液、gst-lbta5蛋白溶液酶切2小时的取样样本、lbta5蛋白溶液。得到了纯度为98％以上、符合理论值的lbta5蛋白。
83.gst-anv蛋白溶液的酶切产物进行步骤2得到的浓缩后蛋白溶液，命名为anv蛋白溶液。anv蛋白溶液制备过程中的12％ sds-page蛋白电泳图见图4，泳道1至泳道3依次对应gst-anv蛋白溶液、gst-anv蛋白溶液酶切2小时的取样样本、anv蛋白溶液。得到了纯度为98％以上、符合理论值的anv蛋白。
84.实施例2、细胞粘附实验
85.一、lbt蛋白的制备
86.1、构建重组质粒
87.用双链dna分子(seq id no：2中第1-123位核苷酸末端加上终止密码子taa)取代pgex-6p-1载体中bamhⅰ和xhoⅰ酶切识别序列之间的小片段，得到重组质粒。
88.2、制备重组菌
89.将步骤1构建的重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌。
90.3、制备并纯化gst-lbt蛋白
91.用步骤2制备的重组菌进行替换，其他同实施例1的步骤三，得到gst-lbt蛋白溶液。
92.4、制备并纯化lbt蛋白
93.用gst-lbt蛋白溶液按照实施例1的步骤四的方法操作，得到lbt蛋白溶液。
94.二、ht29细胞粘附ln
95.1、取96孔板，试验孔和阳性对照孔加入50μg/ml层粘连蛋白溶液(40μl/孔)，阴性对照孔不加入任何溶液，4℃包被12h。
96.2、完成步骤1后弃除上清，加入1％bsa溶液(100μl/孔),封闭1h，然后用pbs缓冲液洗涤2次。
97.3、在1.5ml ep管中，将ht29细胞和供试蛋白共孵育1h。
98.供试蛋白即lbt蛋白(由步骤一制备的lbt蛋白溶液提供)、lbta5蛋白(由实施例1制备的lbta5蛋白溶液提供)提供或anv蛋白(由实施例1制备的anv蛋白溶液提供)。
99.每管5
×
104个ht29细胞。设置如下不同的试验组共孵育体系：
100.lbt蛋白，设置四个浓度，即0.01nm、0.1nm、1nm、10nm；
101.lbta5蛋白，设置四个浓度，即0.01nm、0.1nm、1nm、10nm；
102.anv蛋白，设置四个浓度，即0.01nm、0.1nm、1nm、10nm。
103.设置用10nm bsa代替供试蛋白的对照孵育体系。
104.4、取完成步骤2的96孔板，试验孔加入完成步骤3试验组共孵育体系，阴性对照孔和阳性对照孔加入完成步骤3的对照孵育体系，37℃培养1h。
105.5、完成步骤4后，弃除上清，用pbs缓冲液洗涤2次，洗去未粘附细胞。
106.6、完成步骤5后，加入4％多聚甲醛(60μl/孔)，固定10min，然后用pbs缓冲液洗涤2次。
107.7、完成步骤6后，加入0.1％结晶紫(60μl/孔)，染色10min，然后用pbs缓冲液洗涤4次。
108.8、完成步骤7后，加入1％ sds(100μl/孔)，充分裂解细胞，用酶标仪在600nm处测定吸光值。
109.ht29细胞能表达α
ⅴ
β5、α
ⅴ
β6和α6β4等整合素，其中α6β4能特异性结合层粘连蛋白(ln)，进而促进细胞粘附。设置阴性对照孔和阳性对照孔，试验孔分别添加不同浓度的lbt、lbta5和anv，观察细胞粘附的情况如图5所示(处理后细胞在37℃、5％co2条件下培养24h后，用普通光学显微镜在100倍拍摄的照片)。图5中，自左至右依次对应阴性对照孔、阳性对照孔、试验孔(供试蛋白浓度自低至高)。在显微镜下可见圆形ht29细胞，随着实验组浓度的增加，与配体蛋白结合的细胞数目保持恒定，未见明显变化。600nm处od值结果见图6(使用单因素方差分析，mean
±
sd，n＝6，ns为p＞0.05，均与control相比；control与control+ln相比，***p＜0.001)。结果显示，用配体蛋白ln包被后，粘附细胞的量显著增加。在分别添加
了不同浓度的lbt、lbta5、anv后，细胞数目虽有下降，但整体并无显著变化，表明这三种蛋白并不能抑制ht29细胞与配体ln结合，lbt不是ht29所表达整合素的特异性拮抗剂。
110.三、pc12细胞粘附col
‑ⅳ
111.1、取96孔板，试验孔和阳性对照孔加入10μg/ml胶原蛋白ⅳ(40μl/孔)，阴性对照孔不加入任何溶液，4℃包被12h。
112.细胞采用pc12细胞。其他同步骤二。
113.pc12细胞能大量表达整合素α1β1，是ⅳ型胶原蛋白(col
‑ⅳ
)的特异性受体。设置阴性对照孔和阳性对照孔，试验孔分别添加不同浓度的lbt、lbta5和anv，观察细胞粘附的情况如图7所示(处理后细胞在37℃、5％ co2条件下培养24h后，用普通光学显微镜在100倍拍摄的照片)。图7中，自左至右依次对应阴性对照孔、阳性对照孔、试验孔(供试蛋白浓度自低至高)。在显微镜下可见，无配体蛋白包被的孔板内几乎没有粘附的细胞，而用col
‑ⅳ
包被过夜后，pc12可与其粘附成梭形分布，数量显著增加。酶标仪检测600nm处od值结果见图8(使用单因素方差分析，mean
±
sd，n＝6，*p＜0.05，***p＜0.001，均与control相比；control与control+ln相比，***p＜0.001)。结果均表明，添加0.01nm的lbt和lbta5细胞数目无显著变化，而添加0.1nm、1nm、10nm的lbt和lbta5均表现出了强烈的细胞粘附抑制效应。而单独添加anv后，细胞数目未见明显改变。这说明去整合素lbt可以通过竞争性结合整合素α1β1从而抑制其与配体col
‑ⅳ
的结合，融合蛋白仍然具备这样的特性，而anv没有该性质。
114.实施例3、lbta5对b16-f10细胞的抑制作用
115.lbta5蛋白由实施例1制备的lbta5蛋白溶液提供。
116.anv蛋白由实施例1制备的anv蛋白溶液提供。
117.一、mtt法测定lbta5蛋白和anv蛋白对b16-f10细胞增殖的影响
118.1、收集对数期b16-f10细胞，按2000个/孔接种到96孔板，孵育过夜，目的是细胞贴壁。
119.2、完成步骤1后，弃除培养上清，分成7组(3组anv药物组、3组lbta5药物组和1组对照组)，每组6个复孔。anv药物组加入含anv蛋白的dmem培养基，100μl/孔；三个药物组采用的anv蛋白浓度别为0.1nm anv、1nm anv、10nm anv。lbta5药物组加入含lbta5蛋白的dmem培养基，100μl/孔；三个药物组采用的lbta5蛋白浓度别为0.1nm lbta5、1nm lbta5、10nm lbta5。对照组(control)加入dmem培养基，100μl/孔。
120.3、完成步骤2后，培养24h或48h，然后每孔加10μl mtt溶液，继续培养4h。
121.4、完成步骤3后，吸出孔内全部溶液，每孔加100μl dmso，反应30min。
122.5、完成步骤4后，采用酶标仪检测570nm处各孔od值。
123.细胞活力＝药物孔的od值平均值/对照孔的od值平均值。
124.结果见图9(使用单因素方差分析，mean
±
sem，n＝6，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001与control相比或组间比较)。图9中：a：同一实验组不同时间的抑制效果；b：同一时间不同实验组的抑制效果。用不同浓度anv处理细胞24h后，细胞活力暂时性增加，而48h后呈剂量依赖的下降趋势。用不同浓度的lbta5处理细胞24h和48h后，细胞活力逐渐下降，且与对照组相比，48h细胞活力的降低具有显著性差异。结果显示，lbta5和anv在48h时均能抑制细胞活力，且均呈现剂量依赖性。其中相同浓度lbta5的抑制效果较anv有极
显著差异，且随lbta5浓度增加，细胞活力也显著下降。
125.二、细胞形态学观察
126.1、收集对数期b16-f10细胞，按4
×
105个/孔接种到六孔板，孵育过夜，目的是细胞贴壁。
127.2、完成步骤1后，弃除培养上清，分成3组，每组6个复孔。anv药物组加入含10nm anv蛋白的dmem培养基(2ml/孔)，lbta5药物组加入含10nm lbta5蛋白的dmem培养基(2ml/孔)，对照组(control)加入dmem培养基(2ml/孔)。孵育0时刻，用倒置显微镜观察形态。
128.3、完成步骤2后，培养24h，用倒置显微镜观察形态。
129.用倒置显微镜在100倍下观察拍摄的照片见图10。对照组和实验组细胞均能贴壁生长，轮廓清楚，具有较好折光性，因此判断lbta5在一定浓度范围对b16-f10细胞的形态无明显影响。
130.三、检测lbta5和anv对b16-f10细胞凋亡的影响
131.1、收集对数期b16-f10细胞，按4
×
105个/孔接种到六孔板，孵育过夜，目的使细胞贴壁。
132.2、完成步骤1后，弃除培养上清，分成7组(3组anv药物组、3组lbta5药物组、1组阴性对照组)，每组6个复孔。anv药物组加入含anv蛋白的dmem培养基，2ml/孔；三个药物组采用的anv蛋白浓度别为0.1nm anv、1nm anv、10nm anv。lbta5药物组加入含lbta5蛋白的dmem培养基，2ml/孔；三个药物组采用的lbta5蛋白浓度别为0.1nm lbta5、1nm lbta5、10nm lbta5。阴性对照组(control)加入dmem培养基，2ml/孔。
133.3、完成步骤2后，培养24h，然后收集孔内全部液相体系，连同消化后的细胞一起，放在离心管内，800rpm离心5min，用pbs缓冲液清洗两次，每孔细胞加500μlbinding buffer重悬，用200目尼龙膜过滤。
134.4、染色。
135.单染管中加5μl annexin v染料或pi染料，双染管同时加5μl annexin v染料和pi染料。
136.5、避光反应15min，用流式细胞仪检测凋亡状况。
137.anv处理b16-f10细胞24h后的流式分析图见图11。lbta5处理b16-f10细胞24h后的流式分析图见12。阴性对照组细胞凋亡率仅为2.03％，经过不同浓度anv处理24h后的b16-f10细胞凋亡率变化幅度小且无规律，而不同浓度lbta5处理24h后的b16-f10细胞虽然随着浓度增加，凋亡率有所增加，但无显著差异，证明anv和lbta5不会明显诱导b16-f10细胞的凋亡。
138.四、lbta5和anv对b16-f10细胞迁移的影响
139.1、取对数期b16-f10细胞，按每孔6
×
105个/孔接种到六孔板，培养至汇合度达90％左右。
140.2、完成步骤1后，弃去上层液体，用pbs清洗孔底，在六孔板背面画平行线，用洁净枪头垂直划线，用pbs缓冲液轻轻洗掉脱落细胞。
141.3、完成步骤3后，分成7组(3组anv药物组、3组lbta5药物组和1组对照组)，每组6个复孔。anv药物组加入含anv蛋白的dmem培养基，2ml/孔；三个药物组采用的anv蛋白浓度别为0.1nm anv、1nm anv、10nm anv。lbta5药物组加入含lbta5蛋白的dmem培养基，2ml/孔；三
个药物组采用的lbta5蛋白浓度别为0.1nm lbta5、1nm lbta5、10nm lbta5。对照组(control)加入dmem培养基，2ml/孔。
142.4、完成步骤2后，培养24h，观察划痕愈合情况，拍照并分析划痕区域面积。
143.用倒置显微镜在100倍下观察拍摄的照片见图13的a)和b)。24h后，没有经过蛋白处理的细胞划痕较窄，随着实验组蛋白浓度的提升，划痕愈合情况越来越差。
144.用image j分析24h划痕区域面积变化(使用单因素方差分析，mean
±
sd，n＝3，***p＜0.001，与0h相比或组间比较)，结果见图13的c)。对照组细胞迁移率为50％，当蛋白浓度为1nm时，lbta5抑制细胞迁移效果较anv有显著提高。细胞划痕实验充分说明，anv和lbta5都有很明显的抑制黑色素瘤细胞迁移的作用，一定浓度lbta5处理后的细胞迁移率显著性低于anv处理。
145.实施例4、lbta5对黑色素瘤的作用效应
146.lbta5蛋白由实施例1制备的lbta5蛋白溶液。
147.anv蛋白由实施例1制备的anv蛋白溶液提供。
148.小鼠室温25℃饲养，自由进食饮水。
149.一、荷瘤小鼠模型的建立
150.1、c57bl/6j小鼠(雌性，7周龄，18-20g)适应性饲养一周。
151.2、将状态良好、处于对数期b16-f10细胞制备成4
×
106个/ml的细胞悬液，剃毛器除去小鼠右后肢背部部分毛发，用1ml注射器在该部位皮下注射100μl细胞悬液，即每只小鼠按4
×
105个细胞的接种量进行建模。然后正常饲养。
152.在饲养过程中，c57bl/6j小鼠均能正常进食和饮水。在接种第7天时，可以看到裸露的皮肤上出现肉眼可见的黑色斑点，表面平滑无凸起。在接种10-12天时，肿瘤呈现快速增长，肿块明显可见，有可触及的凸起，肿块表面或光滑透亮，或可见丰富的血管网，或有撕裂结痂样。此时黑色素瘤小鼠模型成功建立。
153.二、分组给药
154.将建模成功的小鼠随机分成六组，每组5只，打耳标标记。
155.阴性对照组(pbs，control)：每天注射一次无菌pbs缓冲液；
156.阳性对照组(dtic)：每天注射一次dtic，单次剂量为40mg/kg体重；
157.anv低剂量组：每天注射一次anv，单次剂量为139μmol/kg体重；
158.anv高剂量组：每天注射一次anv，单次剂量为278μmol/kg体重；
159.lbta5低剂量组：每天注射一次lbta5，单次剂量为139μmol/kg体重；
160.lbta5高剂量组：每天腹腔注射一次lbta5，单次剂量为278μmol/kg体重。
161.注射方式均为腹腔注射。
162.连续给药13天，期间每天进行观察拍照，用游标卡尺测量小鼠肿瘤大小。
163.三、相关指标的检测
164.1、体重指标
165.小鼠体重变化的结果(使用mean
±
sd统计学分析方法，n＝5)见图14。给药结束后，各组小鼠的体重相较最初均有增加，且小鼠生长状态良好。pbs组、anv组和低浓度lbta5组小鼠体重增长较快，说明生理毒性较弱，而高浓度lbta5组和dtic组小鼠平均体重增长最少,说明可能具有少量的生理毒性。
166.2、肿瘤大小指标
167.小鼠肿瘤大小变化的结果(使用mean
±
sd统计学分析方法，n＝5)见图15。给药结束后统计，pbs组肿瘤生长的趋势最强，dtic组肿瘤生长趋势最平缓，各药物组均在一定程度上抑制了肿瘤生长。同一浓度lbta5的抑制作用强于anv，且高浓度比低浓度抑制效果好。结果表明，anv对抑制肿瘤生长起到了一定作用，而融合了lbt之后的lbta5抑制黑色素瘤的效果增强，表现为肿瘤增长趋于平稳。
168.3、肿瘤组织he染色
169.(1)完成最后一次给药后，完整剖出小鼠肿瘤组织。
170.(2)取肿瘤组织，依次进行如下：
①
固定：完整剖出小鼠肿瘤组织，用4％多聚甲醛浸泡，4℃固定过夜，然后修剪成适当大小放在包埋盒里；
②
梯度脱水：组织依次浸泡在50％、70％、80％、95％的乙醇、无水乙醇中，在摇床上脱水，每次2h；
③
透明：组织浸泡于二甲苯，30min后更换，继续透明30min。
④
浸蜡：组织浸于融化石蜡，60℃持续1h，更换一次后浸泡过夜；
⑤
包埋：将组织取出，用石蜡包埋机包埋。
171.(3)取石蜡组织块，依次进行如下：
①
切片：组织用石蜡切片机切5μm薄片，60℃烘烤1h；
②
脱腊：切片浸于二甲苯，10min，重复两次；
③
复水：先用无水乙醇浸5min，重复两次，然后依次浸于95％、90％、80％、70％乙醇中，各5min，最后蒸馏水洗30s；
④
染色：先苏木精染6min，蒸馏水洗15s；1％盐酸乙醇分化10s；最后伊红染5min，蒸馏水洗15s；
⑤
脱水：切片依次浸于80％乙醇、90％乙醇中，各5min，接着用无水乙醇浸泡10min，重复两次，最后二甲苯透明5min，重复两次；
⑥
封片：切片边缘滴加中性树脂，盖玻片封片，树脂凝固后，倒置显微镜观察。
172.照片见图16。小鼠肿瘤组织he染色结果显示，阴性对照组肿瘤细胞排列致密，轮廓清晰，胞质较少。实验组肿瘤细胞都有不同程度的病理性坏死。低浓度anv组肿瘤细胞间距较大，坏死区域伴有出血，而lbta5组有部分中性粒细胞聚集，同时可以观察到细胞松散，轮廓不清。高浓度的anv和lbta5组肿瘤组织坏死现象更加明显，细胞分散不成片，可能与胶原纤维溶解相关；且lbta5组有大量聚集的中性粒细胞，细胞碎片化程度更高，甚至出现红染的细胞残片。组织形态学观察表明，lbta5与anv均对肿瘤生长有一定影响，且浓度越高，肿瘤坏死情况越严重，同一注射量下，lbta5对肿瘤组织的破坏作用较anv更强。
173.4、免疫组化检测lbta5对肿瘤血管生成的影响
174.免疫组化作为一种既能定性又能定量的组织学检测方法，具有特异性好、灵敏度高等优点，结蛋白(desmin)在很多哺乳动物中肌肉来源的肿瘤组织中表达，作为一种肿瘤标志物，被用于提示肿瘤组织中血管生成的情况
175.取步骤3中完成切片、脱蜡和复水的切片，依次进行如下步骤：
176.①
抗原修复。切片浸没在0.01m柠檬酸钠溶液(ph 6.0)，微波炉加热沸腾停止，5min后重复操作一次，自然冷却恢复室温。
177.②
内源性过氧化物酶阻断。用免疫组化笔圈出组织，滴加内源性过氧化物酶阻断剂(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)作用15min，pbs清洗5min，重复4次。
178.③
通透。组织滴加triton x-100，室温30min，pbs清洗5min，重复3次。
179.④
封闭。滴加4％ bsat溶液，室温封闭1h。
180.⑤
一抗孵育。滴加一抗(desmin兔单抗，与1％ bsa按1:200配制)，湿盒中4℃过夜。
次日回收一抗，pbst清洗5min，重复5次。desmin兔单抗：上海碧云天生物技术有限公司。
181.⑥
二抗孵育。滴加二抗(af555驴抗兔，与4％ bsat按1:500配制)，湿盒中室温2h。回收二抗，pbst清洗5min，重复5次。af555驴抗兔：上海碧云天生物技术有限公司。
182.⑦
封片。避光，含dapi封片剂封片，倒置荧光显微镜观察(用555nm波长激发)。
183.结果见图17。阴性对照组肿瘤组织中可见红色线性纤维状血管组织，低浓度anv组血管密度显着降低，而高浓度anv组和lbta5组治疗的肿瘤无可见血管组织。这意味着lbta5和anv可能通过抑制血管生成在一定意义上阻碍了肿瘤生长，表明融合了lbt之后的lbta5相较于anv有更显著的抑制体内肿瘤血管生成效果。
184.实施例5、lbta5及anv在黑色素瘤中的组织定位
185.fitc是一种荧光染料，可结合各种抗体蛋白，从而定位和定量观察某些抗原。其原理是发生在蛋白分子赖氨酸残基的游离氨基和fitc之间的亲核反应，通过硫脲连接共价结合，偶连物具有良好稳定性。
186.一、荷瘤小鼠模型的建立
187.1、c57bl/6j(雌性，6周龄，18-20g)小鼠适应性饲养一周。
188.2、同实施例4的步骤一的2。
189.二、fitc标记蛋白
190.1、荧光色素准备：避光配制fitc母液(fitc购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，浓度1mg/ml，稀释得到fitc工作液。
191.2、标记：避光条件下将fitc工作液和待标记蛋白溶液等体积混合(每亳克蛋白配比0.01mg荧光素)，充分混匀，4℃孵育36h。
192.3、透析：10000rpm离心20min，将少量沉淀去除，装入md34型透析袋(mwco3500)，再固定到烧杯里，用pbs缓冲液(ph8.0)透析24小时，每12h换一次pbs缓冲液。
193.4、过柱：将透析完毕的标记物，加入葡聚糖凝胶g-25柱，由紫外仪读数收集洗脱峰。由于fitc分子量相比anv和lbta5极小，仅约380da，因此洗脱速度很慢，最先被洗脱下来的吸收峰为已荧光标记的fanv或flbta5。
194.过柱穿透的样品在31-43kda之间有清晰明亮的条带，与flbta5的理论值(40.68kda)相符。
195.过柱穿透的样品在31-43kda之间有清晰明亮的条带，与fanv的理论值(36.28kda)相符。
196.三、小鼠尾静脉注射蛋白
197.将建模成功的小鼠随机分成七组，每组5只，打耳标标记。
198.阴性对照组(pbs)：每天注射一次无菌pbs缓冲液；
199.anv低剂量组：注射fanv，剂量为139μmol/kg体重；
200.anv中剂量组：注射fanv，剂量为417μmol/kg体重；
201.anv高剂量组：注射fanv，剂量为834μmol/kg体重；
202.lbta5低剂量组：注射flbta5，剂量为139μmol/kg体重；
203.lbta5中剂量组：注射flbta5，剂量为417μmol/kg体重；
204.lbta5高剂量组：注射flbta5，剂量为834μmol/kg体重。
205.注射方式：固定好小鼠，拉紧绷直尾部，酒精擦拭后进针，位置为鼠尾远端三分之
一到二分之一处，推药无阻力时即成功，药物进入后，血管微发白，注射成功。
206.注射半小时后，小鼠脱颈处死，完整剖出小鼠肿瘤组织。
207.取肿瘤组织，依次进行如下：
①
固定：完整剖出小鼠肿瘤组织，用4％多聚甲醛浸泡，4℃固定过夜，然后修剪成适当大小放在包埋盒里；
②
梯度脱水：组织依次浸泡在50％、70％、80％、95％的乙醇、无水乙醇中，在摇床上脱水，每次2h；
③
透明：组织浸泡于二甲苯，30min后更换，继续透明30min。
④
浸蜡：组织浸于融化石蜡，60℃持续1h，更换一次后浸泡过夜；
⑤
包埋：将组织取出，用石蜡包埋机包埋。
208.取石蜡组织块，依次进行如下：
①
切片：组织用石蜡切片机切5μm薄片，60℃烘烤1h；
②
脱腊：切片浸于二甲苯，10min，重复两次；
③
复水：先用无水乙醇浸5min，重复两次，然后依次浸于95％、90％、80％、70％乙醇中，各5min，最后蒸馏水洗30s。
④
复水后避光，用含dapi封片剂直接封片，荧光观察拍照(用488nm波长激发)。
209.倒置荧光显微镜在100倍下观察拍摄荧光分布的照片见图18。与对照组相比，肿瘤组织中的绿色荧光密度和强度随注射anv和lbta5量的增加逐渐提升，同时可以观察到，当注射量达到417μmol/kg和834μmol/kg时，对同一注射量，lbta5组绿色荧光密度较anv组大。结果表明，lbta5和anv能直接作用于黑色素瘤，且lbta5具有更强的肿瘤靶向性，使得目的蛋白更多汇聚于黑色素瘤组织中。
210.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.融合蛋白，包括如下两个区段：膜联蛋白a5和lebestatin。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述膜联蛋白a5如seq id no：1中第46-364位所示。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述lebestatin如seq id no：1中第1-41位所示。4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)seq id no：1所示的蛋白质；(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。5.权利要求1至4中任一所述融合蛋白在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的应用。6.权利要求1至4中任一所述融合蛋白在制备针对黑色素瘤细胞的增殖抑制剂和/或迁移抑制剂中的应用。7.权利要求1至4中任一所述融合蛋白在制备用于抑制黑色素瘤肿瘤组织中的血管增生的药物中的应用。8.一种用于治疗黑色素瘤的药物，其活性成分包括权利要求1至4中任一所述融合蛋白。9.一种针对黑色素瘤细胞的增殖抑制剂和/或迁移抑制剂，其活性成分包括权利要求1至4中任一所述融合蛋白。10.一种用于抑制黑色素瘤肿瘤组织中的血管增生的药物，其活性成分包括权利要求1至4中任一所述融合蛋白。

技术总结
本发明公开了融合蛋白LbtA5及其在制备恶性黑色素瘤药物中的应用。本发明保护一种融合蛋白，命名为融合蛋白LbtA5，包括如下两个区段：膜联蛋白A5和lebestatin。具体的，所述融合蛋白为SEQ ID NO：1所示的蛋白质。本发明还保护以上任一所述融合蛋白在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的应用。本发明还保护以上任一所述融合蛋白在制备针对黑色素瘤细胞的增殖抑制剂和/或迁移抑制剂中的应用。本发明对于恶性黑色素瘤治疗药物的开发具有重大价值。性黑色素瘤治疗药物的开发具有重大价值。


技术研发人员：井健 李香凝
受保护的技术使用者：北京师范大学
技术研发日：2023.01.19
技术公布日：2023/8/14