细粒棘球绦虫EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9株的构建方法

细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法
技术领域
1.本发明涉及重组狂犬病病毒技术领域，具体涉及细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法。


背景技术：

2.狂犬病是一种人畜共患传染病，由狂犬病病毒感染引起中枢神经系统的一系列神经症状。它是一种世界性的公共卫生预防和控制疾病。包虫病又称细粒棘球蚴病，导致多脏器内形成细粒棘球蚴包囊，引起一种严重的人畜共患慢性寄生虫疾病。在狂犬病和包虫病的传播过程中，犬既是狂犬病传播的主要媒介，又是包虫病传播的主要宿主。对犬科动物进行免疫预防是控制这两种疾病传播的关键环节。目前，以eg95重组蛋白为抗原构建的亚单位疫苗主要用于预防和控制细粒棘球蚴对中间宿主(绵羊)的感染，并取得了理想的效果，但对终末宿主犬仍缺乏疫苗开发。
3.细粒棘球绦虫egm家族的蛋白有egm9、egm123和egm4，是在成虫阶段表达，参与成虫的成熟和虫卵的发育。已有研究者将egm9和egm123特异性蛋白，免疫犬后，产生了很好的保护效果，犬经口感染2万多个eg虫卵，在感染后45天免疫犬的血清中检测结果显示，免疫egm9和egm123蛋白对终末宿主犬可诱导产生高水平的保护作用，可以高效的抑制虫卵的孵出和虫体的成形，并且egm123蛋白对成虫发育和成熟的影响远大于egm9蛋白。目前在我国采取定期给犬驱虫，防止虫卵污染环境的防控措施来，阻断eg的传播。但频繁的驱虫不仅加大了防控工作量还给牧区的人员带来了很多不便。因此，对犬实施免疫接种预防是控制包虫病传播的重要途径。
4.现有技术中，如图1所示，通过病毒反向遗传学技术，构建狂犬病病毒的结构蛋白n、p、l基因、以及n-p-m基因融合片段和狂犬病病毒g基因、细粒棘球绦虫egm123基因与增强型绿色荧光蛋白egfp融合片段基因，通过载体酶切插入连接方法，依次将狂犬病病毒l基因、n-p-m基因融合片段和g+egm123+egfp基因融合片段重组于pcdna3.1(-)表达载体上，构建egm123基因重组狂犬病srv9病毒全长cdna。将构建成的srv9+egm123全长cdna重组质粒与pcdna3.1-n、pcdna3.1-p、pcdna3.1-l病毒结构蛋白质粒共同转染表达rna聚合酶的bsr细胞，拯救出“egm123基因重组狂犬病病毒”并通过rt-pcr、间接免疫荧光、病毒免疫电镜技术、对重组病毒的病毒进行鉴定。
5.关于上述现有技术存在的缺陷为：
6.犬科动物作为狂犬病和包虫病由动物向人类传播的共同感染宿主、病原携带者和病原传递者，在狂犬病和包虫病传播过程中起着至关重要的中间环节作用。目前国内尚未有成熟的狂犬病和包虫病口服疫苗，而传统注射疫苗由于操作技术难度较大，不易被农牧民所接受，是导致农牧区防疫意识薄弱，狂犬病和包虫病发病率长期居高不下的主要原因。
7.为此，本发明旨在提供一种细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

8.本发明的目的是为了解决上述问题，提供细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法。
9.为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，采用病毒反向遗传学技术，构建狂犬病病毒srv9的结构蛋白n、p、l基因、n-p-m基因融合片段、g+egm123+egfp基因融合片段重组于pcdna3.1(-)表达载体上，构建egm123基因重组狂犬病srv9病毒全长cdna；将构建成的srv9+egm123全长cdna重组质粒与辅助质粒pcdna3.1-n、p、l共同转染表达rna聚合酶的bsr细胞，拯救出egm123基因重组狂犬病病毒，并对重组病毒的滴度、形态和免疫原性进行测定；具体包括以下步骤：
10.s1、狂犬病病毒srv9毒株n、p、l结构基因的合成与重组质粒的构建；
11.s2、狂犬病病毒srv9毒株融合基因n+p+m、g+egm123+egfp的合成与重组质粒的构建；
12.s3、egm123基因重组狂犬病病毒srv9株感染性克隆全长cdna的构建；
13.s4、各质粒菌液活化及菌液鉴定；
14.s5、质粒dna的提取及酶切鉴定；
15.s6、pcdna3.1-g+egm123+egfp、n、p重组质粒的提取；
16.s7、pcdna3.1-g+egm123+egfp、n、p重组质粒的转染；
17.s8、sds-page电泳检测g+egm123+egfp融合蛋白的表达；
18.s9、western b lott ing检测g+egm123+egfp融合蛋白的表达；
19.s10、western b lott ing检测狂犬病病毒srv9毒株n、p蛋白的表达；
20.s11、重组病毒全长和辅助无内毒素质粒的大量提取及鉴定；
21.s12、bsr细胞的复苏与冻存；
22.s13、细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的拯救；
23.s14、srv9-egm123-egfp重组病毒的rt-pcr检测。
24.进一步地，步骤s1具体为：
25.参照狂犬病病毒srv9毒株全基因组序列(genbank登录号：af499686)，通过基因合成技术分别合成了狂犬病病毒srv9株结构基因n、p、l，并将合成的结构基因l基因的3’端位置，下游bamhⅰ酶切位点之前引入了丁型肝炎核酶(hdvrz)序列，其大小为173bp；
26.分别将合成的基因片段n、p基因序列插入限制性核酸内切酶xhoⅰ/ecorⅰ，狂犬病病毒l基因加入限制性核酸内切酶ecorⅰ/bamhⅰ；经双酶切连接方法连于真核表达载体pcdna3.1-中；将构建好的重组质粒pcdna3.1-n、pcdna3.1-p、pcdna3.1-l通过菌液pcr以及双酶切鉴定。
27.进一步地，步骤s2具体为：
28.采用基因合成技术分别合成狂犬病病毒srv9株n+p+m融合基因和g基因插入外源基因egm123及增强型绿色荧光蛋白egfp基因的融合片段基因g+egm123+egfp序列；将合成的n+p+m基因片段连入xhoⅰ/bamhⅰ酶切位点，g+egm123+egfp基因连入了ecor
ⅴ
/ecorⅰ酶切位点；在n+p+m基因的5’端位置，上游xhoⅰ酶切位点之后引入了锤头状核酶hamrz序列；在融合蛋白的基因序列之间分别连入了蛋白linker-(ggggs)2；将合成的基因片段连于真核表达载体pcdna3.1(-)，构建重组质粒pcdna3.1-n+p+m、pcdna3.1-g+egm123+egfp；经菌液
pcr、双酶和测序序列比对鉴定构建好的重组质粒。
29.进一步地，步骤s3具体为：
30.将基因合成的pcdna3.1(-)-n+p+m、pcdna3.1(-)-g+egm123+egfp、pcdna3.1(-)
[0031]-l上的片段，通过酶切插入方法，依次连接至pcdna3.1(-)载体上，构建pcdna3.1(-)的全长重组载体pcdna3.1(-)-n+p+m+g+egm123+egfp+l，并在全长基因片段上连入xhoⅰ/bamhⅰ酶切位点，构建得egm123基因重组srv9病毒感染性克隆全长cdna重组载体，经菌液pcr、双酶和测序序列比对鉴定构建好的重组载体。
[0032]
进一步地，步骤s4具体为：
[0033]
a、菌液活化
[0034]
在无菌的环境中用吸头轻轻蘸取各质粒的甘油菌添加于1ml的不含amp+抗生素的lb液体培养基中，在37℃的恒温摇床中摇晃培养1h，使菌液活化；将复苏呈浑浊状的转化混合液吹打混匀，接种在平板中，培养14h之后观察平板上长出的单菌落，挑取形态正常的单菌落，进行摇菌扩繁至od600值为2.0-3.0之间，再进行菌液pcr鉴定、酶切鉴定及测序；
[0035]
b、菌液pcr鉴定
[0036]
将过夜培养的菌液中吸取适量菌液，用菌液pcr鉴定引物扩增每个基因片段。
[0037]
进一步地，s5具体为：
[0038]
a、重组质粒dna的提取
[0039]
将摇菌扩繁后的菌液按照天根质粒提取试剂盒说明书严格按照步骤操作，测定浓度后，用1.0％的dna琼脂糖凝胶电泳125v，30min进行跑胶，电泳结束后在凝胶成像系统中观察重组质粒dna结果；电泳剩下的质粒dna产物进行下一步的酶切鉴定和测序验证；
[0040]
b、重组质粒dna双酶切鉴定
[0041]
将提取完成的重组质粒在200μl的ep管中加入酶切体系，并在酶切程序下进行双酶切鉴定。
[0042]
进一步地，步骤s6具体为：
[0043]
将构建的pcdna3.1-g+egm123+egfp、n和p重组质粒分别吸出1μl，加入大肠杆菌dh5α细胞中，轻轻混合在冰上置于30min后立即放入42℃水浴中90s然后取出再冷却2min；再向冷却的管中加入900μl无菌的不含任何抗生素的lb培养基，充分混合；在37℃的摇床中摇晃培养50min，吸收100μl转化的产物，均匀涂于lb固体琼脂培养基上，在37℃培养过夜；选择单克隆菌，摇瓶繁殖，按照omega无内毒素质粒提取试剂盒的要求提取质粒，测定质粒浓度，进行pcr和双酶消化鉴定。
[0044]
进一步地，步骤s7具体为：取状态良好的bsr细胞传到六孔板内，待细胞密度达到80％时，用10％ fbs的dmem给细胞换液；并配制质粒pcdna3.1-g+egm123+egfp、pcdna3.1-n、pcdna3.1-p的dna复合物，依次进行转染；
[0045]
步骤s8具体为：将转染48h后的六孔板弃掉培养液，用pbs洗3次，每孔加入ri pa细胞裂解液于250μl，为防止蛋白降解在冰上置于30min，在超声破碎仪每分钟超声3s停留5s，总共超声3min；4℃，10000r/min离心10min，取上清加到新的离心管；加入蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min，4℃离心10min，-20℃保存备用；配制sds-page凝胶，每孔加入20μl样品进行电泳，电泳结束后进行染色和脱色，观察蛋白表达情况。
[0046]
进一步地，步骤s9具体为：将变性后的蛋白样品每孔加20μl进行sds-page电泳，电
泳结束用转膜仪把跑好的蛋白胶转移到0.45μm的pvdf膜中；在25℃用5％的封闭缓冲液封闭2h，然后把pvdf膜分成三段分别于rabv-g蛋白多抗、gfp单抗和细粒棘球绦虫egm123多抗在4℃过夜孵育；tbst清洗3次，37℃分别孵育hrp标记的山羊抗兔子igg、hrp标记的山羊抗小鼠igg、hrp标记的兔抗狗igg2 h后，tbst清洗3次，曝光观察抗原抗体结合结果；
[0047]
步骤s10具体为：将狂犬病病毒srv9毒株n、p蛋白转染48h后的六孔板弃掉培养液，用pbs洗3次，每孔加入ri pa细胞裂解液于250μl，在冰上置于30min；在超声破碎仪中每分钟超声3s停留5s，总共超声3min；4℃，10000r/min离心10min，取上清加到新的离心管；加入蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min，4℃离心10min，-20℃保存备用；配制10％的sds-page凝胶，每孔加入20μl蛋白样品，进行电泳，跑好的蛋白胶用转膜仪转到pvdf膜中；将pvdf膜分别于rabv-n、rabv-p蛋白多抗在4℃过夜孵育；tbst清洗3次，37℃分别孵育hrp标记的山羊抗兔子igg 2h后，tbst清洗3次，曝光观察抗原抗体结合结果。
[0048]
进一步地，步骤s11具体为：将提取并鉴定过的重组质粒pcdna3.1-n、pcdna3.1-p、pcdna3.1-l和全长，经质粒转化方法转到dh5α中，培养12h；从中挑取一个单独的菌落和氨苄抗生素在37℃下，摇晃培养16h；从过夜培养的菌液中吸取200μl，测定在od600下的细菌浓度；再用omega无内毒素质粒提取试剂盒严格按照使用说明书来进行大量提取；
[0049]
步骤s12具体为：预先准备一个42℃的水浴，然后将待解冻的bsr细胞从液氮中取出来，快速放到准备好的温水中使细胞溶液熔化，并在无菌条件下以1000r/min的转速将熔化的细胞溶液离心10min；丢弃上清液，添加1ml 10％fbs细胞培养基，重新悬浮，并以1000r/min的转速离心10min；吹打并混合离心的细胞团，将其转移到新的干净的细胞瓶中，并将其置于37℃，5％的co2培养箱中培养；胰蛋白酶消化后，加入2ml 10％fbs细胞培养基终止消化，转移至5ml离心管，1000r/min离心10min；丢弃上清液，加入制备好的冷冻保存液，悬浮细胞并将其转移到冷冻保存管中；梯度冷却后，放入液氮中长期保存；
[0050]
步骤s13具体为：(1)在转染前一天将状态良好的bsr细胞传到六孔板内，使第二天细胞密度达到约70％-90％时，把原有的培养液倒掉，换成每孔2ml的不含任何抗生素只含由有血清的新鲜培养液；(2)按照转染质粒用量将质粒依次加入离心管中，并按照病毒拯救流程进行重组病毒的拯救；
[0051]
步骤s14具体为：(1)引物设计与合成；(2)重组病毒总rna的提取；(3)重组狂犬病病毒p基因和外源基因egm123的rt-pcr检测。
[0052]
本发明还提供了上述细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法在制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗上的应用。
[0053]
以下为本发明中涉及的序列：
[0054]
npm基因：
[0055]
ttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacgggccctctagactcgagtgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtatggatgcggataaaatcgtgtttaaagtgaataaccaagttgtgagtctgaagccggagattatcgtggaccaatacgagtacaagtacccagcgatcaaggacctcaaaaaaccgtgcatcacgctgggtaaagcgccggatctcaacaaggcctacaagagcgtgctgagcggtatgagcgcggcgaagctgaacccagacgatgtgtgtagctatctggcggcggccatgcaattctttgaaggcacgtgcccggaagattggacgagctatggtatcgttatcgcccgcaagggcgataaaatcacgccgggcagcctcgtggagatcaagcgtaccgatgttgagggcaactgggcgctgacgggtggcatggagctgacccgcgatccaacgg
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[0056]
g+egm23+egfp基因：
[0057]
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[0058]
l基因：
[0059]
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[0060]
与现有技术相比，本方案的有益效果：
[0061]
1、本发明的方法通过病毒反向遗传学技术，构建狂犬病病毒的结构蛋白n、p、l基因、以及n-p-m基因融合片段、g+egm123+egfp基因融合片段重组于pcdna3.1(-)表达载体上，构建egm123基因重组狂犬病srv9病毒全长cdna，将构建成的srv9+egm123全长cdna重组质粒与辅助质粒pcdna3.1-n、p、l共同转染表达rna聚合酶的bsr细胞，拯救出“egm123基因重组狂犬病病毒(srv9+egm123)”并对重组病毒的滴度、形态和免疫原性进行测定，为研制“狂犬病和包虫病二联基因重组疫苗”提供疫苗毒株；
[0062]
2、本发明通过反向遗传学操作技术将细粒棘球绦虫egm123基因重组于狂犬病srv9病毒基因组中拯救出“egm123基因重组狂犬病病毒”，通过对宿主体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫作用的鉴定，能够为研制针对性强、操作简便、易于普及的高效新型“狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗”的研究与应用提供更为广阔的研究思路，为降低人和动物群体中狂犬病和包虫病的传播风险进行基础研究和科学探索；
[0063]
3、目前，国际上对于包虫病疫苗的研制主要是针对中间宿主(牛、羊)，而对感染源头(犬)的疫苗研制较少，以至于包虫病长期不能净化的重要原因。因此，本发明利用反向遗传学方法构建的“egm123基因重组狂犬病病毒”，可携带狂犬病病毒和细粒棘球蚴两种抗原蛋白，将重组病毒制备口服疫苗用于免疫犬科动物，可诱导机体产生粘膜免疫效果，阻止肠道对细粒棘球蚴的感染和发育，显著减少包虫病的发病率。不仅可以预防狂犬病，还可以从源头上预防包虫病的发生。从而，为解决我国广大农牧区群众和养殖动物免受包虫病的威胁，在我国西北五省和内蒙古等农牧区的应用前景和社会效益极为显著。
附图说明
[0064]
图1是本发明实施例中egm123基因重组狂犬病病毒srv9毒株全长感染性克隆构建图；
[0065]
图2是本发明实施例中重组质粒pcdna3.1-g+egm123+egfp、n、p的转染；
[0066]
图3是本发明实施例中重组病毒srv9-egm123-egfp的拯救；
[0067]
图4是本发明实施例中狂犬病病毒srv9株n基因质粒pcr鉴定(m：10000dna marker，1：狂犬病病毒srv9株n基因1365bp)；
[0068]
图5是本发明实施例中狂犬病病毒srv9株n基因重组质粒酶切鉴定(m：15000dna marker，1：pcdna3.1-n重组质粒6792bp，2：pcdna3.1-n重组质粒酶切结果，狂犬病srv9病毒n基因1365bp；)；
[0069]
图6是本发明实施例中狂犬病病毒srv9株p基因质粒pcr鉴定(m：10000dna marker，1：狂犬病病毒srv9株p基因1107bp)；
[0070]
图7是本发明实施例中狂犬病病毒srv9株p基因质粒酶切鉴定(m：15000dna marker，1：pcdna3.1-p重组质粒6534bp，2：pcdna3.1-p酶切结果，狂犬病srv9病毒p基因
1107bp)；
[0071]
图8是本发明实施例中狂犬病病毒srv9株l基因质粒pcr鉴定(m：10000dna marker，1：狂犬病病毒srv9株l基因6471bp)；
[0072]
图9是本发明实施例中狂犬病病毒srv9株l基因质粒酶切鉴定(m：15000dna marker，1：pcdna3.1-l重组质粒12071bp，2：pcdna3.1-l酶切结果)；
[0073]
图10是本发明实施例中狂犬病srv9病毒n+p+m基因片段重组质粒pcr鉴定(m：10000dna marker，1：狂犬病srv9病毒n+p+m基因片段大小为3160bp)；
[0074]
图11是本发明实施例中狂犬病srv9病毒n+p+m基因片段重组质粒酶切鉴定(m：8000dna marker，1：pcdna3.1-n+p+m重组质粒8587bp，2：pcdna3.1-n+p+m重组质粒酶切结果，狂犬病srv9病毒n+p+m基因片段大小为3160bp)；
[0075]
图12是本发明实施例中狂犬病病毒g+egm123+egfp基因重组质粒pcr鉴定(m：10000dna marker，1：狂犬病srv9病毒g+egm123+egfp重组基因基因3256bp)；
[0076]
图13是本发明实施例中狂犬病病毒g+egm123+egfp基因重组质粒酶切鉴定(m：8000dna marker，1：pcdna3.1-g+egm123+egfp重组质粒8683bp，2：pcdna3.1-g+egm123+egfp质粒酶切结果，狂犬病srv9病毒g+egm123+egfp基因3256bp)；
[0077]
图14是本发明实施例中egm123基因重组狂犬病srv9病毒全长cdna pcr鉴定(m：15000dna marker，1：egm123基因重组狂犬病srv9病毒全长cdna pcr鉴定12465bp)；
[0078]
图15是本发明实施例中egm123基因重组狂犬病srv9病毒全长cdna质粒酶切鉴定(1：egm123基因重组狂犬病srv9病毒全长cdna质粒17892bp，2：egm123基因重组狂犬病srv9病毒全长cdna质粒酶切结果为12465bp，m,dl12000 dna marker)；
[0079]
图16是本发明实施例中狂犬病病毒g+egm123+egfp重组质粒pcr鉴定(m：10000dna marker，1：狂犬病病毒g+egm123+egfp重组基因3033bp)；
[0080]
图17是本发明实施例中狂犬病病毒g+egm123+egfp重组质粒酶切鉴定(m:15000dna marker，1：重组质粒，2～3：重组质粒酶切结果)；
[0081]
图18是本发明实施例中荧光显微镜下观察egfp表达结果(a：正常细胞对照，b：48h观察结果(100
×
)，c：48h观察结果(200
×
))；
[0082]
图19是本发明实施例中g+egm123+egfp融合蛋白sds-page电泳结果(m：预染蛋白marker，1：g+egm123+egfp融合蛋白，2：正常bsr细胞蛋白)；
[0083]
图20是本发明实施例中western-b lott ing检测g、egm123、egfp蛋白免疫原性鉴定(m：预染蛋白marker，1～3：g+egm123+egfp融合蛋白样品)；
[0084]
图21是本发明实施例中狂犬病病毒n蛋白的鉴定(m：预染蛋白marker，1～4：狂犬病病毒n蛋白样品5：正常bsr细胞蛋白样品对照)；
[0085]
图22是本发明实施例中狂犬病病毒p蛋白的鉴定(m：预染蛋白marker，1～2：狂犬病病毒p蛋白样品，3：正常bsr细胞蛋白样品对照)；
[0086]
图23是本发明实施例中重组质粒酶切鉴定结果(m：15000dna marker，1-3：pcdna3.1-p酶切，4：pcdna3.1-p质粒，6：pcdna3.1-n酶切，7：pcdna3.1-n质粒，12：pcdna3.1-l质粒，13-14：pcdna3.1-l酶切，15：全长重组质粒，16-18：全长酶切结果)；
[0087]
图24是本发明实施例中荧光显微镜观察拯救结果(a：正常bsr细胞图，b：只转染全长质粒的荧光图，c：拯救的重组病毒荧光图，d：光学显微镜下正常bsr细胞图，e：光学显微
镜下转染全长质粒细胞图，f：光学显微镜下拯救的重组病毒细胞图)；
[0088]
图25是本发明实施例中egm123基因rt-pcr检测结果(图中a)和狂犬病病毒p基因rt-pcr检测结果(图中b)(m：2000dna marker，1-6：细粒棘球绦虫egm123基因，m：15000dna marker，1：阴性对照，2-3：狂犬病病毒p基因)；
[0089]
图26是本发明实施例中wb鉴定重组病毒结构蛋白g、p和外源蛋白egm123的表达(m：预染蛋白marker，1：rabv-g蛋白样品(a)，2：正常bsr细胞蛋白样品(a)；1：正常bsr细胞蛋白样品(b)2：rabv-p蛋白样品(b)；1，egm123蛋白样品(c)；2，正常bsr细胞蛋白样品(c))；
[0090]
图27是本发明实施例中重组病毒的透射电子显微镜观察结果。
具体实施方式
[0091]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0092]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0093]
实施例：
[0094]
本发明实施例提供的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法的方案如上述发明内容所述。
[0095]
以下为本发明实施例方案的具体试验：
[0096]
步骤一、狂犬病病毒srv9毒株n、p、l结构基因的合成与重组质粒的构建
[0097]
参照狂犬病病毒srv9毒株全基因组序列(genbank登录号：af499686)，通过基因合成技术分别合成了狂犬病病毒srv9株结构基因n、p、l，并将合成的结构基因l基因的3’端位置，下游bamhⅰ酶切位点之前引入了丁型肝炎核酶(hdvrz)序列，其大小为173bp。分别将合成的基因片段n、p基因序列插入限制性核酸内切酶xhoⅰ/ecorⅰ，狂犬病病毒l基因加入限制性核酸内切酶ecorⅰ/bamhⅰ。经双酶切连接方法连于真核表达载体pcdna3.1-中。将构建好的重组质粒pcdna3.1-n、pcdna3.1-p、pcdna3.1-l通过菌液pcr以及双酶切鉴定。
[0098]
步骤二、狂犬病病毒srv9毒株融合基因n+p+m、g+egm123+egfp的合成与重组质粒的构建
[0099]
通过基因合成技术分别合成了狂犬病病毒srv9株n+p+m融合基因和g基因插入外源基因egm123及增强型绿色荧光蛋白egfp基因的融合片段基因g+egm123+egfp序列。将合成的n+p+m基因片段连入xhoⅰ/bamhⅰ酶切位点，g+egm123+egfp基因连入了ecor
ⅴ
/ecorⅰ酶切位点。在n+p+m基因的5’端位置，上游xhoⅰ酶切位点之后引入了锤头状核酶hamrz序列。为了确保融合蛋白n+p+m和g+egm123+egfp能更好的发挥生物学活性，融合蛋白的基因序列之间分别连入了蛋白linker-(ggggs)2。将合成的基因片段连于真核表达载体pcdna3.1(-)，构建重组质粒pcdna3.1-n+p+m、pcdna3.1-g+egm123+egfp。经菌液pcr、双酶和测序序列比对鉴定构建好的重组质粒。
[0100]
步骤三、egm123基因重组狂犬病病毒srv9株感染性克隆全长cdna的构建
[0101]
将基因合成的pcdna3.1(-)-n+p+m、pcdna3.1(-)-g+egm123+egfp、pcdna3.1(-)
[0102]-l上的片段，通过酶切插入方法，依次连接至pcdna3.1(-)载体上，构建pcdna3.1(-)的全长重组载体pcdna3.1(-)-n+p+m+g+egm123+egfp+l，并在全长基因片段上连入xhoⅰ/bamhⅰ酶切位点。构建的egm123基因重组srv9病毒感染性克隆全长cdna重组载体示意图(见图1所示)，经菌液pcr、双酶和测序序列比对鉴定构建好的重组质粒。
[0103]
步骤四、各质粒菌液活化及菌液鉴定
[0104]
a、菌液活化
[0105]
在无菌的环境中用吸头轻轻蘸取各质粒的甘油菌添加于1ml的不含amp+抗生素的lb液体培养基中，在37℃的恒温摇床中摇晃培养1h，使菌液活化。将复苏呈浑浊状的转化混合液吹打混匀，接种在平板中，培养14h之后观察平板上长出的单菌落，挑取形态正常的单菌落，进行摇菌扩繁至od600值为2.0-3.0之间，再进行菌液pcr鉴定、酶切鉴定及测序。
[0106]
b、菌液pcr鉴定
[0107]
将过夜培养的菌液中吸取适量菌液，用菌液pcr鉴定引物扩增每个基因片段。引物序列和菌液鉴定pcr体系及pcr程序分别见如下表1、表2和表3。
[0108]
表1菌液pcr鉴定引物序列
[0109][0110]
表2菌液鉴定pcr体系
[0111][0112]
表3pcr程序
[0113][0114]
注：各质粒由于片段大小各不相同，所以pcr的延伸时间也不同(p基因：1min；n基因：1min 30s；n+p+m基因：3min；l基因：6min；g+egm123+egfp基因：3min；重组病毒全长基因：12min 30s)。
[0115]
步骤五、质粒dna的提取及酶切鉴定
[0116]
a、重组质粒dna的提取
[0117]
将摇菌扩繁后的菌液按照天根质粒提取试剂盒说明书严格按照步骤操作，测定浓度后，用1.0％的dna琼脂糖凝胶电泳125v，30min进行跑胶，电泳结束后在凝胶成像系统中观察重组质粒dna结果。电泳剩下的质粒dna产物进行下一步的酶切鉴定和测序验证。
[0118]
b、重组质粒dna双酶切鉴定
[0119]
将提取完成的重组质粒在200μl的ep管中加入如下成分(见表4和表5)进行双酶切鉴定。
[0120]
表4酶切体系
[0121][0122]
注：各质粒由于插入酶切位点各不相同，所以用的限制性核酸内切酶也不同(p基因：xhoⅰ/ecorⅰ；n基因：xhoⅰ/ecorⅰ；n+p+m基因：xhoⅰ/ecor
ⅴ
；l基因：ecorⅰ/bamhⅰ；g+egm123+egfp基因：ecor
ⅴ
/ecorⅰ；重组病毒全长基因：xhoⅰ/bamhⅰ)。
[0123]
表5酶切程序
[0124][0125]
步骤六、pcdna3.1-g+egm123+egfp、n、p重组质粒的提取
[0126]
将构建和测序的pcdna3.1-g+egm123+egfp、n和p重组质粒分别吸出1μl，加入大肠杆菌dh5α细胞中，轻轻混合在冰上置于30min后立即放入42℃水浴中90s然后取出再冷却2min。再向冷却的管中加入900μl无菌的不含任何抗生素的lb培养基，充分混合。在37℃的摇床中摇晃培养50min，吸收100μl转化的产物，均匀涂于lb固体琼脂培养基上，在37℃培养过夜。选择单克隆菌，摇瓶繁殖，按照omega无内毒素质粒提取试剂盒的要求提取质粒，测定质粒浓度，进行pcr和双酶消化鉴定。
[0127]
步骤七、pcdna3.1-g+egm123+egfp、n、p重组质粒的转染
[0128]
将取状态良好的bsr细胞传到六孔板内，待细胞密度达到80％时，用10％fbs的dmem给细胞换液。并将按照如图2所示的流程配制质粒pcdna3.1-g+egm123+egfp、pcdna3.1-n、pcdna3.1-p的dna复合物，依次进行转染。
[0129]
步骤八、sds-page电泳检测g+egm123+egfp融合蛋白的表达
[0130]
将转染48h后的六孔板弃掉培养液，用pbs洗3次，每孔加入ri pa细胞裂解液于250
μl，为防止蛋白降解在冰上置于30min，在超声破碎仪每分钟超声3s停留5s，总共超声3min。4℃，10000r/min离心10min，取上清加到新的离心管。加入蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min，4℃离心10min，-20℃保存备用。配制sds-page凝胶，每孔加入20μl样品进行电泳，电泳结束后进行染色和脱色，观察蛋白表达情况。
[0131]
步骤九、western b lott ing检测g+egm123+egfp融合蛋白的表达
[0132]
将变性后的蛋白样品每孔加20μl进行sds-page电泳，电泳结束用转膜仪把跑好的蛋白胶转移到0.45μm的pvdf膜中。在25℃用5％的封闭缓冲液封闭2h，然后把pvdf膜分成三段分别于rabv-g蛋白多抗(1∶500稀释)、gfp单抗(1∶2000稀释)和细粒棘球绦虫egm123多抗(1:500稀释)在4℃过夜孵育。tbst清洗3次，37℃分别孵育hrp标记的山羊抗兔子igg、hrp标记的山羊抗小鼠igg、hrp标记的兔抗狗igg(1∶5000稀释)2h后，tbst清洗3次，曝光观察抗原抗体结合结果。
[0133]
步骤十、western b lott ing检测狂犬病病毒srv9毒株n、p蛋白的表达
[0134]
将狂犬病病毒srv9毒株n、p蛋白转染48h后的六孔板弃掉培养液，用pbs洗3次，每孔加入ri pa细胞裂解液于250μl，为防止蛋白降解在冰上置于30min。在超声破碎仪中每分钟超声3s停留5s，总共超声3min。4℃，10000r/min离心10min，取上清加到新的离心管。加入蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min，4℃离心10min，-20℃保存备用。配制10％的sds-page凝胶，每孔加入20μl蛋白样品，进行电泳，跑好的蛋白胶用转膜仪转到pvdf膜中。将pvdf膜分别于rabv-n、rabv-p蛋白多抗(1∶5000稀释)在4℃过夜孵育。tbst清洗3次，37℃分别孵育hrp标记的山羊抗兔子igg(1∶5000稀释)2h后，tbst清洗3次，曝光观察抗原抗体结合结果。
[0135]
步骤十一、重组病毒全长和辅助无内毒素质粒的大量提取及鉴定
[0136]
将提取并鉴定过的重组质粒pcdna3.1-n、pcdna3.1-p、pcdna3.1-l和全长，经质粒转化方法转到dh5α中，培养12h。从中挑取一个单独的菌落和氨苄抗生素在37℃下，摇晃培养16h。为了获得最佳的质粒产量从过夜培养的菌液中吸取200μl，测定在od600下的细菌浓度。再用omega无内毒素质粒提取试剂盒严格按照使用说明书来进行大量提取。如下表6和表7所示。
[0137]
表6酶切体系
[0138][0139][0140]
注：p基因：xhoⅰ/ecorⅰ；n基因：xhoⅰ/ecorⅰ；l基因：ecorⅰ/bamhⅰ；重组病毒全长基因：xhoⅰ/bamhⅰ[0141]
表7酶切程序
[0142][0143]
步骤十二、bsr细胞的复苏与冻存
[0144]
预先准备一个42℃的水浴，然后将待解冻的bsr细胞从液氮中取出来，快速放到准备好的温水中使细胞溶液熔化，并在无菌条件下以1000r/min的转速将熔化的细胞溶液离心10min；丢弃上清液，添加1ml 10％fbs细胞培养基，重新悬浮，并以1000r/min的转速离心10min。吹打并混合离心的细胞团，将其转移到新的干净的细胞瓶中，并将其置于37℃，5％的co2培养箱中培养。胰蛋白酶消化后，加入2ml 10％fbs细胞培养基终止消化，转移至5ml离心管，1000r/min离心10min；丢弃上清液，加入制备好的冷冻保存液，悬浮细胞并将其转移到冷冻保存管中。梯度冷却后，放入液氮中长期保存。
[0145]
步骤十三、细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的拯救
[0146]
(1)在转染前一天将状态良好的bsr细胞传到六孔板内，使第二天细胞密度达到约70％-90％时，把原有的培养液倒掉，换成每孔2ml的不含任何抗生素只含由有血清的新鲜培养液；
[0147]
(2)按照如下表8的转染质粒用量将质粒依次加入离心管中，并按照图3所示的流程进行重组病毒的拯救。
[0148]
表8转染质粒用量
[0149][0150]
步骤十四、srv
9-egm123-egfp重组病毒的rt-pcr检测
[0151]
(1)引物设计与合成
[0152]
由昆泰锐生物技术有限责任公司合成引物序列，序列信息见下表9：
[0153]
表9引物序列表
[0154][0155]
(2)重组病毒总rna的提取
[0156]
将-80℃冻存的病毒液吸取500ul加入500μl tr izo l，倒置混匀，在冰上静置5min。将200μl氯仿溶液加入上述ep管中，倒转混合物并在涡旋振荡器上剧烈混合15s。冰上放置10min使rna分离，再用4℃离心机中，12000r/min，离心10min。将离心的混合物分成三层，分离的rna存在于上层水层中。小心地将上清液从离心管中吸取至600μl并置于新的ep管中，然后向管中加入等体积的异丙醇，将其倒置混合，置于冰上，静置10min，在低温离心机中4℃下，12000r/min，离心10min。弃去上清液，缓慢加入1ml 75％的无水乙醇，在低温离心机中4℃下，7500r/min下洗涤rna沉淀，并离心5min。小心弃去上清，在室温下晾干5min以免影响rna的得率。将提取的总rna溶解于20μl depc水中，轻弹混匀并瞬离，-80℃保存或者进行反转录。
[0157]
(3)重组狂犬病病毒p基因和外源基因egm123的rt-pcr检测
[0158]
将提取的重组病毒总rna分别用狂犬病病毒p基因和细粒棘球绦虫egm123基因的上游引物进行反转录转成cdna，反转录反应体系如下表10；将反转录成功的病毒基因组cdna用如下表11体系和表12反应程序进行pcr扩增鉴定。
[0159]
表10rt-pcr体系表
[0160][0161]
注：在pcr仪上设置条件为42℃，30mi n；95℃，5mi n；5℃，5mi n进行反转录反应。
[0162]
表11pcr反应体系表
[0163][0164][0165]
表12pcr反应程序
[0166][0167]
注：各片段大小各不相同，所以pcr的延伸时间也不同p基因：1mi n30 s；egm123基因：30s。
[0168]
步骤十五、western b l ott ing检测重组病毒的结构蛋白和外源蛋白表达
[0169]
将重组病毒液与ri pa裂解液按1∶2混匀，在冰上置于30min裂解，用低温离心机4℃，12000r/min，离心10min。吸取上清蛋白液，加入5
×
蛋白上样buffer，99℃煮沸10min，待冷却后用高速低温离心机4℃，12000r/min，离心10min，进行sds-page电泳，其条件为：80v 30min跑浓缩胶再继续120v，跑分离胶至胶底。再将跑好的蛋白胶按照转膜方法印到0.45μm的pvdf膜中。在室温下用5％的封闭缓冲液封闭2h后，将pvdf膜分别于犬源细粒棘球绦虫egm123多抗、rabv-p蛋白多抗(1∶5000稀释)，rabv-g蛋白单抗(1∶2500)、4℃过夜孵育。tbst清洗3次，37℃分别孵育对应的二抗，曝光观察抗原抗体结合结果。
[0170]
步骤十六、透射电子显微镜观察重组病毒的形态
[0171]
分别取过滤收集的重组病毒液1ml，按照同步接毒的方法，将病毒感染到bsr细胞中。待细胞铺满细胞培养瓶底，消化收集细胞样本于灭菌的2ml ep管中，经样品固定、脱水、包埋渗透再进行修块结束后，在透射电子显微镜下观察结果。
[0172]
试验结果与分析：
[0173]
一、狂犬病病毒srv9株n结构基因的鉴定
[0174]
通过菌液pcr鉴定引物和内切酶xhoⅰ/ecorⅰ对提取的重组质粒pcdna3.1-n进行扩增和双酶切鉴定，都能获得预计大小1365bp的目的条带(见图4、和图5)。将把酶切鉴定的质粒产物送去测序，序列比对结果为100.00％。
[0175]
二、狂犬病病毒srv9株p结构基因的鉴定
[0176]
通过菌液pcr鉴定引物和内切酶xhoⅰ/ecorⅰ对提取的重组质粒pcdna3.1-p进行扩增和双酶切检测，都能获得预计大小1107bp的目的条带(见图6、图7)。将把酶切鉴定的质粒产物送去测序，序列比对结果为100.00％。
[0177]
三、狂犬病病毒srv9株l结构基因的鉴定
[0178]
通过菌液pcr鉴定引物和内切酶ecorⅰ/bamhⅰ双酶切方法，分别对提取的重组质粒pcdna3.1-l进行扩增和双酶切鉴定，都能获得预计大小6471bp目的基因条带。(见图8、图9)。将把酶切鉴定的质粒产物送去测序，序列比对结果为100.00％。
[0179]
四、狂犬病病毒n+p+m融合基因的鉴定
[0180]
将合成的融合基因n+p+m通过菌液pcr鉴定引物和内切酶xhoⅰ/bamhⅰ双酶切方法，分别对提取的重组质粒pcdna3.1-n+p+m进行pcr扩增和双酶切鉴定，都能获得预计大小3160bp的目的条带(见图10、图11)。将把酶切鉴定的质粒产物送去测序，序列比对结果为100.00％。
[0181]
五、狂犬病病毒g+egm123+egfp融合基因重组质粒的鉴定
[0182]
通过基因合成技术将srv9病毒g基因中连入外源基因egm123及增强型绿色荧光蛋白egfp构建融合基因片段，再经菌液pcr鉴定引物和内切酶ecor
ⅴ
/ecorⅰ双酶切方法，对融合基因重组质粒pcdna3.1-g+egm123+egfp进行鉴定。都能获得预计大小3256bp的目的条带(见图12、图13)。将把酶切鉴定的质粒产物送去测序，序列比对结果为100.00％。
[0183]
六、egm123基因重组狂犬病病毒srv9株感染性克隆全长cdna的鉴定
[0184]
将构建成功的pcdna3.1-n+p+m+g+egm123+egfp+l重组质粒经菌液pcr鉴定引物和内切酶bamhⅰ/xhoⅰ双酶切方法对感染性克隆全长cdna重组质粒进行鉴定。都能获得12465bp目的条带(见图14、图15)。将把酶切鉴定的质粒产物送去测序，基因序列比对结果为100％。
[0185]
七、狂犬病病毒g+egm123+egfp重组质粒的酶切鉴定结果
[0186]
通过菌液pcr方法和ecor
ⅴ
/ecorⅰ双酶切方法，对狂犬病srv9病毒pcdna3.1-g+egm123+egfp重组质粒序列鉴定。菌液pcr基因扩增结果和双酶切结果一致，可用该质粒进行转染(见图16、图17)。
[0187]
八、荧光显微镜观察g+egm123+egfp融合蛋白的表达结果
[0188]
将重组质粒pcdna3.1-g+egm123+egfp与lipo6000
tm
转染试剂在dmem中混匀进行bsr细胞转染，48h后在荧光显微镜下观察，发现转染重组质粒的试验孔出现明显的绿色荧光，而在对照组并未发现绿色荧光，表明狂犬病病毒g+egm123+egfp重组质粒转染成功(见图18)。
[0189]
九、狂犬病病毒g+egm123+egfp融合蛋白的表达结果
[0190]
将转染后48h的试验孔和对照孔同时裂解收取蛋白，配制8％的分离胶和5％的浓缩胶，按每孔20μl蛋白样品上样，经sds-page电泳跑胶，染色2h，考马斯亮蓝脱色液过夜脱色结果显示，在120kda处有明显的条带，而对照组没有条带，表明狂犬病病毒g+egm123+egfp融合蛋白成功表达(见图19)。
[0191]
十、狂犬病病毒g+egm123+egfp融合蛋白的western b lott i ng检测结果
[0192]
将变性后的g+egm123+egfp蛋白样品按每孔20μl加入聚丙烯酰胺凝胶孔中，其加样顺序为蛋白marker、g+egm123+egfp蛋白，再重复此加样顺序两次后，80v跑40min，120v跑
至胶底，取出跑好的凝胶，按照蛋白marker条带大小切取100kda以上的位置，在恒流300ma条件下转移到pvdf膜上，室温封闭2h，再依着彩虹蛋白marker条带位置用剪刀剪成三段，分开孵育g、egm123、gfp蛋白一抗和二抗，曝光结果显示，三种蛋白在120kda处出现抗原抗体结合条带，预期大小一致，表明狂犬病病毒g+egm123+egfp融合蛋白成功表达并具有免疫原性(见图20)。
[0193]
十一、狂犬病病毒srv9毒株n蛋白的western b lott i ng检测结果
[0194]
将pcdna3.1-n重组质粒与lipo6000
tm
转染试剂在dmem中混匀进行bsr细胞转染，48h后裂解细胞，用超声破碎仪进行破碎使蛋白完全释放出来，然后进行sds-page电泳和转膜，室温封闭2h。以狂犬病病毒n蛋白抗体作为一抗，山羊抗兔作为二抗，进行wb鉴定(见图21)。
[0195]
十二、狂犬病病毒srv9毒株p蛋白的western b lott i ng检测结果
[0196]
将pcdna3.1-p重组质粒与lipo6000
tm
转染试剂在dmem中混匀进行bsr细胞转染，48h后裂解细胞，进行sds-page电泳和转膜，室温封闭2h。以狂犬病病毒p蛋白抗体作为一抗，山羊抗兔作为二抗，进行western b lott ing鉴定(见图22)。
[0197]
十三、辅助质粒和全长质粒的酶切鉴定结果
[0198]
将提取的无内毒素质粒pcdna3.1-p、pcdna3.1-n、pcdna3.1-l及egm123基因重组srv9病毒全长cdna重组质粒经对应的内切酶进行双酶切鉴定。双酶切结果显示，真核表达载体pcdna3.1与目的片段分离，均获得n-1365、p-1107、l-6644及全长12465bp的目的条带(见图23)。
[0199]
十四、荧光显微镜观察重组病毒拯救结果
[0200]
将重组病毒全长质粒和辅助质粒共转染bsr细胞48h后，在荧光倒置显微镜下观察可见区别于全长质粒发出的荧光信号的重组病毒感染荧光灶(见图24中的c)，而只转染全长质粒的细胞孔发出的荧光大多数为包围整个细胞的单个的荧光信号(见图24中的b)，反而在没有转染的正常bsr细胞孔中未观察到荧光信号(见图24中的a)。表明重组病毒srv
9-egm123-egfp毒株拯救成功。
[0201]
十五、rt-pcr检测重组病毒egm123基因和p基因结果
[0202]
将拯救的重组病毒收集-80℃反复冻融三次，离心收取的上清感染新的bsr细胞，待细胞长满后反复冻融收取的细胞液提取病毒总rna，以表4-6设计的两对引物细粒棘球绦虫egm123基因f/r和狂犬病病毒p基因f/r，进行rt-pcr检测。结果显示，感染的重组病毒能同时检测出细粒棘球绦虫egm123基因(594bp)(见图25中的a)以及狂犬病病毒结构基因p基因(893bp)(见图25中的b)。
[0203]
2.3.16wb检测外源蛋白及结构蛋白结果
[0204]
将收集的重组病毒液与ri pa裂解液裂解后的蛋白样品，经sds-page电泳跑胶后，分别于犬源细粒棘球绦虫egm123多抗、rabv-p蛋白多抗(1∶5000稀释)，rabv-g蛋白单抗(1∶2500)进行孵育，化学发光仪显色结果显示，rabv-g、rabv-p、egm123蛋白同时表达，其蛋白分子量大小为狂犬病病毒g蛋白在接近70kda处表达(见图26中的a)、狂犬病病毒p蛋白在40kda左右(见图26中的b)、细粒棘球绦虫egm123蛋白在25kda左右(见图26中的c)，都与预期大小一致。
[0205]
十七、重组病毒的透射电子显微镜观察结果
[0206]
将重组病毒样品聚合到制样板中进行包埋、等样品完全凝固后进行修块、再在超薄切片机中切片进行干燥处理后，在透射电子显微镜下进行观察，清晰可见拯救的重组病毒srv
9-egm123-egfp出现跟弹状病毒相似的子弹状形态结构(见图27)，表明细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9毒株拯救成功。
[0207]
通过本发明的上述试验及试验结果：
[0208]
(1)本发明为了通过反向遗传学技术构建egm123基因重组狂犬病病毒srv9株疫苗株，利用狂犬病病毒srv9株全基因组序列，分别合成狂犬病病毒结构基因n、p、l、n+p+m融合基因和狂犬病病毒g基因插入外源基因细粒棘球绦虫egm123和egfp融合基因，经酶切连接方法，连接于pcdna3.1(-)表达载体中，构建egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的感染性克隆全长cdna。质粒双酶切、序列测序比对结果显示，狂犬病病毒n、p、l、n+p+m、g+egm123+egfp基因片段大小分别为1541、1107、6644、3160、3256bp；构建的全长cdna大小为12465bp。各基因序列测序比对结果为100％。
[0209]
(2)本试验将测序鉴定的辅助质粒n、p以及g基因插入外源基因egm123及绿色荧光蛋白egfp基因的重组质粒，为检测在bsr细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性的鉴定，将已成功构建的pcdna3.1-g+egm123+egfp及辅助质粒pcdna3.1-n、pcdna3.1-p利用脂质体转染方法转染bsr细胞，使其在bsr细胞中有表达，并通过荧光倒置显微镜观察、蛋白电泳、wb试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量，免疫原性以及狂犬病病毒srv9毒株n、p蛋白的蛋白表达情况。pcdna3.1-g+egm123+egfp重组质粒转染结果显示，转染48h后，在荧光倒置显微镜观察，有大量的的绿色荧光蛋白的表达；通过蛋白电泳结和wb结果显示，重组质粒在bsr细胞中有表达；将蛋白凝胶转移pvdf膜，分别经狂犬病病毒g蛋白单克隆抗体、egm123多克隆抗体、gfp单克隆抗体分别孵育，均在120kda处可见抗原抗体结合条带。转染后的辅助质粒pcdna3.1-n、pcdna3.1-p通过wb鉴定结果显示，结构蛋白n、p分别在55kda和40kda左右处可见抗原抗体结合条带。
[0210]
(3)本试验将狂犬病病毒srv9毒株作为载体，构建成的srv9-egm123-egfp全长cdna重组质粒与辅助质粒pcdna3.1-n、p、l共同转染表达rna聚合酶的bsr细胞，拯救出重组病毒“srv9-egm123-egfp”。通过荧光倒置显微镜、rt-pcr、wb试验、透射电子显微镜检测拯救的重组病毒结果显示，在荧光倒置显微镜下，能看到病毒感染的荧光灶，rt-pcr和wb结果显示拯救的重组病毒中可检测出结构基因p、g和外源基因egm123，在透射电子显微镜下观察结果显示，拯救的重组病毒具有弹状病毒相似的形态。将拯救成功的一株携带增强型绿色荧光蛋白egfp的狂犬病病毒g基因重组细粒棘球绦虫egm123基因的重组病毒，为研制“狂犬病和包虫病二联基因重组疫苗”提供疫苗毒株。
[0211]
通过本发明的上述实施例，本发明的方法与现有技术相比具备的优势为：目前，国际上对于包虫病疫苗的研制主要是针对中间宿主(牛、羊)，而对感染源头(犬)的疫苗研制较少，以至于包虫病长期不能净化的重要原因。因此，本发明利用反向遗传学方法构建的“egm123基因重组狂犬病病毒”，可携带狂犬病病毒和细粒棘球蚴两种抗原蛋白，将重组病毒制备口服疫苗用于免疫犬科动物，可诱导机体产生粘膜免疫效果，阻止肠道对细粒棘球蚴的感染和发育，显著减少包虫病的发病率。不仅可以预防狂犬病，还可以从源头上预防包虫病的发生。从而，为解决我国广大农牧区群众和养殖动物免受包虫病的威胁，在我国西北五省和内蒙古等农牧区的应用前景和社会效益极为显著。
[0212]
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，其特征是：采用病毒反向遗传学技术，构建狂犬病病毒srv9的结构蛋白n、p、l基因、n-p-m基因融合片段、g+egm123+egfp基因融合片段重组于pcdna3.1(-)表达载体上，构建egm123基因重组狂犬病srv9病毒全长cdna；将构建成的srv9+egm123全长cdna重组质粒与辅助质粒pcdna3.1-n、p、l共同转染表达rna聚合酶的bsr细胞，拯救出egm123基因重组狂犬病病毒，并对重组病毒的滴度、形态和免疫原性进行测定；具体包括以下步骤：s1、狂犬病病毒srv9毒株n、p、l结构基因的合成与重组质粒的构建；s2、狂犬病病毒srv9毒株融合基因n+p+m、g+egm123+egfp的合成与重组质粒的构建；s3、egm123基因重组狂犬病病毒srv9株感染性克隆全长cdna的构建；s4、各质粒菌液活化及菌液鉴定；s5、质粒dna的提取及酶切鉴定；s6、pcdna3.1-g+egm123+egfp、n、p重组质粒的提取；s7、pcdna3.1-g+egm123+egfp、n、p重组质粒的转染；s8、sds-page电泳检测g+egm123+egfp融合蛋白的表达；s9、westernblotting检测g+egm123+egfp融合蛋白的表达；s10、westernblotting检测狂犬病病毒srv9毒株n、p蛋白的表达；s11、重组病毒全长和辅助无内毒素质粒的大量提取及鉴定；s12、bsr细胞的复苏与冻存；s13、细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的拯救；s14、srv9-egm123-egfp重组病毒的rt-pcr检测。2.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，其特征是：步骤s1具体为：参照狂犬病病毒srv9毒株全基因组序列(genbank登录号：af499686)，通过基因合成技术分别合成了狂犬病病毒srv9株结构基因n、p、l，并将合成的结构基因l基因的3’端位置，下游bamhⅰ酶切位点之前引入了丁型肝炎核酶(hdvrz)序列，其大小为173bp；分别将合成的基因片段n、p基因序列插入限制性核酸内切酶xhoⅰ/ecorⅰ，狂犬病病毒l基因加入限制性核酸内切酶ecorⅰ/bamhⅰ；经双酶切连接方法连于真核表达载体pcdna3.1-中；将构建好的重组质粒pcdna3.1-n、pcdna3.1-p、pcdna3.1-l通过菌液pcr以及双酶切鉴定。3.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，其特征是：步骤s2具体为：采用基因合成技术分别合成狂犬病病毒srv9株n+p+m融合基因和g基因插入外源基因egm123及增强型绿色荧光蛋白egfp基因的融合片段基因g+egm123+egfp序列；将合成的n+p+m基因片段连入xhoⅰ/bamhⅰ酶切位点，g+egm123+egfp基因连入了ecor
ⅴ
/ecorⅰ酶切位点；在n+p+m基因的5’端位置，上游xhoⅰ酶切位点之后引入了锤头状核酶hamrz序列；在融合蛋白的基因序列之间分别连入了蛋白linker-(ggggs)2；将合成的基因片段连于真核表达载体pcdna3.1(-)，构建重组质粒pcdna3.1-n+p+m、pcdna3.1-g+egm123+egfp；经菌液pcr、双酶和测序序列比对鉴定构建好的重组质粒。4.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，
其特征是：步骤s3具体为：将基因合成的pcdna3.1(-)-n+p+m、pcdna3.1(-)-g+egm123+egfp、pcdna3.1(-)-l上的片段，通过酶切插入方法，依次连接至pcdna3.1(-)载体上，构建pcdna3.1(-)的全长重组载体pcdna3.1(-)-n+p+m+g+egm123+egfp+l，并在全长基因片段上连入xhoⅰ/bamhⅰ酶切位点，构建得egm123基因重组srv9病毒感染性克隆全长cdna重组载体，经菌液pcr、双酶和测序序列比对鉴定构建好的重组载体。5.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，其特征是：步骤s4具体为：a、菌液活化在无菌的环境中用吸头轻轻蘸取各质粒的甘油菌添加于1ml的不含amp+抗生素的lb液体培养基中，在37℃的恒温摇床中摇晃培养1h，使菌液活化；将复苏呈浑浊状的转化混合液吹打混匀，接种在平板中，培养14h之后观察平板上长出的单菌落，挑取形态正常的单菌落，进行摇菌扩繁至od600值为2.0-3.0之间，再进行菌液pcr鉴定、酶切鉴定及测序；b、菌液pcr鉴定将过夜培养的菌液中吸取适量菌液，用菌液pcr鉴定引物扩增每个基因片段。6.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，其特征是：s5具体为：a、重组质粒dna的提取将摇菌扩繁后的菌液按照天根质粒提取试剂盒说明书严格按照步骤操作，测定浓度后，用1.0％的dna琼脂糖凝胶电泳125v，30min进行跑胶，电泳结束后在凝胶成像系统中观察重组质粒dna结果；电泳剩下的质粒dna产物进行下一步的酶切鉴定和测序验证；b、重组质粒dna双酶切鉴定将提取完成的重组质粒在200μl的ep管中加入酶切体系，并在酶切程序下进行双酶切鉴定。7.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，其特征是：步骤s6具体为：将构建的pcdna3.1-g+egm123+egfp、n和p重组质粒分别吸出1μl，加入大肠杆菌dh5α细胞中，轻轻混合在冰上置于30min后立即放入42℃水浴中90s然后取出再冷却2min；再向冷却的管中加入900μl无菌的不含任何抗生素的lb培养基，充分混合；在37℃的摇床中摇晃培养50min，吸收100μl转化的产物，均匀涂于lb固体琼脂培养基上，在37℃培养过夜；选择单克隆菌，摇瓶繁殖，按照omega无内毒素质粒提取试剂盒的要求提取质粒，测定质粒浓度，进行pcr和双酶消化鉴定。8.如权利要求1所述的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，其特征是：步骤s7具体为：取状态良好的bsr细胞传到六孔板内，待细胞密度达到80％时，用10％fbs的dmem给细胞换液；并配制质粒pcdna3.1-g+egm123+egfp、pcdna3.1-n、pcdna3.1-p的dna复合物，依次进行转染；步骤s8具体为：将转染48h后的六孔板弃掉培养液，用pbs洗3次，每孔加入ripa细胞裂解液于250μl，为防止蛋白降解在冰上置于30min，在超声破碎仪每分钟超声3s停留5s，总共
超声3min；4℃，10000r/min离心10min，取上清加到新的离心管；加入蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min，4℃离心10min，-20℃保存备用；配制sds-page凝胶，每孔加入20μl样品进行电泳，电泳结束后进行染色和脱色，观察蛋白表达情况。9.如权利要求8所述的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法，其特征是：步骤s9具体为：将变性后的蛋白样品每孔加20μl进行sds-page电泳，电泳结束用转膜仪把跑好的蛋白胶转移到0.45μm的pvdf膜中；在25℃用5％的封闭缓冲液封闭2h，然后把pvdf膜分成三段分别于rabv-g蛋白多抗、gfp单抗和细粒棘球绦虫egm123多抗在4℃过夜孵育；tbst清洗3次，37℃分别孵育hrp标记的山羊抗兔子igg、hrp标记的山羊抗小鼠igg、hrp标记的兔抗狗igg2h后，tbst清洗3次，曝光观察抗原抗体结合结果；步骤s10具体为：将狂犬病病毒srv9毒株n、p蛋白转染48h后的六孔板弃掉培养液，用pbs洗3次，每孔加入ripa细胞裂解液于250μl，在冰上置于30min；在超声破碎仪中每分钟超声3s停留5s，总共超声3min；4℃，10000r/min离心10min，取上清加到新的离心管；加入蛋白上样缓冲液，100℃水煮10min，4℃离心10min，-20℃保存备用；配制10％的sds-page凝胶，每孔加入20μl蛋白样品，进行电泳，跑好的蛋白胶用转膜仪转到pvdf膜中；将pvdf膜分别于rabv-n、rabv-p蛋白多抗在4℃过夜孵育；tbst清洗3次，37℃分别孵育hrp标记的山羊抗兔子igg2h后，tbst清洗3次，曝光观察抗原抗体结合结果；步骤s11具体为：将提取并鉴定过的重组质粒pcdna3.1-n、pcdna3.1-p、pcdna3.1-l和全长，经质粒转化方法转到dh5α中，培养12h；从中挑取一个单独的菌落和氨苄抗生素在37℃下，摇晃培养16h；从过夜培养的菌液中吸取200μl，测定在od600下的细菌浓度；再用omega无内毒素质粒提取试剂盒严格按照使用说明书来进行大量提取；步骤s12具体为：预先准备一个42℃的水浴，然后将待解冻的bsr细胞从液氮中取出来，快速放到准备好的温水中使细胞溶液熔化，并在无菌条件下以1000r/min的转速将熔化的细胞溶液离心10min；丢弃上清液，添加1ml10％fbs细胞培养基，重新悬浮，并以1000r/min的转速离心10min；吹打并混合离心的细胞团，将其转移到新的干净的细胞瓶中，并将其置于37℃，5％的co2培养箱中培养；胰蛋白酶消化后，加入2ml10％fbs细胞培养基终止消化，转移至5ml离心管，1000r/min离心10min；丢弃上清液，加入制备好的冷冻保存液，悬浮细胞并将其转移到冷冻保存管中；梯度冷却后，放入液氮中长期保存；步骤s13具体为：(1)在转染前一天将状态良好的bsr细胞传到六孔板内，使第二天细胞密度达到约70％-90％时，把原有的培养液倒掉，换成每孔2ml的不含任何抗生素只含由有血清的新鲜培养液；(2)按照转染质粒用量将质粒依次加入离心管中，并按照病毒拯救流程进行重组病毒的拯救；步骤s14具体为：(1)引物设计与合成；(2)重组病毒总rna的提取；(3)重组狂犬病病毒p基因和外源基因egm123的rt-pcr检测。10.如权利要求1-9任意一项所述的细粒棘球绦虫egm123基因重组狂犬病病毒srv9株的构建方法在制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗上的应用。

技术总结
本发明公开了细粒棘球绦虫EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9株的构建方法，涉及重组狂犬病病毒技术领域，其技术要点为：采用病毒反向遗传学技术，构建狂犬病病毒SRV9的结构蛋白N、P、L基因、N-P-M基因融合片段、G+EgM123+eGFP基因融合片段重组于pcDNA3.1(-)表达载体上，构建EgM123基因重组狂犬病SRV9病毒全长cDNA；将构建成的SRV9+EgM123全长cDNA重组质粒与辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L共同转染表达RNA聚合酶的BSR细胞，拯救出EgM123基因重组狂犬病病毒，并对重组病毒的滴度、形态和免疫原性进行测定。本发明的方法能够为研制“狂犬病和包虫病二联基因重组疫苗”提供疫苗毒株。提供疫苗毒株。提供疫苗毒株。


技术研发人员：翟少华
受保护的技术使用者：新疆农业大学
技术研发日：2023.02.02
技术公布日：2023/8/14