一种利用二氧化碳产琥珀酸的基因工程菌及其构建方法与应用

1.本发明涉及一种产琥珀酸的基因工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.琥珀酸（丁二酸），是三羧酸循环（tca）的中间代谢产物。作为一种重要的四碳平台化合物，琥珀酸是生产食品添加剂、表面活性剂、离子螯合剂等的原料，在食品、洗涤等行业得到广泛应用，因而被美国能源部评选为21世纪最具潜力的12种大宗化学品之首，具有广阔的市场前景。为生产琥珀酸，已经开发了多种化学合成方法，但是由于反应条件要求高、生产安全系数低、石油资源浪费严重等问题，化学合成琥珀酸的弊端逐渐显现；相比之下，通过微生物发酵生产琥珀酸，能够减少对不可再生石油资源的利用，还能够固定大气中的二氧化碳以减轻温室效应，具有环境友好型和可持续发展等优点，展现出良好的发展前景，受到广泛的关注。
3.目前，已经筛选并构建多种微生物菌株用于琥珀酸的生物合成，主要有产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌等。产琥珀酸放线杆菌是一种天然的产琥珀酸菌株，可以利用五碳糖、六碳糖、双糖以及其它碳源生物合成琥珀酸。菌株a.succinogenesfz53利用酵母提取物或者玉米浆为氮源，琥珀酸产量、得率以及生产强度分别提高到105.8 g
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、0.54 g
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葡萄糖和1.36 g
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。但是，关于该菌相应的基因改造手段相对缺乏，且发酵过程中需要复杂的营养条件，这限制了其工业化生产。产琥珀酸曼氏杆菌也是一种天然的琥珀酸生产菌株，能够固定二氧化碳并以琥珀酸作为主要发酵产物。lee等人通过改造苹果酸脱氢酶和高密度发酵策略使菌株m.succiniciproducenspalk-cgmd琥珀酸产量提高到134.25 g
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，最高生产强度为21.3 g
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。但是该菌株是氨基酸和维生素的两类营养缺陷型菌株，需要外源添加多种氨基酸和维生素维持菌体的生长和代谢。酿酒酵母通常不以琥珀酸作为发酵终产物，虽然可以利用基因手段对该菌株进行改造，但是到目前为止酿酒酵母仍不能高水平生产琥珀酸。van等通过代谢工程得到菌株s.cerevisiaesuc-297，通过有氧补料分批发酵琥珀酸产量为43.0 g
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，得率仅为0.45 g
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葡萄糖。以谷氨酸棒状杆菌作为模式菌株，培养条件简单、易改造、易操作等特点，成为生物法产琥珀酸的研究热点之一。inui等人通过代谢分析及代谢工程菌构建使得好氧的谷氨酸棒状杆菌在厌氧条件下将葡萄糖转化为燃料乙醇或者乳酸或者丁二酸甚至还能用于丙酮酸等的发酵生产。
4.谷氨酸棒状杆菌通过糖酵解途径将葡萄糖转化为磷酸烯醇式丙酮酸（pep），pep与1分子co2羧合成草酰乙酸（oaa），然后进入tca循环，最终合成琥珀酸。co2对琥珀酸合成效率有关键性影响，也是合成琥珀酸的必备底物之一。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的直接底物是hco
3-，过表达碳酸酐酶的菌株能提高co2分子与hco
3-离子之间在细胞内的转化速率，使通过自由扩散进入细胞内的co2分子更快的转化为hco
3-离子，增强了hco
3-离子的供给力度，从而
使琥珀酸的产量得以提高。可见高浓度的hco
3-是促进琥珀酸合成的有力保证，co2的积累对琥珀酸生产亦至关重要。虽然采用谷氨酸棒状杆菌发酵琥珀酸的研究已取得了众多进展，但是目前仍缺乏有效的策略促进细胞对co2的吸收和利用。
5.对比文件1（授权公告号cn 107227286 b）：在大肠杆菌中以葡萄糖和甲醇作为共同碳源在细胞水平上增强还原力的供给，并利用厌氧发酵驱动琥珀酸的高效合成。首先，本专利与对比文件1所用菌株不同。其次，本专利以葡萄糖为碳源，并且主要研究关键点是如何在细胞水平上加强tca循环中对co2的吸收和利用。对比文件2（授权公告号cn 105838632 b）：以酿酒酵母为出发菌株，用苹果酸脱氢酶基因替换乙醇代谢途径中的丙酮酸脱羧酶基因pdc1，并敲除琥珀酸代谢途径中的琥珀酸脱氢酶基因sdh2，最终构建产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌。而本专利是以引入外源基因的方式构建利用二氧化碳产琥珀酸的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌株。对比文件3（授权公告号cn 101381740 b）：该发明将蓝藻的碳酸酐酶基因克隆到质粒载体pet-21a上，再将重组后的质粒转入bl21(de3)中，以达到通过提高蓝藻碳酸酐酶基因的拷贝数从而提高大肠杆菌bl21(de3)的co2固定能力，提高琥珀酸产量的目的。区别于对比文件3，本专利一方面通过过量表达菌株本身的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因增强co2的固定。另一方面，在工程菌中表达蓝藻的hco
3-转运子，加强工程菌对co2的吸收利用效率，实现琥珀酸产量和产率的提高。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供一种产琥珀酸的基因工程菌，通过在谷氨酸棒状杆菌中表达蓝藻中的hco
3-转运子使其具有主动转运hco
3-的能力，再过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc）增强co2的固定。从而促进谷氨酸棒状杆菌对co2和hco
3-的吸收利用，提高琥珀酸的产量和产率。
7.本发明的第一个目的是提供一种产琥珀酸的基因工程菌，所述的产琥珀酸的基因工程菌是在谷氨酸棒状杆菌中表达hco
3-转运子sbta和bica，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码关键基因ppc。
8.进一步地，所述的谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌atcc14997，保藏单位全称为上海保藏生物技术中心，简称：shbcc，其保藏编号：shbcc d10783（或其它编号ccrc 11679、atcc14997）。
9.进一步地，所述的hco
3-转运子sbta核苷酸序列如seqidno.1。所述的hco
3-转运子bica核苷酸序列如seqidno.2。所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc核苷酸序列如seqidno.3。
10.进一步地，所述的产琥珀酸的基因工程菌是以谷氨酸棒状杆菌atcc13032、谷氨酸棒状杆菌atcc14997、谷氨酸棒状杆菌atcc21831或谷氨酸棒状杆菌atcc21528为宿主菌。
11.进一步地，所述的产琥珀酸的基因工程菌是以pucm-t作为表达载体。为实验室保存的载体。
12.本发明的第二个目的是提供所述的产琥珀酸的基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：重组质粒构建：将microcystisaeruginosa uvav163的hco
3-转运子sbta和bica；corynebacterium glutamicum磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc，与表达载体pucm-t连接在一
ppc-sbta-bica的构建过程，具体如下：使用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取microcystisaeruginosauvav163和corynebacterium glutamicum atcc14997的基因组，并以microcystisaeruginosa uvav163基因组为模板分别使用sbta基因引物（f1和f2）和bica基因引物（f3和f4）pcr扩增出sbta、bica的片段；以corynebacterium glutamicum atcc14997的基因组为模板，使用ppc（f5和f6）基因引物pcr扩增出ppc的片段。
28.引物序列（seqidno.4~9）f1：gtggattttttctcattgtttgtcaf2：ttagccgccgctgagggcf3：atgcaaataaccaatcgtactcatttf4：ttaccccttaagcaaacctgttgf5：atgactgattttctacgagatgacf6：ctagccggagttgcgcag利用一步克隆试剂盒将sbta/bica/ppc片段分别与载体pucm-t连接在一起从而构建pucm-t-sbta-bica-ppc重组质粒，然后将重组质粒转入到大肠杆菌dh5α中，通过含氨苄的抗性平板筛选正确的阳性转化子并测序验证，得到测序正确的质粒。通过电击转化法分别将测序正确的重组质粒转入目的菌株l1206（谷氨酸棒状杆菌atcc14997）中，在抗性平板上筛选的阳性单克隆，提取基因组进行pcr验证并测序，获得目的重组菌株。
29.实施例2：基因工程菌发酵产琥珀酸及其检测种子培养基：葡萄糖12 g/l，kh2po
4 5 g/l，k2hpo4·
3h2o 15 g/l，mgso4·
7h2o 0.4 g/l，mnso4·
h2o 0.2 g/l，feso4·
h2o 0.2 g/l，尿素25 g/l，生物素100 μg/100ml，维生素b
1 200 μg/100ml，ph6.8-7.2。
30.发酵培养基：葡萄糖38 g/l，nahco
3 35 g/l，nacl 9 g/l，ph6.8-7.2。
31.重组菌株发酵好氧培养产琥珀酸的基因工程菌：将改造后的重组菌株在相应抗性平板上划单克隆；然后将平板上单克隆转接到20 ml加有相应抗性的种子培养液中，30~32℃有氧培养10~12 h，获得种子培养液。
32.重组菌株厌氧转化产酸：将种子培养液按照10%（v/v）接种到发酵培养基中，培养至对数生长期末期转为厌氧发酵，该过程中分批添加nahco3/na2co3，避免一次过量添加引起ph的大幅变化。培养温度为30~35℃；培养时间为40~50 h；转速为180~200 rpm/min。
33.重组菌株中发酵产物的检测菌体密度的检测：取不同发酵时间点的发酵液，稀释相应倍数，采用紫外分光光度计测定发酵液中菌体的密度，波长选定600 nm，以新鲜的发酵培养基作为空白对照，测定od值。
34.残糖和有机酸的检测：取1 ml不同发酵时间点的发酵液样品，在8000 rpm/min下离心10 min，去除离心管的底部沉淀，取上清液500 μl稀释相应倍数，然后用0.22 μm的亲水膜过滤后用于测定残糖量及有机酸等发酵产物量。残糖量和有机酸采用高效液相色谱法（hplc）检测。仪器为
waters e2695反相高效液相色谱仪，色谱柱采用bio-radhpx87h；流动相为4 mmol/l h2so4（ph2.5）；流速设定为0.5 ml/min；检测器为waters 2998 pdadetector，waters 2424 elsdetector；柱温为40℃。

技术特征：
1.一种产琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述的产琥珀酸的基因工程菌是在corynebacterium glutamicum中表达microcystisaeruginosa uvav163的hco
3-转运子sbta和bica，过表达corynebacterium glutamicum磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc。2.根据权利要求1所述的产琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述的产琥珀酸的基因工程菌是以谷氨酸棒状杆菌atcc13032、谷氨酸棒状杆菌atcc 14997、谷氨酸棒状杆菌atcc21831或谷氨酸棒状杆菌atcc21528为宿主菌。3.根据权利要求1所述的产琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述的产琥珀酸的基因工程菌是以pucm-t作为表达载体。4.一种权利要求1-3任一项所述的产琥珀酸的基因工程菌的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：重组质粒构建：将microcystisaeruginosa uvav163的hco
3-转运子sbta和bica；corynebacterium glutamicum磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc，与表达载体pucm-t连接在一起，获得表达载体pucm-t-sbta-bica-ppc。5.基因工程菌制备：将表达载体pucm-t-sbta-bica-ppc转入宿主菌中，筛选获得所述的产琥珀酸的基因工程菌。6.权利要求1-3任一项所述的产琥珀酸的基因工程菌在生产琥珀酸中的应用。

技术总结
本发明公开了一种产琥珀酸的基因工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域；本发明还提供了该菌株的构建方法与发酵生产琥珀酸的方法。通过在谷氨酸棒状杆菌中表达蓝藻的HCO


技术研发人员：王乐 李忠增
受保护的技术使用者：河南工业大学
技术研发日：2023.01.30
技术公布日：2023/8/14