一种有利于肥胖男性生殖健康的益生菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物应用技术领域，特别涉及一种有利于肥胖男性生殖健康的益生菌及其应用，具体为格氏乳杆菌（lactobacillus gasseri ）的一个新菌株lg-g12及其在（肥胖）男性生殖健康方面的应用。


背景技术：

2.格氏乳杆菌（lactobacillus gasseri）的主要生存环境为人体口腔、肠道、阴道、动物肠道及临床标本等。它是人体肠道正常的益生菌之一。格氏乳杆菌有很多不同的菌株，不同的菌株在人体及肠道内会起到不同的作用；格氏乳杆菌的作用和功效主要是帮助肠道消化和吸收,有效的帮助清理胃内食物,避免胃酸分泌过多,减轻胃肠道压力 ,可以有效的帮助肠道蠕动,调节肠道菌群,达到更好的治疗效果。能有效改变各类型过敏,包括:过敏性鼻炎、结膜炎、异位性皮肤炎、荨麻疹、食物、花粉等各种过敏症状；调整过敏体质，预防宝宝过敏；预防感冒,降低细菌及病毒(肠病毒、鼻病毒、呼吸道融合病毒)感染等等。近年有报道格氏乳杆菌在高尿酸领域，在肥胖等等领域的应用。近年来越来越多的研究结果发现,肥胖对男性、女性及雄、雌性实验鼠的生殖系统均有明显的负面效应。如肥胖可增加男性患前列腺癌的风险,并可引起性功能和精液质量的下降;对女性而言,肥胖可增加患多囊卵巢综合征的风险、并可引起生育力和卵细胞质量的下降;此外,肥胖还对儿童青少年的生长发育带来极大的危害。综述肥胖对生殖内分泌代谢、生殖器官形态学、性功能及生殖细胞发育等方面的影响。
3.但是在关于益生菌在生殖健康，尤其是在肥胖男性的生殖健康方面的作用鲜有报道。而今，肥胖已经成为一种时代病。肥胖症引起的生殖健康也不容忽视。而肥胖症与肠道菌群的关系是肥胖治疗的一个有希望的靶点。因而开发出有助于肥胖人群生殖健康的某种益生菌，具有一定的市场前景。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供一种有利于肥胖男性生殖健康的益生菌及其应用，并利用该方法和技术为缓解肥胖和提高肥胖男性的生殖健康带来新的潜在方法和技术。
5.本方法和技术所涉及到的益生菌及生物制剂为格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)的一个新菌株lg-g12。保藏编号cctcc no:m2019829，该格氏乳杆菌具有一定优异性能。该菌于2019年10月17日被中国典型培养物保藏中心收悉。中国典型培养物保藏中心地址是湖北省武汉市武昌区珞南一路与育才路交叉口北50米(八一路299号)。2019年11月1日存活性检测结束。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明还具有以下附加技术特征：本发明还提供上述的格氏乳杆菌lg-g12在肥胖男性生殖健康中的应用，将所述格氏乳杆菌lg-g12制备成生物制剂使用，所述生物制剂的制备过程包括菌种活化、种子培养、
发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎、复配混合及后道加工。
7.优选的，所述生物制剂还包含食品上和药学上可接受的辅料，在所述的复配混合步骤中加入。
8.优选的，所述辅料为麦芽糊精、抗性糊精、羟乙基纤维素，山梨糖醇，乳糖醇、柳橙水果粉，菊粉，低聚异麦芽糖，低聚果糖、全脂乳粉，乳粉，奶味香精中的一种或几种。
9.优选的，所述生物制剂为粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、液体剂或胶囊剂。
10.优选的，所述生物制剂的每剂中含有至少300亿cfu所述的格氏乳杆菌lg-g12活菌。
11.优选的，所述生物制剂的每剂重量为0.5~10.0克。
12.优选的，将所述的格氏乳杆菌lg-g12活菌与抗生素搭配使用。
13.优选的，所述的抗生素为头孢曲松钠。
14.优选的，所述生物制剂还包含食品上和药学上可筛选接受的辅料。
15.优选的，所述生物制剂为粉剂为颗粒剂。
16.优选的，所述生物制剂的每剂中含有至少300亿格氏乳杆菌lg-g12活菌。
17.优选的，该菌用于改善肥胖病患的棕色脂肪含量，有减肥塑身作用。
18.优选的，对于的60公斤成年的人体，每天的服用量约为含3000亿该格氏乳杆菌lg-g12活菌的制剂产品。
19.优选的，在服用相应的抗生素后再服用上述生物制剂仍可达到较好的效果，其目的是消灭体内一些容易导致肥胖的革兰氏阴性细菌。
20.优选的，上述抗生素采用头孢曲松钠，服用时间为2周。
21.优选的，服用上述生物制剂时间不低于2周。
22.每天的服用量约为含60~1200亿该格氏乳杆菌lg-g12活菌的制剂产品。进一步的优选80~600亿。
23.优选的，在服用上述生物制剂增加褐色脂肪组织前，可服用相应的抗生素2周。用量为体重的约0.00025~0.0017%。（即60公斤体重的人，服用0.15~1g的量。）进一步可优选0.2g的用量。其目的是消灭体内一些容易导致肥胖的革兰氏阴性细菌。
24.具体的，格氏乳杆菌lg-g12生物制剂的获得方法包括如下步骤：格氏乳杆菌lg-g12获取来源是：健康人体。
25.格氏乳杆菌lg-g12保藏编号cctcc no:m2019829。
26.经中国科学院微生物研究所鉴定结果为格氏乳杆菌lactobacillus gasseri 。
27.菌剂制备过程主要包括菌种活化，种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎、包装等过程。
28.种子培养：格氏乳杆菌lg-g12的培养方法为：在一定培养基的条件下，进行相对厌氧培养。培养温度为35-39℃。优选36.5-37.5℃。其中三角瓶采用静置培养的方式，添加1%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制ph值。
29.发酵培养：发酵罐采用通入非氧气不活泼气体（如纯度在99%以上的氮气等等），并保持罐压为0.02-0.1mpa。优选0.03-0.08mpa罐压条件下培养。发酵起始ph值控制在6.5
±
0.2范围内，后期发酵过程的ph值控制在5.4
±
0.2范围内，偏酸时采用碱液（如20%~25%的氢氧化钠或氨水中的一种或二种）流加控制，使得ph值控制在5.4
±
0.2范围内。在菌体繁殖生
长的对数期末期或稳定期初期，结束发酵。
30.基础培养基：葡萄糖，2~6%；牛肉浸粉，0.5~1%；蛋白胨，0.6~1%；酵母膏，0.5~1.5%；无水乙酸钠，0.5%；磷酸氢二钾，0.2%；柠檬酸氢二铵，0.2%；吐温80，0.1%；七水硫酸镁，0.025~0.05%；一水硫酸锰，0.005~0.01%，其余为水，以上按质量体积分数计。
31.菌体收集：发酵结束后，将发酵液降温，然后收集菌体，通常可采用离心的方法获得菌体。
32.保护剂配置：菌体的基础保护剂为质量分数为20%脱脂乳粉+5%蔗糖。在考虑规避过敏性物料的情况下，采用海藻糖，菊粉、低聚果糖、蔗糖等非乳基及过敏性原料的组合物作为菌体保护剂。
33.乳化：将保护剂与混合均匀，得到乳化液。
34.真空低温冷冻干燥：将乳化液放入低温冷冻真空干燥设备（冻干机）进行真空低温冷冻干燥，获得菌饼。
35.粉碎：菌饼经过粉碎后，获得菌粉。菌粉的细度可通过调整粉碎机的筛网孔大小获得。
36.复配混合：菌粉再经复配添加剂，混合及后道加工，获得本发明的生物制剂（菌剂）物品。
37.后道加工：后续菌剂产品的形式包括粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、液体制剂、胶囊剂等相关形式。
38.物品经包装后，获得产品。
39.抗生素敏感实验：采用纸片扩散法测试格氏乳杆菌lg-g12对抗生素的敏感和耐受情况，了解该菌的抗生素的抗性特征。
40.结果为：对哌拉西林/他唑巴坦、大观霉素、青霉素、红霉素、氯霉素、阿奇霉素、多西环素、美罗培南、头孢三曲松、头孢克罗、头孢唑啉、头孢噻肟、氨卡西啉、头孢呋新、米诺环素、利福平、四环素、头孢他啶、头孢噻吩、头孢哌酮、氨苄西啉、苯唑西林、呋喃妥因表现敏感；对克林霉素、万古霉素、庆大霉素、表现为中度敏感。对环丙沙星、奈替米星、复方新诺明、阿米卡星等表现为有抗性。
41.有益效果：本发明和现有技术相比，其优点在于：本发明能改善肥胖小鼠附睾脂肪组织多少，使其维持在较为正常的含量上，为发挥其功能和维系正常生理功能打下基础。
42.本发明还能够改善肥胖小鼠的体脂结构，有效增加棕色脂肪的含量，利于塑身。
43.本发明还能改善肥胖小鼠肠道菌群结构，有效增加体内的益生菌群。提高体内益生菌群的丰度，间接的提高机体的抵抗力，并能塑身和减肥。
44.本发明从增加体内褐色脂肪组织和优化调节动物体内的微生物群，两个方向上改善或辅助治疗肥胖症。
45.本发明中的格氏乳杆菌lg-g12活菌制剂结合抗生素的适当使用，塑身减肥趋势效果更佳。
46.附图说明：图1：菌粉耐胃酸测试；
图2：菌粉耐不同浓度胆盐测试；图3：菌粉耐胆盐测试；图4：不同温度下菌粉的稳定性；图5：平均体重变化的测定，g1对照组，g2肥胖组，g3（潜在）益生菌组，g4抗生素组，g5抗生素+（潜在）益生菌组；图6：香浓指数；图7：辛普森指数；图8：菌落丰度指数；图9：门级别的分布情况及占比；图10：目级别的分布情况及占比；图11：科属级别的分布数量情况及占比。
具体实施方式
47.以下公开本发明的一些实施例，本领域技术人员可以根据本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
48.实施例1：格氏乳杆菌lg-g12菌粉制剂的获得方法：格氏乳杆菌lg-g12获取来源是：健康人体；格氏乳杆菌lg-g12保藏编号为cctcc no:m2019829；格氏乳杆菌lg-g12的培养方法为：在一定培养基的条件下，进行厌氧培养。培养温度为37℃
±
0.5℃。其中三角瓶采用静置培养的方式，添加1%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制ph值。发酵罐采用通入纯氮，并保持罐压为0.05
±
0.02mpa罐压条件下培养。发酵起始ph值控制在6.5
±
0.2范围内，后期发酵过程的ph值控制在5.4
±
0.2范围内，偏酸时采用碱液（25%的氢氧化钠）流加控制，使得ph值控制在5.4
±
0.2范围内。在菌体繁殖生长的对数期末，结束发酵。
49.培养基：按质量分数计，葡萄糖，4%；牛肉浸粉，0.6%；蛋白胨，1%；酵母膏，1.0%；无水乙酸钠，0.5%；磷酸氢二钾，0.2%；柠檬酸氢二铵，0.2%；吐温80，0.1%；七水硫酸镁，0.025%；一水硫酸锰，0.005%；其余为水。
50.发酵结束后，将发酵液降温至15℃以下，然后用离心机以1300l/h速度收集菌体。
51.菌体的基础保护剂为20%wt脱脂乳粉+5%wt蔗糖+75%wt水。
52.将保护剂与菌体按照质量比2: 1混合均匀，得到乳化液。
53.将乳化液放入低温冷冻真空干燥设备（冻干机）预冻到-45℃以下，进行真空低温冷冻干燥，获得菌饼。
54.菌饼经过粉碎后，获得菌粉。菌粉的细度可通过调整粉碎机的筛网孔大小获得，本例过60目筛网。
55.菌粉制备过程主要包括菌种活化，种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎包装等过程。
56.菌粉再经复配，混合及后道加工，获得本发明的生物制剂（菌剂）制品。
57.复配所用物料（以质量分数计）：菌粉45%；抗性糊精25%、麦芽糊精20%，低聚果糖6%，甜橙水果粉4%。
58.将上述复配的物料混合均匀后，充填于胶囊内，每粒胶囊净含量标准为500mg。经检测，该制品的活菌数为1.36*10
11
cfu/g。
59.经包装获得成品，菌剂产品的形式为固体胶囊。
60.实施例2：格氏乳杆菌lg-g12的培养方法为：培养温度为37℃，其中三角瓶采用静置培养的方式，添加1%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制ph值。发酵罐采用通入纯度在99%以上的氮气，并保持罐压为0.05mpa。发酵起始ph值控制在6.5
±
0.2范围内，后期发酵过程的ph值控制在5.4
±
0.2范围内，偏酸时采用碱液（20%的氢氧化钠）流加控制，使得ph值控制在5.4
±
0.2范围内。在菌体繁殖生长的稳定期初期，结束发酵。
61.基础培养基同实施例1。
62.实施例3：格氏乳杆菌lg-g12的培养方法为：培养温度为36.5℃，其中三角瓶采用静置培养的方式，添加1%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制ph值。发酵罐采用通入纯度在99%以上的氮气，并保持罐压为0.04mpa。发酵起始ph值控制在6.5
±
0.2范围内，后期发酵过程的ph值控制在5.4
±
0.2范围内，偏酸时采用碱液（15%氨水）流加控制，使得ph值控制在5.4
±
0.2范围内。在菌体繁殖生长的对数期末期或稳定期初期，结束发酵。
63.基础培养基：同实施例1。
64.实施例4：格氏乳杆菌lg-g12的培养方法为：培养温度为36℃，其中三角瓶采用静置培养的方式，添加1%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制ph值。发酵罐采用通入纯度在99%以上的氮气，并保持罐压为0.06mpa。发酵起始ph值控制在6.5
±
0.2范围内，后期发酵过程的ph值控制在5.4
±
0.2范围内，偏酸时采用碱液（20%的氢氧化钠与15%氨水混合物）流加控制，使得ph值控制在5.4
±
0.2范围内。在菌体繁殖生长的稳定期初期，结束发酵。
65.基础培养基：葡萄糖，6.0%；牛肉浸粉，1.0%；蛋白胨，1.0%；酵母膏，1.2%；无水乙酸钠，0.5%；磷酸氢二钾，0.2%；柠檬酸氢二铵，0.2%；吐温80，0.1%；七水硫酸镁，0.05%；一水硫酸锰，0.01%；其余为水。
66.实施例5：格氏乳杆菌lg-g12制剂的获得方法：格氏乳杆菌lg-g12获取来源是：健康人体；格氏乳杆菌lg-g12保藏编号为cctcc no:m2019829；格氏乳杆菌lg-g12的培养方法为：在一定培养基的条件下，进行厌氧培养。培养温度为37℃
±
0.5℃。其中三角瓶采用静置培养的方式，添加1%的碳酸钙在培养基中，培养过程不控制ph值。发酵罐采用通入纯氮，并保持罐压为0.05
±
0.02mpa罐压条件培养。发酵起始ph值控制在6.5
±
0.2范围内，后期发酵过程的ph值控制在5.4
±
0.2范围内，偏酸时采用碱液（25%的氢氧化钠）流加控制，使得ph值控制在5.4
±
0.2范围内。在菌体繁殖生长的对数期末，结束发酵。
67.基础培养基：葡萄糖，3%；牛肉浸粉，0.6%；蛋白胨，1%；酵母膏，0.8%；无水乙酸钠，
0.5%；磷酸氢二钾，0.2%；柠檬酸氢二铵，0.2%；吐温80，0.1%；七水硫酸镁，0.025%；一水硫酸锰，0.005%；其余为水。
68.发酵结束后，将发酵液降温到 15℃以下，然后收集菌体。
69.菌体的基础保护剂为海藻糖8%、蔗糖5%、菊粉3%、低聚果糖3%原料的组合物作为菌体保护剂。
70.将保护剂与菌体混合均匀，得到乳化液。
71.将乳化液放入低温冷冻真空干燥设备（冻干机）进行真空低温冷冻干燥。获得菌饼。
72.菌饼经过粉碎后，获得菌粉。菌粉的细度可通过调整粉碎机的筛网孔大小获得。
73.菌粉制备过程主要包括菌种活化，种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎包装等过程。
74.菌粉再经复配，混合及后道加工。获得本发明的生物制剂（菌剂）制品。
75.菌粉与配料均过60目筛。
76.复配配方为：菌粉48%；抗性糊精25%、麦芽糊精15%，聚葡萄糖4%，苹果粉4%，香蕉粉2%。混合均匀后。经检测，该制品的活菌数为1.28*10
11
cfu/g。
77.经包装获得成品。产品的形式为过60目的细粉固体粉剂形式。
78.实施例6：与实施例5雷同，但培养基作如下改变：种子培养基包括：葡萄糖20g/l，牛肉浸粉10g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，无水乙酸钠5g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，吐温-80 1g/l，硫酸镁0.25g/l，硫酸锰0.05g/l。
79.发酵培养基包括：葡萄糖20g/l，牛肉浸粉10g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，无水乙酸钠5g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，吐温-80 1g/l，硫酸镁0.25g/l，硫酸锰0.05g/l，半胱胺酸盐2g/l，虾粉2g/l，虾粉上清液5g/l，发酵用大豆蛋白粉db7801上清液5g/l。
80.后续生物制剂（菌剂）制品的配方（按质量分数计）为：菌粉48%、抗性糊精15%、麦芽糊精15%，聚葡萄糖8%，针叶樱桃粉5%，低聚果糖6%，可溶性玉米淀粉3%。经检测，该制品的活菌数为1.20*10
11
cfu/g。产品制成粉体形式。
81.实施例7 格氏乳杆菌lg-g12稳定性测试实验材料：实施例1制备的格氏乳杆菌lg-g12冻干菌粉1、格氏乳杆菌lg-g12对胃酸的稳定性测试测试结果如图1所示，在ph为3的条件下，37℃条件下。存放1小时，2小时，4小时的存活率分别达到49%、42%、30%。
82.人体正常情况下，胃酸的ph值在1.3-1.8左右。进餐后，由于食物的中和作用。饭后ph值可以上升到4.0左右。益生菌制剂，一般在饭后使用。另外，胃在排空时ph值约在7.0～7.2。这也是一般可推荐清晨可以服用益生菌制剂的原因。综合以上因素，我们测定了格氏乳杆菌（lactobacillus gasseri ）lg-g12，在ph值为3时的耐受性。结果显示，在ph值为3的酸液下作用1小时后，格氏乳杆菌（lactobacillus gasseri ）lg-g12的存活率降至约为原来的50%，2小时，降为原来的40%左右。而作用4小时后，降为原来的30%。
83.2、格氏乳杆菌lg-g12对胆盐的稳定性测试时结果如图2所示，在0.2%和0.3%的胆汁酸条件下。37℃条件下。存放1小时，2小时，4小时的存活率分别达到69.8%、52.65%、44.9%和49%，29%，16%。
84.人体小肠中胆汁盐含量在0.03%～0.3%范围内波动,而格氏乳杆菌（lactobacillus gasseri ）lg-g12，要定植于人的小肠,这就要求格氏乳杆菌（lactobacillus gasseri ）lg-g12，能耐受一定浓度的胆汁。我们测定了格氏乳杆菌（lactobacillus gasseri ）lg-g12，在胆盐浓度分别为0.2%和0.3%时的耐受性。结果显示，在胆盐浓度为0.2%胆汁液下作用1小时后，格氏乳杆菌（lactobacillus gasseri ）lg-g12的存活率降至约为原来的50%，2小时候，降为原来的40%左右。而作用4小时后，降为原来的30%。
85.在0.2%和0.3%的胆汁酸条件下。37℃条件下。存活情况如图3。
86.3、格氏乳杆菌lg-g12对温度的稳定性测试结果如图4：a)在-18℃条件下存放24个月。其活菌数达到90%以上存活。
87.b)在4℃条件下存放24个月。其活菌数达到80%以上存活。
88.c)在25℃条件下存放24个月。其活菌数达到30%以上存活。
89.实施例8：本实施性实验研究了潜在的益生菌和抗生素对肥胖的动物增加体内褐色脂肪组织的效果。可以单独使用，也可以依次使用。在实验的第一阶段，通过摄入高饱和脂肪的食物和果糖溶液，动物被诱导肥胖。这段时间后，给予动物的热量供应减少，即采用肥胖的常规治疗方法。动物分为5个实验组:对照组(g1)，肥胖组(g2)，益生菌组(g3)，抗生素组(g4)，抗生素+ lg-g12格氏乳杆菌组（g5），g4组动物接受头孢曲松钠，g5接受头孢曲松钠治疗2周，紧接着又接受 lg-g12格氏乳杆菌治疗2周。分析了与肥胖相关的参数，如生物计量测量（动物的胸围、腹围等）、生化检测、肠道菌群组成。通过限制热量和连续供应抗生素+（潜在）益生菌的治疗，能够增加褐色脂肪组织，同时减少生物计量，改变肠道微生物菌群，成为治疗肥胖的一种有前途的治疗方法。
90.格氏乳杆菌 lg-g12被用作潜在的益生菌。经过折算，在小鼠身上的用量为每天109（10亿）个菌落形成单位(cfu)的剂量，这是基于一些研究提出的宣称为最低剂量的益生菌。
91.抗生素采用头孢曲松钠，剂量为每只小鼠体重的千分之0.5 (500mg/kg)，这种抗生素主要针对革兰氏阴性杆菌，这种杆菌会增加肥胖发展的风险。此外，头孢曲松钠不被身体吸收，只在小肠和结肠局部发挥作用。
92.40只 c57bl/6 j 小鼠，用于实验。在实验过程中，动物被放置在集中笼(8只动物/箱)中，环境温度控制在(22℃
±
2℃)和周期的环境中保持24小时摄像，动物可自由获取水、果糖(合成糖)溶液和食物，按照配对喂养方案进行喂养。
93.肥胖诱导期（01期）：肥胖诱导方式，随机分为肥胖组(n = 32)和对照组(g1,n = 8)。在这12周的阶段，肥胖组的动物接受了高脂肪饮食，其中60% 的能量来自饱和脂肪和10% 果糖溶液。对照组给予含谷氨酸的复配饲料（参照美国营养学会推荐的ain一93m动物合成饲料配方，以下同），并提供蒸馏水。
94.肥胖诱导期后，两组间体重差异有显著性(p《0.005) ，提示诱导成功。但是动物的肥胖程度不同。再将肥胖组动物重新分为4个实验组(g2~g5，n = 8) ，以便开始进入治疗期(02期)。第02期进行4周，所有动物在此期间接受标准的含谷氨酸的复配饲料和蒸馏水，这种饮食调整代表了动物饮食结构的改变，以提供低热量的输入，这代表了肥胖的标准营养治疗。以及采用增加体内褐色脂肪组织的辅助治疗方法—即采用含有（潜在）益生菌和/或抗生素的补充的方法辅助治疗。
95.辅助治疗每天进行。对照组(g1)和肥胖组(g2)动物给予蒸馏水，益生菌组(g3)动物每天获得109cfu（10亿活菌数）格氏乳杆菌 gl-g12，抗生素组(g4)动物每天获得500mg 头孢曲松/kg，抗生素+（潜在）益生菌组(g5)的小鼠接受500毫克头孢曲松酮/kg 治疗2周，随后再接受每天获得109cfu （10亿活菌数）干酪乳杆菌 gl-g12个菌落形成单位。辅助治疗2周。
96.在整个实验期间，每周测量动物的体重，每3天记录食物摄入量。在第一阶段和第二阶段结束时，在非弹性测量带的帮助下，测量身体的长度，包括腹围(测量后腿之前)和胸围(测量前腿之后)。计算腹围/胸围比值、 肥胖指数和体脂百分比等，实验4周后，将动物分期禁食12小时，用3% 异氟醚麻醉，记录并填写相关数据。收集血液、粪便、肠道和脂肪组织样本，进行进一步分析。
97.1）体重变化情况。考察治疗后，各组的体重变化情况。从实验结果图1来看，在治疗阶段，试验组的体重增加与对照比稍有差异。试验组之间的对比也稍有差异，其中，益生菌组、抗生素组、抗生素+益生菌组，体重有下降趋势。
98.2）治疗阶段结束时的生物测定值和体质指标的差异性表1可见，与 g3组（益生菌组）相比，g5组（抗生素+益生菌组）显示出较低的腹壁和胸壁周长（腹围与胸围）, 此外，g5组的棕色脂肪组织数量高于g1 组（对照组）(p = 0.046)和g2（肥胖组） (p = 0.003)，腹部脂肪组织数量低于组（对照组）g1 (p = 0.034)。g3组（益生菌组）、g5组（抗生素+益生菌组）的棕色脂肪组织数量均高于其它组。
99.表1：生物测定值和体质指标的测定
测量值g1=对照组g2=肥胖组g3=益生菌组g4=抗生素组g5=抗生素+益生菌组p腹围，cm7.00
±
0.50ab7.50
±
0.50a7.50
±
0.63a7.00
±
0.00ab6.50
±
1.00b0.002胸围,cm7.00
±
0.50a7.00
±
0.50ab7.00
±
0.50a6.50
±
0.50ab6.00
±
0.50b0腹围/胸围1.00
±
0.041.07
±
0.231.07
±
0.071.08
±
0.011.00
±
0.080.05肥胖评定指数0.34
±
0.02a0.33
±
0.01ab0.33
±
0.01ab0.33
±
0.01ab0.32
±
0.01b0.046附睾的脂肪组织,g0.70
±
0.200.56
±
0.100.71
±
0.070.53
±
0.230.71
±
0.270.243腹部脂肪组织,g0.14
±
0.01a0.12
±
0.01ab0.17
±
0.04ab0.08
±
0.03b0.10
±
0.04b0体脂,%0.77
±
0.260.70
±
0.110.92
±
0.100.64
±
0.230.81
±
0.280.179总脂肪组织,g0.99
±
0.330.93
±
0.121.22
±
0.050.88
±
0.221.18
±
0.320.05棕褐色脂肪组织,g0.27
±
0.09abc0.24
±
0.04a0.34
±
0.03bc0.28
±
0.07abc0.37
±
0.07bc0.002棕褐色脂肪/总脂肪组织0.27270.2580.27870.31820.3136
g1 =对照组，g2 =肥胖组，g3 =潜在益生菌组，g4 =抗生素组;g5 =抗生素+潜在的益生菌组。
100.脂肪具有保暖和保护作用。储备脂肪存于皮下肌肉间隙及内脏间隙，有隔热保温和支持保护体内脏器，以及关节、神经等免受外力摩擦、碰撞至伤的作用。并维持皮肤的生长发育。
101.脂肪组织还是一个活跃的内分泌器官,它能分泌多种激素或细胞因子,参与调节
一些生理功能。有资料显示内脏脂肪组织还可能在生殖和性功能的调节中发挥作用。人体内的一种脂肪-磷脂，是细胞生物膜的主要成分。它维系着细胞的形态，也维持着细胞的各种功能，没有生物膜细胞就无法存在。人体所需的必需脂肪酸是靠食物脂肪提供的。它主要用于磷脂的合成，是所有细胞结构的重要组成部分;它能保持皮肤微血管正常通透性，以及对精子形成、前列腺素的合成方面的作用等，都是必需脂肪酸的重要功能。一般女性的体脂含量低于17%。内分泌就会受到严重影响，也会对女性生理期造成影响。
102.人体是靠食物脂肪来提供所需的必需脂肪酸的。它主要是用于合成磷脂的，是所有细胞结构的重要组成部分；保持皮肤微血管正常通透性，以及对精子形成、前列腺素的合成方面的作用等，都是必需脂肪酸的重要功能。
103.结合上述，推测（益生菌组）g3组、（抗生素+益生菌组）g5组中的附睾脂肪组织在维系正常生殖功能上有一定的作用。
104.肥胖组g2中，附睾的脂肪组织重量较对照组（g1组）的低。肥胖可降低小鼠精液质量,引发生殖细胞凋亡,导致小鼠生育力降低，已有相关的报道。从本实验结果初步分析认为，由于肥胖小鼠大腿较粗、内侧紧挨且运动后反复摩擦生热，距睾丸较近。会导致睾丸长期处于较高温度下。而于这里有比较高的温度，这对睾丸功能也是会影响，会降低生精功能。对生殖功能产生负面影响。而体内的脂肪，主要有保温保暖等作用，不能协助降温。因此作为反馈调节，附睾脂肪无需拥有太大的量来维持对应器官的温度。从而附睾脂肪组织相对变得较少，以便维持相应的生殖功能。同样出现这种反馈调节，可能意味着其生殖功能受到一定的影响。
105.抗生素组g4中，一方面可能由于长期用药。（对于小鼠来说，4周的用药。相当于人类8年左右）会对其肾脏产生较大负担。而因此就可能会影响到生殖功能。另一方面，该组小鼠的总体脂肪组织重量比对照组的要低10%以上，体脂百分比更是相差20%以上。因此对应体内相关部位的脂肪也可能会相应减少。对于小鼠自身来说，主要解决基本健康问题。而该部位脂肪组织重量的过少，可能不利于维系其生殖系统的健康、生殖功能和正常性欲望与行为。
106.体重变化情况。考察治疗后，各组的体重变化情况。从实验结果来看，在治疗阶段，试验组的体重增加与对照比稍有差异。试验组之间的对比也稍有差异。
107.由图5可见：其中，益生菌组、抗生素组、抗生素+益生菌组，体重有下降趋势。体重的适当降低，应当有利于肥胖小鼠生殖健康的恢复。
108.除了体内过多的脂肪会遮挡男性生殖器以外，体型过于肥胖，体内的激素也会发生变化，会导致性欲出现一定程度的下降，如果因为体型肥胖，导致身体出现高血压等症状的话，长期服用药物也会影响到性功能。吃多了抗生素对肾脏负担是较大的。要是肾脏功能不好的话,就会影响到性功能的。
109.3）生理指标表2格氏乳杆菌 gl-g12对生理指标的影响
g1=对照组g2=肥胖组g3=益生菌组g4=抗生素组g5=抗生素+益生菌组pct=总胆固醇，(mg/dl)120.12
±
9.59127.42
±
21.51136.26
±
12.34144.53
±
55.04114.07
±
10.080.167hdl=高密度胆固醇，(mg/dl)64.42
±
6.0273.68
±
5.6977.46
±
7.7181.22
±
31.2763.20
±
5.290.153ct/hdl1.8651.7291.7591.7791.805tg=甘油三酯，(mg/dl)76.66
±
11.20ab110.56
±
14.55a98.13
±
16.73ab94.80
±
44.46a56.58
±
5.96b0.007ldl=低密度脂蛋白胆固醇40.36
±
7.2231.62
±
7.7639.17
±
3.3744.35
±
16.6339.56
±
14.220.249
hdl/ldl1.5962.331.9781.8311.598vldl=极低密度脂蛋白胆固醇，(mg/dl)15.33
±
2.24ab22.11
±
2.91a19.63
±
3.35ab18.96
±
8.89a11.32
±
1.19b0.007ast=天冬氨酸转氨酶，(u/l)185.17
±
39.61138.48
±
10.71151.01
±
17.97156.80
±
60.08190.00
±
41.500.059alt=丙氨酸转氨酶,(u/l)44.96
±
4.0041.80
±
2.5046.88
±
2.0048.00
±
32.0045.33
±
17.330.068ast/alt4.123.313.223.274.19
由上表可见，g5抗生素+（潜在）益生菌组对应的胆固醇、高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、甘油三酯，以及ast/alt比值。几乎全都更加优于其它试验组。甚至由于对照组。这些生理指标的健康，有利于男性的生殖健康。
110.一项大样本人群实验结果也显示，高血脂对精子功能有不利影响，高胆固醇、高磷脂异常导致精子顶体及头端结构不完整。有学者发现在先天因素、精液因素及女性因素导致的不孕夫妻中，精液质量差的男性中肥胖发生率是精液正常男性的3倍，肥胖男性患少精子症的可能性是正常体重指数男性的3.5倍。肥胖者，性功能有可能处于减退的。一方面肥胖会造成脂肪细胞过多，影响雄激素水平，造成雄激素芳香化转化为雌激素，引起性欲减退、勃起功能障碍；另一方面，肥胖者可能会患慢性疾病，如高胆固醇、高血压、高血脂、高血糖，会影响血管、神经功能，进而影响勃起功能。在肥胖的发生、发展中过程中，脂代谢紊乱发挥着至关重要的作用，其引起的脂肪分布异常与肥胖密切相关，男性肥胖者中常可发现高胆固醇血症、高甘油三脂血症等脂代谢紊乱存在。血清胆固醇虽不明显增加体重，但可引起精子功能障碍，降低精子数量及活力，改变精子形态学，对精子获能造成影响。
111.高甘油三酯血症可促进白蛋白尿进展及糖尿病肾病的发生发展。从而影响肾的健康。进一步影响到生殖健康。
112.另外有研究表明，促炎因子是男性肥胖、生育力低下二者之间的桥梁，最终造成精子数量减少、活力下降、形态改变、抗体增多，同时也使精子氧化应激反应及dna损伤增加。
113.而存在于革兰氏阴性菌中的一些分子可触发慢性低级别炎症。认为是导致肥胖的经典途径。这表明肠道微生物群的优化，可以降低炎症，也可能是降低脂肪减少肥胖，从而改善男性生殖健康的手段之一。
114.4）测定相应的微生物指标情况综合图2~图7所示，从香浓指数、辛普森指数、菌落丰度指数以及门、目、科属数量及占比来看。益生菌组、抗生素+益生菌组利于增加体内有益菌的丰度。抗生素和（潜在）益生菌的使用对减少拟杆菌门和增加厚壁门菌群是有效的。这表明肠道菌群发生了调节，改变了对肥胖的经典认识，而众所周知的是，人体内的益生菌含量（丰度）增加，有利益提高人体免疫，增强抵抗力和提高机体的应激能力。也能降低消化系统和肠道通透性，减少炎症的发生。从而间接的影响精子数量、活力、形态、抗体，同时使精子氧化应激反应及dna损伤减少。提升生殖健康的能力。
115.其中，抗生素+益生菌组，可能是由于头孢三松对革兰氏阴性细菌的作用，减少了体内一些革兰氏阴性菌。进而增加人体内部益生菌含量的丰度。间接地为提升生殖健康打下基础。
116.在随后的实验中。我们进一步证实了肥胖使得雄性小鼠生殖能力下降、精液质量下降的情况。
117.5）下表为实验所得的高脂组雄性小鼠，精子总数,精子浓度，精子运动数，精子前向运动数平均数和a类精子数的中位数与正常对照组雄性小鼠及高脂组的雄性小鼠在用益生菌干预后恢复组（抗生素+益生菌组）雄性小鼠精子质量情况对照表，单位：个/m l。
118.表3雄性小鼠精子质量情况总数浓度运动数向前运动数a类中位数高脂组83245142235348正常对照组14421102103699671恢复组117895387675263由上表可见，高脂组雄性小鼠的精子质量有所下降。而恢复组雄性小鼠的精子质量与高脂组相比有所提高。但与正常组还有一定差距。估计还需要进一步恢复。但是已经可以看到恢复的趋势还是比较乐观的。
119.6）生殖行为采用1：1比例与育龄雌鼠配比同笼，合笼喂养6天，检测雄鼠交配指数。以阴道涂片检测到有精子视为受孕，受测雄鼠各为20只。
120.表4受孕率情况ꢀ组别合计受孕雌鼠数量合计受孕率备注对照组1470%常规饲养肥胖组420%常规低热量服用6周益生菌组945%服用益生菌6周抗生素组630%服用抗生素6周抗生素+益生菌组1155%服用抗生素2周，益生菌4周由上述数据可见：抗生素+益生菌组、益生菌组与对照组雌鼠的受孕率相对较为接近。其中抗生素+益生菌组与肥胖组差距明显。显示该方办法有一定的恢复雄性老鼠生殖功能的潜力。益生菌虽然增加了益生菌的服用。但是可能小鼠体内导致炎性物质、体重变化、生理指标等还没有达到更为健康的状态。对生殖健康还需进一步恢复。而抗生素组与预计的较为接近。可能是抗生素的副作用等，导致其使雌鼠受孕的成功率不高。
121.综上：lg-g12格氏乳杆菌。尤其是lg-g12格氏乳杆菌配合抗生素来维持雄性小鼠体内附睾脂肪组织，优化生理指标、改善动物体内的微生物群，降低体重等。从而实现有利于雄性肥胖小鼠生殖功能的健康恢复或维护其生殖功能正常。在实验上得到有效的证实。同时，这种应用优化了动物体内的微生物群，间接的提高机体的抵抗力，减少相关的炎症，提高免疫力，也有利于动物的减肥。
122.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种有利于肥胖男性生殖健康的益生菌，其特征在于，所述益生菌为格氏乳杆菌lg-g12，所述的格氏乳杆菌lg-g12（lactobacillus gasseri lg-g12），保藏地点为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno:m2019829，保藏时间为2019年10月17日。2.权利要求1所述的格氏乳杆菌lg-g12在肥胖男性生殖健康中的应用，其特征在于，将所述格氏乳杆菌lg-g12制备成生物制剂使用，所述生物制剂的制备过程包括菌种活化、种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎、复配混合及后道加工。3.根据权利要求2所述的格氏乳杆菌lg-g12在肥胖男性生殖健康中的应用，其特征在于，所述生物制剂还包含食品上和药学上可接受的辅料，在所述的复配混合步骤中加入。4.根据权利要求3所述的格氏乳杆菌lg-g12在肥胖男性生殖健康中的应用，其特征在于，所述辅料为麦芽糊精、抗性糊精、羟乙基纤维素，山梨糖醇，乳糖醇、柳橙水果粉，菊粉，低聚异麦芽糖，低聚果糖、全脂乳粉，乳粉，奶味香精中的一种或几种。5.根据权利要求2所述的格氏乳杆菌lg-g12在肥胖男性生殖健康中的应用，其特征在于，所述生物制剂为粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、液体剂或胶囊剂。6.根据权利要求2所述的格氏乳杆菌lg-g12在肥胖男性生殖健康中的应用，其特征在于，所述生物制剂的每剂中含有至少300亿cfu所述的格氏乳杆菌lg-g12活菌。7.根据权利要求2所述的格氏乳杆菌lg-g12在肥胖男性生殖健康中的应用，其特征在于，所述生物制剂的每剂重量为0.5~10.0克。8.根据权利要求2所述的格氏乳杆菌lg-g12在肥胖男性生殖健康中的应用，其特征在于，将所述的格氏乳杆菌lg-g12活菌与抗生素搭配使用。9.根据权利要求8所述的格氏乳杆菌lg-g12在肥胖男性生殖健康中的应用，其特征在于，所述的抗生素为头孢曲松钠。

技术总结
本发明提供一种有利于肥胖男性生殖健康的益生菌及应用，属于微生物应用技术领域，将所述格氏乳杆菌LG-G12制备成生物制剂使用，所述生物制剂的制备过程包括菌种活化、种子培养、发酵培养、菌体收集、保护剂配置、乳化、真空低温冷冻干燥、粉碎、复配混合及后道加工。本发明采用格氏乳杆菌LG-G12调节了动物体内的微生物群，可被建议作为肥胖症的辅助治疗，而为了达到较佳的效果，宜采用抗生素+益生菌相结合的方式，比单一从改善调节动物体内的微生物群方法来减肥，更加有效，该方法和技术为缓解肥胖和提高肥胖男性的生殖健康带来新的潜在方法和技术。方法和技术。方法和技术。


技术研发人员：郑建丰 韩迪 蒋德意 马章献 宋锦安
受保护的技术使用者：润盈生物工程（上海）有限公司
技术研发日：2022.11.16
技术公布日：2023/8/14