具核梭杆菌检测剂及其用途的制作方法

1.本技术涉及癌症领域，具体而言，涉及一种用于具核梭杆菌核酸检测剂及其用途。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer，crc)，又称为大肠癌、直肠癌、大肠直肠癌、大肠直肠癌、或肠癌，为源自结肠或直肠(为大肠的一部份)的癌症，是人类最常见的恶性肿瘤之一。大多数结直肠癌是由息肉引起，起始于异常的腺窝，后逐渐演变成息肉，最终发展为结肠直肠癌，整个过程可长达5-15年。结直肠癌的发生发展，可分为异常增生、原位肿瘤、恶性侵润、远端转移等数个病程阶段。
3.目前，结直肠癌的诊治手段主要是通过对已确诊患者的手术切除、放疗、化疗和其他综合治疗，结直肠癌病灶被发现多已处于中晚期，癌细胞极易发生近处淋巴结转移和远端器官转移(如：肝脏或肺部等)，以致误诊率高，晚期患者5年生存率低。i期crc患者的5年生存率为91％，而iv期患者仅为14％。早期筛查是降低crc相关死亡率的关键策略之一。
4.目前，crc筛查方法主要包括基于粪便的检测和结肠镜检查。粪便免疫化学测试(fit)是目前应用最广泛的结直肠癌早期筛查技术，但对于检测进展期腺瘤和早期crc的敏感性相对较低。研究显示，对156914例健康体检样本进行fit检测，fit阳性人群10931例病理诊断恶性肿瘤16例(crc13例、胃癌3例)。crc在fit检测人群中的不完全检出率8.15/10万，在fit阳性人群中的不完全检出率118.93/10万。因此，fit检测的假阳性率较高。
5.结肠镜检查前肠道准备需要大量饮水，检查有穿孔风险，因而限制了结肠镜检查作为大规模筛查的首要手段。
6.因此，如何提高结直肠癌筛查的准确性是结直肠癌诊断的难点。


技术实现要素：

7.为了解决上述问题，提高结直肠癌筛查的准确性，本技术的第一目的在于提供一种具核梭杆菌检测剂，检测剂包括crispr检测试剂，crispr检测试剂包含cas效应蛋白、信号报告探针和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导rna，其中，靶分子包括具核梭杆菌核酸。
8.本技术在发现血液中游离核酸中存在具核梭杆菌核酸，并且发现该具核梭杆菌核酸能够作为结直肠肿瘤标志物的的基础上，通过研究crispr检测技术对不同扩增体系下的具核梭杆菌核酸进行向导rna设计，发现crispr检测技术能够提高各种扩增方法的扩增产物检测结果的灵敏度，进而提高血浆检测具核梭杆菌的灵敏度，从而提高了结直肠癌筛查和诊断的准确性。
9.在其中一个实施例中，向导rna的靶向区域满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：
10.(1)靶向区域包括seq id no.68～seq id no.72所示序列的核酸片段中任意一个；
11.(2)靶向区域来源于具核梭杆菌核酸且与seq id no.68～seq id no.72所示序列
的核酸片段中的任意一个具有90％以上同源性的核酸序列。
12.在其中一个实施例中，cas效应蛋白是dna靶向效应蛋白；可选的，dna靶向效应蛋白包括cas9和/或cas12，cas12包括cas12a、cas12b、cas12c中的至少一种。
13.在其中一个实施例中，cas效应蛋白是rna靶向效应蛋白；可选的，rna靶向效应蛋白包括cas13a和/或cas13b。
14.在其中一个实施例中，crispr试剂还包括rna聚合酶，可选的，rna聚合酶包括t7rna聚合酶和sp6 rna聚合酶中的至少一种。
15.在其中一个实施例中，向导rna满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：
16.(1)向导rna具有如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.15、seq id no.16、seq id no.28、seq id no.58、seq id no.61中的至少一种所示的序列；
17.(2)向导rna具有如seq id no.31、seq id no.34、seq id no.37和seq id no.40中的至少一种所示的序列；
18.(3)向导rna具有如seq id no.43和seq id no.46中的至少一种所示的序列；
19.(4)向导rna具有如seq id no.49、seq id no.52和seq id no.55中的至少一种所示的序列；
20.(5)向导rna具有如seq id no.64和seq id no.67中的至少一种所示的序列。
21.在其中一个实施例中，向导rna具有如seq id no.18和seq id no.19中的至少一种所示的序列。
22.在其中一个实施例中，检测剂还包括核酸扩增试剂，用于对具核梭杆菌dna进行扩增。
23.在其中一个实施例中，核酸扩增试剂包括扩增具核梭杆菌核酸的特异性引物。
24.在其中一个实施例中，核酸扩增试剂用于执行以下扩增方法中的任意一种：
25.重组酶聚合酶等温扩增、环介导等温扩增、pcr扩增、滚环扩增、交叉引物等温扩增、链置换扩增和解旋酶依赖性扩增。
26.在其中一个实施例中，特异性引物的靶向区域满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：
27.(1)靶向区域包括seq id no.68～seq id no.72所示序列的核酸片段中任意一个；
28.(2)靶向区域来源于具核梭杆菌核酸且与seq id no.68～seq id no.72所示序列的核酸片段中的任意一个具有90％以上同源性的核酸序列。
29.在其中一个实施例中，扩增方法是重组酶聚合酶等温扩增时，特异性引物包括如seq idno.1所示序列的上游引物和如seq id no.6所示序列的下游引物、
30.seq id no.29所示序列的上游引物和如seq id no.30所示序列的下游引物、
31.seq id no.32所示序列的上游引物和如seq id no.33所示序列的下游引物、
32.seq id no.35所示序列的上游引物和如seq id no.36所示序列的下游引物、
33.seq id no.38所示序列的上游引物和如seq id no.39所示序列的下游引物、
34.seq id no.41所示序列的上游引物和如seq id no.42所示序列的下游引物、
35.seq id no.44所示序列的上游引物和如seq id no.45所示序列的下游引物、
36.seq id no.47所示序列的上游引物和如seq id no.48所示序列的下游引物、
37.seq id no.50所示序列的上游引物和如seq id no.51所示序列的下游引物、
38.seq id no.56所示序列的上游引物和如seq id no.57所示序列的下游引物、
39.seq id no.59所示序列的上游引物和如seq id no.60所示序列的下游引物、
40.seq id no.62所示序列的上游引物和如seq id no.63所示序列的下游引物、
41.seq id no.65所示序列的上游引物和如seq id no.66所示序列的下游引物中的至少一组。
42.在其中一个实施例中，扩增方法是环介导等温扩增时，特异性引物包括f3引物、b3引物、fip引物和bip引物中的至少一种；
43.f3引物具有如seq id no.23所示的序列；
44.b3引物具有如seq id no.24所示的序列；
45.fip引物具有如seq id no.25所示的序列；
46.bip引物具有如seq id no.26所示的序列；
47.lf引物具有如seq id no.27所示的序列。
48.在其中一个实施例中，扩增方法是pcr扩增时，
49.特异性引物包括如seq id no.13所示序列的上游引物和如seq id no.14所示序列的下游引物。本技术的第二目的在于提供检测剂在制备检测具核梭杆菌的试剂盒或者检测结直肠肿瘤的试剂盒中的用途。
50.在其中一个实施例中，结直肠肿瘤包括结直肠癌和结直肠进展期腺瘤中的至少一种；
51.试剂盒满足以下特征(1)～(4)中的至少一个：
52.(1)试剂盒用于结直肠癌筛查，以区分结直肠进展期腺瘤与结直肠非进展期腺瘤，和/或区分结直肠进展期腺瘤与健康人；
53.(2)试剂盒用于结直肠癌诊断，以区分结直肠癌与结直肠非进展期腺瘤，和/或区分结直肠癌与健康人；
54.(3)试剂盒用于结直肠癌患者治疗疗效诊断，以评估治疗效果；
55.(4)试剂盒用于结直肠癌病程监控诊断，以评估复发风险。
56.本技术的第三目的在于提供一种具核梭杆菌检测试剂盒，包括上述检测剂。
57.本技术的第四目的在于提供一种检测结直肠肿瘤的试剂盒，其特征在于，包括上述检测剂。
58.在其中一个实施例中，试剂盒还包括cfdna富集试剂。
59.本技术的第五目的在于提供一种具核梭杆菌检测方法，其特征在于，采用上述检测剂检测待测样本中的具核梭杆菌核酸。
60.在其中一个实施例中，待测样本为血液样本，检测的步骤包括：
61.富集待测血液样本中的cfdna；
62.将富集的cfdna和上述检测剂反应，采用荧光法或侧向流免疫层析色谱法测定cfdna中的具核梭杆菌核酸。
63.在其中一个实施例中，侧向流免疫层析色谱法用于执行显线法、消线法中的至少一种。
附图说明
64.为了更清楚地说明本技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
65.图1为本技术实施例2构建的raa-cas12a检测体系中不同向导rna的检测结果；
66.图2为本技术实施例3构建的raa-cas13检测体系中不同向导rna的检测结果；
67.图3为本技术实施例4构建的pcr-cas12a检测体系中不同向导rna的检测结果；
68.图4为本技术实施例5构建的lamp-cas12a检测体系的检测结果。
具体实施方式
69.现将详细地提供本技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本技术进行多种修改和变化而不背离本技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
70.因此，旨在本技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本技术更广阔的方面。
71.具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum,fn)是常见的革兰氏阴性无芽胞厌氧杆菌，以口腔牙垢中最为多见。已有研究证实具核梭杆菌也存在于肠道中，并且具核梭杆菌的丰度与结直肠癌有关。近年来，有研究表明具核梭杆菌通过诱导炎性反应、促癌信号通路开放，促进结直肠癌增殖。
72.目前基于具核梭杆菌的检测进行肠癌诊断的研究多限于对粪便样本或结直肠癌组织样本中的具核梭杆菌进行检测，未见血液样本中具核梭杆菌检测用于结直肠癌诊断。
73.为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本技术的第一方面提供了一种具核梭杆菌检测剂，检测剂包括crispr检测试剂，crispr检测试剂包含cas效应蛋白、信号报告探针和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导rna，其中，靶分子包括具核梭杆菌核酸。
74.本技术中，血液中游离的dna简称cfdna(circulating free dna)，是指循环血液中的核酸类物质，包括循环血液中细胞内的核酸，游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性dna与rna，如真菌血症、细菌血症和病毒血症等病理情形下的血中外源核酸。
75.本文使用的术语“标志物”或“生化标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。本技术中，这样的分子靶标的实例是核酸，特别的，是来自于cfdna中的核酸。在本技术中用作标志物的具核梭杆菌核酸预期包括核酸的天然存在的变体以及核酸或变体的片段，特别是生物学上可检测的片段。本领域的技术人员可认识到，由具核梭杆菌释放的核酸或存在于胞外基质中的核酸可能受到损害，且可被降解或切割成这样的片段。
76.本技术中，“结直肠肿瘤”是指结直肠癌相关疾病，包括结直肠癌和结直肠进展期腺瘤中的至少一种。
77.结直肠腺瘤是起源于结直肠黏膜腺上皮的良性肿瘤，包括结肠腺瘤与直肠腺瘤，是常见的肠道良性肿瘤。结直肠进展期腺瘤包括直径≥10mm的腺瘤、包含25％以上绒毛成分的腺瘤、或伴有高级别异型增生/黏膜内癌的腺瘤。进展期腺瘤是结直肠癌发展的前期阶段。
78.在本技术中，组织或癌症可以是来自哺乳动物并且是优选地来自人，虽然猴、猿、猫、狗、牛、马和兔也在本技术的范围内。
79.本技术的结直肠肿瘤标志物可以来源于血浆中的cfdna或者血清中的cfdna。
80.本技术在发现血液中游离核酸中存在具核梭杆菌核酸，并且血液中具核梭杆菌核酸能够作为结直肠肿瘤标志物的基础上，通过设计向导rna，研究对不同扩增体系下crispr检测技术对具核梭杆菌核酸检测结果的影响，发现crispr检测技术能够提高各种扩增方法的扩增产物检测结果的灵敏度，进而提高血浆检测具核梭杆菌的灵敏度，从而提高了结直肠癌筛查和诊断的准确性。
81.一些实施方案中，向导rna的靶向区域满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：
82.(1)靶向区域包括seq id no.68～seq id no.72所示序列的核酸片段中任意一个；
83.(2)靶向区域来源于具核梭杆菌核酸且与seq id no.68～seq id no.72所示序列的核酸片段中的任意一个具有90％以上同源性的核酸序列。
84.一些实施方案中，cas效应蛋白是dna靶向效应蛋白；可选的，dna靶向效应蛋白包括cas9和/或cas12，cas12包括cas12a、cas12b、cas12c中的至少一种。
85.一些实施方案中，cas效应蛋白是rna靶向效应蛋白；可选的，rna靶向效应蛋白包括cas13a和/或cas13b。
86.一些实施方案中，crispr试剂还包括rna聚合酶，可选的，rna聚合酶包括t7 rna聚合酶和sp6 rna聚合酶中的至少一种。
87.一些实施方案中，向导rna具有如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.15、seq id no.16、seq id no.28、seq id no.58、seq id no.61中的至少一种所示的序列。
88.一些实施方案中，向导rna具有如seq id no.31、seq id no.34、seq id no.37和seq id no.40中的至少一种所示的序列。
89.一些实施方案中，向导rna具有如seq id no.43和seq id no.46中的至少一种所示的序列。
90.一些实施方案中，向导rna具有如seq id no.49、seq id no.52和seq id no.55中的至少一种所示的序列。
91.一些实施方案中，向导rna具有如seq id no.64和seq id no.67中的至少一种所示的序列。
92.一些实施方案中，向导rna具有如seq id no.18和seq id no.19中的至少一种所示的序列。
93.一些实施方案中，检测剂还包括核酸扩增试剂，用于对具核梭杆菌dna进行扩增。
94.一些实施方案中，核酸扩增试剂包括扩增具核梭杆菌核酸的特异性引物。
95.一些实施方案中，核酸扩增试剂用于执行以下扩增方法中的任意一种：
96.重组酶聚合酶等温扩增、环介导等温扩增、pcr扩增、滚环扩增、交叉引物等温扩增、链置换扩增和解旋酶依赖性扩增。
97.一些实施方案中，特异性引物的靶向区域满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：
98.(1)靶向区域包括seq id no.68～seq id no.72所示序列的核酸片段中任意一个；
99.(2)靶向区域来源于具核梭杆菌核酸且与seq id no.68～seq id no.72所示序列的核酸片段中的任意一个具有90％以上同源性的核酸序列。
100.在其中一个实施例中，扩增方法是重组酶聚合酶等温扩增时，特异性引物包括如seq idno.1所示序列的上游引物和如seq id no.6所示序列的下游引物、
101.seq id no.29所示序列的上游引物和如seq id no.30所示序列的下游引物、
102.seq id no.32所示序列的上游引物和如seq id no.33所示序列的下游引物、
103.seq id no.35所示序列的上游引物和如seq id no.36所示序列的下游引物、
104.seq id no.38所示序列的上游引物和如seq id no.39所示序列的下游引物、
105.seq id no.41所示序列的上游引物和如seq id no.42所示序列的下游引物、
106.seq id no.44所示序列的上游引物和如seq id no.45所示序列的下游引物、
107.seq id no.47所示序列的上游引物和如seq id no.48所示序列的下游引物、
108.seq id no.50所示序列的上游引物和如seq id no.51所示序列的下游引物、
109.seq id no.56所示序列的上游引物和如seq id no.57所示序列的下游引物、
110.seq id no.59所示序列的上游引物和如seq id no.60所示序列的下游引物、
111.seq id no.62所示序列的上游引物和如seq id no.63所示序列的下游引物、
112.seq id no.65所示序列的上游引物和如seq id no.66所示序列的下游引物中的至少一组。
113.一些实施方案中，特异性引物包括如seq id no.1所示序列的上游引物和如seq id no.6所示序列的下游引物。
114.一些实施方案中，扩增方法是环介导等温扩增时，特异性引物包括f3引物、b3引物、fip引物和bip引物中的至少一种；
115.f3引物具有如seq id no.23所示的序列；
116.b3引物具有如seq id no.24所示的序列；
117.fip引物具有如seq id no.25所示的序列；
118.bip引物具有如seq id no.26所示的序列；
119.lf引物具有如seq id no.27所示的序列。
120.一些实施方案中，扩增方法是pcr扩增时，特异性引物包括如seq id no.13所示序列的上游引物和如seq id no.14所示序列的下游引物。
121.本技术的第二方面提供了上述检测剂在制备检测具核梭杆菌的试剂盒或者检测结直肠肿瘤的试剂盒中的用途。
122.一些具体实施方案中，根据试剂盒的检测结果，试剂盒用于结直肠癌筛查，以区分结直肠进展期腺瘤与结直肠非进展期腺瘤，和/或区分结直肠进展期腺瘤与健康人；
123.一些具体实施方案中，根据试剂盒的检测结果，试剂盒用于结直肠癌诊断，以区分结直肠癌与结直肠非进展期腺瘤，和/或区分结直肠癌与健康人；
124.一些具体实施方案中，根据试剂盒的检测结果，试剂盒用于结直肠癌患者治疗疗效诊断，以评估治疗效果；
125.一些具体实施方案中，根据试剂盒的检测结果，试剂盒用于结直肠癌病程监控诊断，以评估复发风险。
126.本技术的第三方面提供了一种具核梭杆菌检测试剂盒，包括上述检测剂。
127.本技术的第四方面提供了一种检测结直肠肿瘤的试剂盒，包括上述的的检测剂。
128.一些实施方案中，试剂盒还包括cfdna富集试剂。
129.本技术的第五方面提供了一种具核梭杆菌检测方法，采用上述检测剂检测待测样本中的具核梭杆菌核酸。
130.一些实施方案中，待测样本为血液样本，检测的步骤包括：
131.富集待测血液样本中的cfdna；
132.将富集的cfdna和检测剂反应，采用荧光法或侧向流免疫层析色谱法测定cfdna中的具核梭杆菌核酸。
133.一些实施方案中，侧向流免疫层析色谱法用于执行显线法、消线法中的至少一种。
134.下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述。
135.实施例1
136.本实施例构建了基于raa扩增的f.nucleatum raa检测体系，具体过程如下所示。
137.1、设计raa检测引物
138.从genbank中检索出f.nucleatum基因序列，设计raa检测引物并进行测试，筛选确定出最佳的raa扩增引物，设计的引物序列具体如表1所示。
139.atgagtatagaaaatgtcagaaaatggtttatgattcatacttattctggatatgaaaaaaaagtaaaa
140.acagaccttgaacaaaaaatggaaacattgggttttaaagaagttgtaactaatatattggttccaga
141.agaagaattaacagaaattgttagaggaaagcccaagaaggtctatagaaagctttttccagcatatg
142.ttatgcttgaaatggaagctacaagagaagaaaatgaaaatggtataagttataaagtagatcctcgt
143.gtatggtatgaagttagaaatactaatggggttactggatttgtaggagttggttctgaccctattccta
144.tggaagaagaagaagtaaaaaatatattcaacataataggtgtaaagacacctaaagaaaatgtgaa
145.aattgactttactgagggagattatgtaaaaatcttaaaaggttcatttaaagatcaagaaggacaag
146.ttgctgaaattgatcatgaacatggtagagttaaagtaatggttgatatttttggaagaatgacaccagttgaaattgaagtagatggtgttttgaaagtgtag(seq id no.67)
147.表1
[0148][0149][0150]
使用潍坊安普未来生物科技有限公司dna恒温快速扩增试剂盒(基础型)进行raa扩增。引物筛选的方法采用交叉验证方式进行。
[0151]
2、实验方法
[0152]
(1)选定下游检测引物fn-r1进行上游引物fn-f1、fn-f2、fn-f3、fn-f4的筛选验证。检测模板为合成的质粒dna模板。分别将质粒dna模板稀释至100copies/μl，10copies/μl，1copies/μl进行相关实验。
[0153]
表2
[0154] 100copies/t10copies/t1copy/tntcfn-f1+fn-r1有产物有产物无产物无产物fn-f2+fn-r1有产物无产物无产物无产物fn-f3+fn-r1有产物无产物无产物无产物fn-f4+fn-r1无产物无产物无产物无产物
[0155]
测试结果如表2所示。根据表2的检测结果选择fn-f1作为最佳上游引物。
[0156]
3.实验结果
[0157]
选定上游检测引物fn-f1进行下游引物fn-r1、fn-r2、fn-r3的筛选验证。检测模板为合成的质粒dna模板。分别将质粒dna模板稀释至100copies/μl，10copies/μl，1copies/μl进行相关实验。
[0158]
表3
[0159] 100copies/t10copies/t1copy/tntcfn-f1+fn-r1有产物无产物无产物无产物fn-f1+fn-r2有产物有产物无产物无产物fn-f1+fn-r3有产物无产物无产物无产物
[0160]
测试结果如表3所示。根据表3实验结果将fn-f1上游引物和fn-r2下游引物作为最佳检测组合。
[0161]
实施例2
[0162]
本实施例构建了基于raa扩增的f.nucleatum raa-cas12a检测体系，具体过程如下所示。
[0163]
1、设计crrna
[0164]
参照cas12a crrna设计原则进行crrna设计，具体序列如下表4所示。
[0165]
表4
[0166][0167][0168]
2、实验方法
[0169]
crispr检测体系如下表5所示。
[0170]
表5
[0171][0172]
将上述构建的cas12a体系，置于37℃下反应20min。将反应后的产物用全波长酶标仪进行荧光检测。其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测37℃下反应20min时的荧光值。
[0173]
3、实验结果
[0174]
荧光值检测结果如表6和图1所示。根据表6和图1的检测结果可知：12a-fn-crrna2，12a-fn-crrna3，12a-fn-crrna4检测效果均较优，检测下限可至1copy/t。
[0175]
表6
[0176][0177]
4、实验结论
[0178]
cas12a联合raa检测可检测单拷贝，检测灵敏度优于单纯raa检测。
[0179]
实施例3
[0180]
本实施例构建了基于raa扩增的f.nucleatum raa-cas13a检测体系，具体过程如下所示。
[0181]
本实施例以实施例1构建的raa检测体系为基础，进行cas13a的f.nucleatum-crispr检测体系构建。与cas12a相比，cas13a的检测体系的不同在于crrna设计不同。且cas13a识别靶标为rna，需将扩增的dna产物先转录为单链rna再进行剪切，因而在实施例1的上游检测引物上需加入t7酶识别位点，t7酶识别位点为taatacgactcactatagggaga，引物序列如下表7所示。
[0182]
表7
[0183][0184]
1、设计crrna
[0185]
crrna具体设计如下表8所示。
[0186]
表8
[0187][0188]
2、实验方法
[0189]
crispr检测体系如下表9所示。
[0190]
表9
[0191][0192]
将上述产物进行离心后置于37℃下反应20min。将反应后的产物用全波长酶标仪进行荧光检测。其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测37℃下反应20min时的荧光值。
[0193]
3、实验结果
[0194]
检测结果如下表10和图2所示。根据表10和图2的检测结果可知，raa后进行crispr检测13-fn-crrna1，13-fn-crrna2检测效果均较优，检测下限可至1copy/t。
[0195]
表10
[0196][0197]
4、实验结论
[0198]
cas13a联合raa检测可检测单拷贝，检测灵敏度优于单纯raa检测。
[0199]
实施例4
[0200]
本实施例构建了基于pcr扩增的f.nucleatum pcr-cas12a检测体系。
[0201]
本实施例在用pcr扩增方法进行样本的扩增后，用cas12a进行f.nucleatum-crispr检测体系构建，确定是否基于现有扩增方法进行crispr检测能否提高现有检测体系的灵敏度，具体过程如下所示。
[0202]
1、引物设计
[0203]
本实施例pcr-crispr检测方法设计的引物具体如下表11所示。
[0204]
表11
[0205]
引物名称靶标序列fn-f:caaccattactttaactctaccatgttca(seq id no.13)fn-r:gttgactttacagaaggagattatgtaaaaatc(seq id no.14)12-p-crrna1uaauuucuacuaaguguagauaagaucaagaaggacaaguu(seq id no.15)12-p-crrna2uaauuucuacuaaguguagauagcaacuuguccuucuugau(seq id no.16)
[0206]
2、检测方法
[0207]
本实施例pcr反应混合液配置如表12所示。
[0208]
表12
[0209][0210]
本实施例crispr检测体系按照如下表13所示配置。
[0211]
表13
[0212][0213][0214]
3、检测结果
[0215]
(1)荧光定量pcr检测结果如表14所示。
[0216]
表14
[0217] 100copies/t10copies/t1copy/tntc重复135.12无扩增无扩增无扩增重复233.0236.15无扩增无扩增重复334.25无扩增无扩增无扩增
[0218]
(2)crispr检测结果如表15和图3所示。
[0219]
根据表15和图3的检测结果可知：pcr扩增后进行crispr检测12-p-crrna1，12-p-crrna2检测效果均较优，检测下限可至1copy/t。
[0220]
表15
[0221][0222]
3、结论
[0223]
pcr扩增联合cas12a的检测方法可检测单拷贝，检测灵敏度优于单纯荧光定量pcr检测。
[0224]
实施例5
[0225]
本实施例构建了基于lam扩增的f.nucleatum lam-cas12a检测体系，具体过程如下所示。
[0226]
1、检测引物及crrna设计
[0227]
lamp扩增所需引物序列及cas12a-crrna如下表16所示。
[0228]
表16
[0229][0230][0231]
2、检测方法
[0232]
(1)lamp反应混合液按照表17所示配置。
[0233][0234]
(2)配置完成后置于：65℃反应30min，然后80min失活。产物进行纯化后，电泳判断有无目的产物。
[0235]
(3)crispr检测体系按照下表18所示配置。
[0236]
表18
[0237][0238]
(4)将上述产物进行离心后置于荧光pcr仪器上37℃循环50次，每1min中采集一次荧光，确定最佳crrna。
[0239]
3、检测结果
[0240]
(1)lamp检测结果如表19所示。
[0241]
表19
[0242] 100copies/t10copies/t1copy/tntc重复1有产物无产物无产物无产物重复2有产物有产物无产物无产物重复3有产物无产物无产物无产物
[0243]
(2)crispr检测结果如表20和图4所示。
[0244]
表20
[0245][0246]
根据表3和图4的检测结果可知：lamp扩增后进行crispr检测，检测效果较优，检测下限可至1copy/t。
[0247]
实施例6
[0248]
本实施例构建了基于试纸条法进行crispr检测的f.nucleatum-crispr检测体系，具体过程如下所示。
[0249]
1、研究方法
[0250]
本实施例以实施例2的raa-cas12a、实施例3的raa-cas13a、实施例4的pcr-cas12a、实施例5的lamp-cas12a的检测体系为基础构建试纸条法的crispr消线法和显线法检测体系。其中实施例2中选择12a-fn-crrna2、实施例3选择13-fn-crrna1、实施例4选择12-p-crrna1、实施例5选择12-lamp-crrna进行相关研究。
[0251]
2.检测体系配置
[0252]
实施例2、实施例4、实施例5的crispr检测体系如下表21所示进行配置。
[0253]
表21
[0254][0255]
实施例3的crispr检测体系如下表22所示进行配置。
[0256]
表22
[0257][0258]
表23
[0259]
原材料厂家消线法试纸条上海良润显线法试纸条上海良润
[0260]
将上述产物进行离心后置于37℃水浴锅进行反应后，取50ul进行试纸条检测，试纸条的购买来源如上表23所示。
[0261]
3、检测结果
[0262]
消线法的试纸条检测结果如表24所示。显线法的试纸条检测结果如表25所示。根据表24和表25的检测结果可知：消线法和显线法试纸条，检测下限均可至1copy/t。
[0263]
表24
[0264][0265]
表25
[0266][0267][0268]
实施例7
[0269]
本实施例提供了f.nucleatum-crispr检测体系在临床样本中的检测。
[0270]
1、研究方法
[0271]
本实施例以实施例2、实施例3、实施例4、实施例5构建的crispr荧光法检测体系，实施6构建的crispr试纸条消线法检测体系，采集50例经过肠镜诊断有病理诊断信息的肠癌/进展期腺瘤/非进展期腺瘤/健康人血浆样本2ml进行检测，同时收集患者的粪便样本进行检测，并与pcr检测结果进行对比，确认f.nucleatum crispr检测体系的检测效果，其中pcr检测详细步骤见实施例1。
[0272]
2、检测结果
[0273]
本实施例血浆样本的检测结果如表26所示。本实施例粪便样本的检测结果如表27所示。
[0274]
表26
[0275]
[0276]
[0277][0278]
表27
[0279]
[0280]
[0281]
[0282][0283]
3、结果分析
[0284]
3.1血浆样本检测结果分析
[0285]
(1)crispr检测结果的分析如表28所示。
[0286]
表28
[0287][0288]
(2)pcr检测结果的分析如表29所示。
[0289]
表29
[0290]
[0291][0292]
3.2粪便样本检测结果分析
[0293]
(1)crispr检测结果的分析如表30所示。
[0294]
表30
[0295][0296][0297]
(2)pcr检测结果的分析如表31所示。
[0298]
表31
[0299][0300][0301]
3、结论
[0302]
本技术建立的f.nucleatum-crispr检测体系，在血浆样本中的检测阳性预测值能达到100％。检测灵敏度达56.6％。高于常规pcr检测技术40％。可辅助肠癌诊断。
[0303]
本技术建立的f.nucleatum-crispr检测体系适用范围广，适用于常规pcr扩增方法和多种等温扩增方法，比单独的常规扩增检测结果均具有更低的检测限。
[0304]
本技术的具核梭杆菌检测剂假阳性率低，可应用结直肠癌的诊断，辅助医生进行判断，避免过度医疗。
[0305]
实施例8
[0306]
本实施例提供了血浆f.nucleatum在肠癌患者监控中的应用。本实施例考察crispr技术检测血浆f.nucleatum能否监控肠癌复发。入组20例确诊为肠癌的患者的术前血浆，进行血浆f.nucleatum检测对于检测为阳性的患者纳入随访研究。并在术后3-14天，无化疗术后1月或辅助化疗结束后1月，后续每3个月进行连续检测，随访至影像学复发或2年。确定血浆f.nucleatum复发监控准确度、与影像学相比的预测提前的窗口期。其中，采用ddpcr检测方法的检测结果如表32所示。采用实施例2构建raa-cas12a检测体系检测的结果如表33所示。
[0307]
表32
[0308][0309][0310]
表33
[0311][0312]
表34
[0313][0314]
根据表32～34分析可知：本技术构建的f.nucleatum-crispr检测体系检测血浆f.nucleatum的结果与影像学相比可提前3-15个月检测为阳性，检测结果与ddpcr一致。该
技术可应用血浆f.nucleatum的检测并辅助术后病程监控。
[0315]
实施例9
[0316]
基于现有公开的f.nucleatum的文献报道，确定现有报道常用的11段检测区段，这些检测区段据报道都可以采用pcr的方法进行检测。为了制备基于crispr技术的f.nucleatum检测试剂盒，需要从中筛选可以实现crispr检测并具有较优检测结果的检测区段来进行试剂盒的开发。
[0317]
筛选方法：针对qpcr、crispr/cas13、crispr/cas12检测方法，每个检测区段分别设计至少3个不同的检测用的的寡核苷酸组合。分别采用10copies/ml、1copies/ml和ntc作为检测模版，检测结果如表35所示：
[0318]
表35
[0319][0320][0321]
检测区段1：
[0322]
ctatttttttatgatcactctattttttaaatattctaaaaaatcatcaaaaatattagatttatcctg
[0323]
tgttttagaatatataaaatatgtttctcttgtaagttgttctccattttcatcaagcataggtgtcat
[0324]
acatagaccataatcattgataaaattttctgataaaaaacaacatacatagcctaaattcctattt
[0325]
actaattgccaagctacatcaacataacctgaaaatatttgattttttggttcaaaattaaaattttg
[0326]
ataccaccagttatttaatatttcttttgttttattatttgtactataatttatcattggcatgtctttt
[0327]
aaatcttccaattttattttattttttgaaagaatatatgctttttctatatcaactaagacactttca
[0328]
atatttccatcatatttcccatgtataaaagcaccatcaagattatgtatatctctgaataaatcttc
[0329]
actttgctttgttactatattaaaattaatattattttcttttgaatagttatataaaatatcgggtaa
[0330]
aaaatatttactgtaagtgtaacttgaacctaagtttaatcttcccctagtttcatatttaaaacttt
[0331]
tcattttatttttagtttcttccataaattttagatattccttagctcttttagctaaatactctccttc
[0332]
tactgtaaatttaactccttttgaacttctaagtagtattcttgtatcaaattcttcttcaatattttg
[0333]
aattatttttgttaaagatggctgcgagtaataaagtttttctgaaacttttgtaagatttggttctttatacaattcattcaatataatccaatctgtatctttca(seq id no.68)
[0334]
检测区段2：
[0335]
atgaaaaaaattattaacacaaaaaatgcaccagctgcattaggaccttattcacaagctattgaagcaaacggagttttatatgtttcaggacaaattccttttgttccagcgacaatgacattagtatcagaagatgtagaagctcagacaaaacaatctttggaaaacataggagccatcttaaaagaagcaggatatgattttaaagatgtggtaagtgcaacagtttatataaaagatatgaacgattttacaaaggtaaatggagtttatgataaatatttaggagaagttaaacctgcaagagcttgtgtagaagttgcaagattaccaaaagatgtaaaagttgaaattggagttatagctgttaaataa(seq id no.69)
[0336]
检测区段3：
[0337]
atgataacaaaaaatgttttaaagaaagcatttgtatttttaattttatcagcaagttttttatcttt
[0338]
aaattcacaagaggtatttgcaaatgtagtaagtgaacaaaatgaactcgctagtaaacttgttaa
[0339]
aaatgtaaaagaagttgggaatgacagatattacaaaggagatttttattcagatgttgggacttat
[0340]
ccagaaggaatgtttcttgtagtagaaaaacttatagaaaactatatagcatttgctcatatggggg
[0341]
aagcatcatatcttgcaccaataggtcaaaaatttgaagaaaaaatagatggtcaagttgtaaaac
[0342]
gttatattgcagtaagccaaaagaaaaagcgagggtattattgtatagatatttacgatgatttaaa
[0343]
tagtcagcctaaagcaactcttacagcaagacttaatataacaaaaaataaaaatggttattttata
[0344]
actccaaaagatgatttaacaatacaatataaaggaaaaacatataaaaatcaaaatgctttaaatttcttaggattttag(seq id no.70)
[0345]
检测区段4：
[0346]
ctacacttttaaaacaccatctacttcaatttcaactggtgtcatccttccaaaaatatcaaccattact
[0347]
ttaactctaccatgttcatgatctatttcagcaacttgtccttcttgatctttaaatgaaccttttaaga
[0348]
tttttacataatctccttctgtaaagtcaacttttatagtttctttaggtgtctttacacctattatattg
[0349]
aatatattttttacttcttcctcttccataggaataggatctgatccaactcctacaaacccagtaacac
[0350]
cattggtatttcttacttcataccatacacgaggatctactttatagcttataccttgttcgttttcttct
[0351]
cttgttgcttccatttcaagcataacataagcagggaaaagttttctataaacttttttaggtttccct
[0352]
ctaacaatctccgtcaactcttcttctggaaccaatatattagttacaacttctttgaaacctaatgttt
[0353]
ccattttttgttcaagatctgtttttactttttttcatatccagaataagtatgaatcataaaccactttctgacattttctacactcat(seq id no.44caaccattactttaactctaccatgttca(seq id no.71)
[0354]
检测区段5：
[0355]
atgaaatatgattttactacaagagtaaatagaaaagggcaaggttcatttaaatgggaagatatgtat
[0356]
gctaaaaaacctaatgtagctgatggaattgtaccactttctgttgctgatatggaatttaaaaatgcc
[0357]
cctgaaattattgaaggtttaaaaaattacttagatcaagtagttttaggatatacaatggcaaataaa
[0358]
gaatataaaaaagctgtatgtaattggatgaaaaaaagacataattttgaaattcaagaagactggat
[0359]
aattaatactgctggggttgtacctgcattttttagtgcaatacaagaatttacaaaagaaggtgatgg
[0360]
ggttattattatgacacctgtctattatcctttctttaatgcaataaacttacaaggtagaaaattaatag
[0361]
attgtcctcttatagaaaaagatggcatgtattatattgattatgatttatttgataaattatctcaagttt
[0362]
ctaaaaataaagttttattattctgctcaccacataatccagttggtagagtttggacaaaagaagaa
[0363]
ctaaaaaaattatctgatataattctaaaaaatgaagttttacttctttctgatgaagtacattttgatat
[0364]
aattatgcctaataaaaaacacaaagtttttcaaacaattgatgataaattagcggaaagaactataac
[0365]
atttacagctccttcaaaaacttttaatttagctggaatggggatgagtaatactattataaaaaataa
[0366]
agaacttcatgatagatttattaattctttgaatagaacttgttctatcccatttactgcattaggttata
[0367]
aatcatgtgagatagcttacactcaatgtgaagaatggttaaaagaatgtcttgaagttatttataaaa
[0368]
atcaacaacttatagttgagttctttgaaaaaaattatcctgaaattaaagtcataaaaaatgaagga
[0369]
acctatttattatgggtagattttagggctttaaatatggaacctgaagatttagaaaaatttatgataa
[0370]
atgaggctagcatattccttgatgaaggatacatatttggtgaaaatggaaaaggttttgaaagattta
[0371]
atcttgctgctcctacttctgttatagaagaaactcttcaaagattggataaagctttaaaaaaattaaaaaataattaa(seq id no.72)
[0372]
检测区段6：
[0373]
atgaaaaatatagaaaaagtaaaaatatcaacagaatttataaaacttgatcagtttttaaagtggctt
[0374]
gctgttgtagatagtggttctcaggcaaaacaagttattttagatggtaaggttaaagttaatgatgag
[0375]
gtagaaacaagaagaggtagaaaaatttatcctgaatataaggtagaaatttttgatagaatttacgttgtggaataa(seq id no.73)
[0376]
检测区段7：
[0377]
atgaaagtaatatcaataagtgaaatagcaacatttaaaatttcaaatgatgatagaataaaacttatg
[0378]
attttaaaagaaaaatggaaagaattatttttagatttatctcaaaatagttctgttattgattttaaag
[0379]
aaaatatcatctatgtaaaaggctataattctgttgtaaaacattatatttatacgaataaaataaaaataatagagaagatattagaaaatttagaaataaaatttaaaatagaggatataaaattaaagtaa(seq idno.74)
[0380]
检测区段8：
[0381]
fsdg rs00100atgttacattctattgtaatttcaaataaattaggaataactcctgttgaggcattttta
[0382]
gaaaattatcaaatattaaattacccattaggtacagattttgaatttaaagatggagaagaagttttta
[0383]
ttggagcaacatttggttttatttttcagtttatttttggtttttcaaaagttgaaaaaagaaaaaaag
[0384]
tagaaaaattaggaatagagactgctagtttgtttgattcaagaaatacaattattgaaataatagaataa(seq id no.75)
[0385]
检测区段9：
[0386]
fsdg_rs00130atgaaaagattaatattagtcttattatttttgtttatatgtatacaaattttctccattc aatctaagaaaaatttagttaagattgatattattggaaaatctgggataaaaagttattatgtaaattt ttctaatgaacagaatttagatagctttgaaatatatgatgtgttaaattaa(seq id no.76)
[0387]
检测区段10：
[0388]
fsdg_02255atgaaaagattaatattagtcttattatttttgtttatatgtatacaaattttctccattcaa tctaagaaaaatttagttaagattgatattattggaaaatctgggataaaaagttattatgtaaattttt ctaatgaacagaatttagatagctttgaaatatatgatgtgttaaattaa(seq id no.77)
[0389]
检测区段11：
[0390]
rpmhttatgctgataatttagctcttcctttaactcttcttctttttaaaacttttcttccattttta
gttg acattctagctctaaaaccgtgatctttttttctttttctttgatttggttgaaatgttcttttcat(seq id no.78)
[0391]
表35中可实现crispr/cas12a体系达到1copy/ml的检测下限的检测引物及crrna序列如下表36所示。cas13a的raa引物为在raa上游引物加上t7启动子序列。crna设计参照cas12a基本设计原则，且不受pam序列限制，序列为与反向引物同向设计，固定序列为：gggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac。
[0392]
表36
[0393]
[0394]
[0395][0396]
采集53例经过肠镜诊断有病理诊断信息的肠癌/进展期腺瘤/非进展期腺瘤/健康人血浆样本。将表35筛选出来的区段采用表36提供的序列进行检测，具体检测结果如表37所示。
[0397]
表37
[0398]
[0399]
[0400][0401]
根据表37的检测数据可知，筛选所得的基于crispr方法构建的f.nucleatum检测试剂盒都能进行结直肠肿瘤的检测。
[0402]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0403]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种具核梭杆菌检测剂，其特征在于，所述检测剂包括crispr检测试剂，所述crispr检测试剂包含cas效应蛋白、信号报告探针和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导rna，其中，所述靶分子包括具核梭杆菌核酸。2.根据权利要求1所述的检测剂，其特征在于，向导rna的靶向区域满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：(1)所述靶向区域包括seq id no.68～seq id no.72所示序列的核酸片段中任意一个；(2)所述靶向区域来源于具核梭杆菌核酸且与seq id no.68～seq idno.72所示序列的核酸片段中的任意一个具有90％以上同源性的核酸序列。3.根据权利要求1或2所述的检测剂，其特征在于，所述cas效应蛋白是dna靶向效应蛋白；可选的，dna靶向效应蛋白包括cas9和/或cas12，所述cas12包括cas12a、cas12b、cas12c中的至少一种。4.根据权利要求1或2所述的检测剂，其特征在于，所述cas效应蛋白是rna靶向效应蛋白；可选的，rna靶向效应蛋白包括cas13a和/或cas13b。5.根据权利要求3所述的检测剂，其特征在于，所述crispr试剂还包括rna聚合酶，可选的，rna聚合酶包括t7 rna聚合酶和sp6 rna聚合酶中的至少一种。6.根据权利要求3所述的检测剂，其特征在于，所述向导rna满足以下特征(1)～(5)中的至少一个：(1)所述向导rna具有如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.15、seq id no.16、seq id no.28、seq id no.58、seq id no.61中的至少一种所示的序列；(2)所述向导rna具有如seq id no.31、seq id no.34、seq id no.37和seq id no.40中的至少一种所示的序列；(3)所述向导rna具有如seq id no.43和seq id no.46中的至少一种所示的序列；(4)所述向导rna具有如seq id no.49、seq id no.52和seq id no.55中的至少一种所示的序列；(5)所述向导rna具有如seq id no.64和seq id no.67中的至少一种所示的序列。7.根据权利要求4所述的检测剂，其特征在于，所述向导rna具有如seq id no.18和seq id no.19中的至少一种所示的序列。8.根据权利要求1-7任一所述的检测剂，其特征在于，所述检测剂还包括核酸扩增试剂，用于对具核梭杆菌核酸进行扩增。9.根据权利要求8所述的检测剂，其特征在于，所述核酸扩增试剂包括扩增具核梭杆菌核酸的特异性引物。10.根据权利要求9所述的检测剂，其特征在于，所述核酸扩增试剂用于执行以下扩增方法中的任意一种：重组酶聚合酶等温扩增、环介导等温扩增、pcr扩增、滚环扩增、交叉引物等温扩增、链置换扩增和解旋酶依赖性扩增。11.根据权利要求9或10所述的检测剂，其特征在于，所述特异性引物的靶向区域满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：(1)所述靶向区域包括seq id no.68～seq id no.72所示序列的核酸片段中任意一
个；(2)所述靶向区域来源于具核梭杆菌核酸且与seq id no.68～seq idno.72所示序列的核酸片段中的任意一个具有90％以上同源性的核酸序列。12.根据权利要求11所述的检测剂，其特征在于，所述扩增方法是重组酶聚合酶等温扩增时，所述特异性引物包括如seq id no.1所示序列的上游引物和如seq id no.6所示序列的下游引物、seq id no.29所示序列的上游引物和如seq id no.30所示序列的下游引物、seq id no.32所示序列的上游引物和如seq id no.33所示序列的下游引物、seq id no.35所示序列的上游引物和如seq id no.36所示序列的下游引物、seq id no.38所示序列的上游引物和如seq id no.39所示序列的下游引物、seq id no.41所示序列的上游引物和如seq id no.42所示序列的下游引物、seq id no.44所示序列的上游引物和如seq id no.45所示序列的下游引物、seq id no.47所示序列的上游引物和如seq id no.48所示序列的下游引物、seq id no.50所示序列的上游引物和如seq id no.51所示序列的下游引物、seq id no.56所示序列的上游引物和如seq id no.57所示序列的下游引物、seq id no.59所示序列的上游引物和如seq id no.60所示序列的下游引物、seq id no.62所示序列的上游引物和如seq id no.63所示序列的下游引物和seq id no.65所示序列的上游引物和如seq id no.66所示序列的下游引物中的至少一组。13.根据权利要求11所述的检测剂，其特征在于，所述扩增方法是环介导等温扩增时，所述特异性引物包括f3引物、b3引物、fip引物和bip引物中的至少一种；所述f3引物具有如seq id no.23所示的序列；所述b3引物具有如seq id no.24所示的序列；所述fip引物具有如seq id no.25所示的序列；所述bip引物具有如seq id no.26所示的序列；所述lf引物具有如seq id no.27所示的序列。14.根据权利要求11所述的检测剂，其特征在于，所述扩增方法是pcr扩增时，所述特异性引物包括如seq id no.13所示序列的上游引物和如seq idno.14所示序列的下游引物。15.权利要求1～14任一项所述检测剂在制备检测具核梭杆菌的试剂盒或者检测结直肠肿瘤的试剂盒中的用途。16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述结直肠肿瘤包括结直肠癌和结直肠进展期腺瘤中的至少一种；所述试剂盒满足以下特征(1)～(4)中的至少一个：(1)所述试剂盒用于结直肠癌筛查，以区分结直肠进展期腺瘤与结直肠非进展期腺瘤，和/或区分结直肠进展期腺瘤与健康人；(2)所述试剂盒用于结直肠癌诊断，以区分结直肠癌与结直肠非进展期腺瘤，和/或区分结直肠癌与健康人；(3)所述试剂盒用于结直肠癌患者治疗疗效诊断，以评估治疗效果；(4)所述试剂盒用于结直肠癌病程监控诊断，以评估复发风险。17.一种具核梭杆菌检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～14任一项所述的检测剂。
18.一种检测结直肠肿瘤的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～14任一项所述的检测剂。19.根据权利要求17或18所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cfdna富集试剂。20.一种具核梭杆菌检测方法，其特征在于，采用权利要求1～14任一项所述的检测剂检测待测样本中的具核梭杆菌核酸。21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述待测样本为血液样本，所述检测的步骤包括：富集所述待测样本中的cfdna；将富集的cfdna和所述检测剂反应，采用荧光法或侧向流免疫层析色谱法测定cfdna中的具核梭杆菌核酸。22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述侧向流免疫层析色谱法用于执行显线法、消线法中的至少一种。

技术总结
本申请涉及一种具核梭杆菌检测剂，所述检测剂包括CRISPR检测试剂，所述CRISPR检测试剂包含Cas效应蛋白、信号报告探针和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA，其中，所述靶分子包括具核梭杆菌核酸。本申请在发现血液中游离核酸中存在具核梭杆菌核酸，并且发现该具核梭杆菌核酸能够作为结直肠肿瘤标志物的的基础上，通过研究CRISPR检测技术对不同扩增体系下的具核梭杆菌核酸进行向导RNA设计，发现CRISPR检测技术能够提高各种扩增方法的扩增产物检测结果的灵敏度，进而提高血浆检测具核梭杆菌的灵敏度，从而提高了结直肠癌筛查和诊断的准确性。和诊断的准确性。和诊断的准确性。


技术研发人员：孙爱娟 秦环龙 田甜 徐荣荣 曹展 张田田 林红霞 孙玉龙 王弢
受保护的技术使用者：江苏为真生物医药技术股份有限公司
技术研发日：2022.12.31
技术公布日：2023/8/14