一种基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法

1.本发明涉及一种基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相免疫方法；本发明筛选获取针对新型冠状病毒n蛋白抗体对，制备了两种纳米探针，可选择性富集、检测样本中的新型冠状病毒n蛋白，实现了对新型冠状病毒病毒的快速、灵敏检测。


背景技术：

2.sars-cov-2可通过人群接触、气溶胶、粪便等途径传播，具有极高的传染性及致死率，及早发现病毒的传播轨迹，是控制疫情最有效的策略，因此，开发快速有效针对新型冠状病毒病毒的检测手段是十分重要的。
3.实时荧光rt-pcr法是目前新型冠状病毒检测的金标准，胶体金试纸条法做为新型冠状病毒检测的补充手段，rt-pcr法步骤繁琐、操作环境要求高、需专业操作人员及设备、样本难保存，极大降低了新型冠状病毒病毒的筛查效率，胶体金试纸条法检测灵敏度较低，一种操作简单、快速、灵敏的新型冠状病毒检测手段仍有待开发。免疫荧光均相法均相荧光免疫分析操作简单、检测步骤少、检测灵敏度高等优点，在新型冠状病毒检测也已有应用，如专利“新型冠状病毒中和抗体的磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用”(申请号：cn202111020666.x)，提供了一种准确高效检测检测新型冠状病毒中和抗体的化学发光均相试剂盒，但化学发光体系发光试剂稳定性差、精确度低，且检测中和抗体并不能准确判断新型冠状病毒病毒的存在，存在很大的局限性，而量子点微球具有生物相容性好、非特异性吸附低，高量子产率、荧光光谱稳定、吸收光谱宽，是高灵敏度检测、均相检测分析的优选信号材料。
4.在新型冠状病毒的抗原免疫检测体系中，单克隆抗体是最常规的检测元件，如“抗新型冠状病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原检测中的应用”(申请号：cn202010463556.x)公开了抗新型冠状病毒核衣壳蛋白的配对抗体序列，并描述其在新型冠状病毒检测中的应用前景，但在传统的双单抗夹心体系检测大分子体系中，针对不同表位的配对单抗制备过程复杂、成本高、周期长、批间差异大、配对抗体筛选效率低、操作难度高，寻找一种新的配对单抗筛选方法具有重要的意义。传统的单克隆抗体相比，纳米抗体制备成本低、周期短、稳定性强、批间差异小，此外，通过分子模拟计算，可快速筛选出针对靶标不同表位的纳米抗体，再与传统单抗进行配对，相比传统的随机筛选，大大提高筛选效率与性能，是单抗优良的替代元件。目前，也并无量子点微球与纳米抗体联合用于均相免疫分析新型冠状病毒病毒抗原的报道。


技术实现要素：

5.本发明公开一种基于纳米抗体检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相免疫方法，克服了传统免疫检测法中成本高、检测信号不稳定、灵敏度低、耗时耗力、需多次洗涤孵育的缺点。本发明的技术方案包括以下步骤：使用大肠杆菌表达系统表达了新型冠状病毒n蛋白
和新型冠状病毒n蛋白纳米抗体，sds-page鉴定表达蛋白纯度，elisa法鉴定重组蛋白的生物学活性；将制备不同表位的纳米抗体与传统的单克隆抗体配对，快速筛选出了一对检测性能优异的配对抗体；优化偶联过程中edc/nhs投入量、抗体投入量、偶联时间，利用edc/nhs活化剂活化量子点微球与磁性纳米颗粒表面羧基，制备得到两种靶向新型冠状病毒n蛋白的探针；将两种探针投入不同浓度新型冠状病毒n蛋白溶液中，孵育一段时间后，磁力架快速分离磁性微球，检测荧光强度，建立针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的免疫均相方法，具体步骤如下：
6.本发明的检测模式也应用于其他大分子蛋白的检测，以检测新型冠状病毒核衣壳蛋白为例。为获取纳米抗体替代传统的单克隆抗体应用于免疫分析，构建了新型冠状病毒n蛋白与新型冠状病毒n蛋白纳米抗体(n1、n2、n3、n4)的原核表达载体，转化至大肠杆菌工程菌-bl21(de3)，菌体培养至对数生长期，加入适当浓度的iptg诱导菌体表达目的蛋白，同时，降低培养温度以提高目的蛋白的产量；表达结束时，破碎菌体，鉴定目的蛋白为可溶性表达，收集上清纯化，sds-page、elisa鉴定制备蛋白具有较好的纯度及生物学活性。
7.本发明提供了一种配对抗体的快速筛选方法。新型冠状病毒病毒的免疫检测通常使用双单抗夹心法，其中单抗难以制备、针对目的蛋白不同表位的单克隆抗体难以筛选，本发明制备了成本低廉的多种纳米抗体与单克隆抗体进行配对，快速筛选获取了一对检测性能优异的配对抗体，克服了传统打哪看那个难获取、配对单抗筛选困难的缺点，筛选步骤为：将制备的纳米抗体包被于酶标孔中，脱脂牛奶封闭后，加入不同浓度的新型冠状病毒n蛋白，将人血清作为阴性对照，经过一段时间的孵育，投入一定量的n蛋白单克隆抗体；加入二抗后显色；根据显色结果表示，纳米抗体与n蛋白单克隆抗体有最佳的配对性能，此外，与人血清孔未显色，配对抗体具有较强的检测特异性。
8.本发明制备了两种纳米探针，可靶向结合新型冠状病毒n蛋白。纳米抗体/单抗与量子点/磁性微球偶联步骤是根据说明书并做出改良，步骤为：取纳米微球溶于缓冲液，投入edc、nhs活化纳米微球表面的羧基，活化后除去活化剂，并加入pbs缓冲液清洗一次；投入抗体，使得活化后的羧基与蛋白的氨基共价偶联，去除未偶联抗体后，加入bsa(pbs溶解)封闭多余位点，分离微球和上清，使用保存液重悬微球，将制备探针放置4℃备用。在上述步骤的基础上，分别对活化剂投入量、偶联时间、目标蛋白投入量进行了优化。
9.本发明基于上述制备探针，建立了新型冠状病毒n蛋白的均相免疫法，本发明提供的方法操作简单、成本低廉、反应速度快，在新型冠状病毒的免疫分析中具有良好的应用前景，步骤如下：使用pbs将新型冠状病毒n蛋白稀释为不同浓度，设置阴性、空白对照，投入适量的两种纳米探针，经过一段时间的孵育，磁力架分离磁珠，洗涤两次后，荧光酶标仪测定孔内荧光值，并根据不同蛋白浓度的孔内荧光强度，建立测定新型冠状病毒n蛋白的标准曲线，得出线性方程。
10.本发明除检测新型冠状病毒病毒之外，也适用于其他病毒的检测，如乙肝病毒、诺如病毒、轮状病毒等。也适用于其他生物大分子或病原微生物的检测，如疾病的生物标志物-脂联素蛋白、人可溶性生长刺激蛋白等。
11.有益效果：
12.本发明制备的新型冠状病毒n蛋白纳米抗体，与传统免疫分析中的检测元件-单克隆抗体相比，具有制备简单、成本低、周期短、稳定性强、批间差异小等优点，是单抗的优良
替代品；本发明打破传统配对单抗的筛选方法，克服传统配对单抗筛选困难、难以筛选等缺点，使用纳米抗体与单克隆抗体配对，在较短时间可筛选出配对性能优异的抗体对，为新型冠状病毒的免疫分析奠定有良好的基础。
13.本发明制备了两种靶向新型冠状病毒n蛋白的探针，具有制备简单、特异性强、检测性能稳定等优点，是新型冠状病毒n蛋白的优良检测元件；本发明建立了均相检测新型冠状病毒病毒的免疫分析法，与目前新型冠状病毒检测的金标准(rt-pcr)相比，具有操作简单、成本低廉、反应速度快、洗涤和分离步骤少、适用于多种场景检测，为新型冠状病毒快速检测试剂盒的开发奠定了基础。
附图说明
14.图1基于纳米抗体检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相免疫方法原理示意图
15.图2elisa法验证包被不同浓度新型冠状病毒n蛋白与单克隆抗体的结合性能
16.图3elisa法验证包被不同浓度新型冠状病毒n蛋白与制备纳米抗体的结合性能图4纳米抗体与单克隆抗体最佳配对的筛选
17.图5量子点微球的透射电镜图
18.图6磁性纳米微球的扫描电镜图
19.图7量子点微球偶联条件的优化
20.图8量子点微球与磁性纳米微球偶联不同质量目的蛋白表面电位的变化图9基于纳米抗体均相检测新型冠状病毒n蛋白标准曲线的建立
具体实施方式
21.本发明提供的利用新型冠状病毒n蛋白纳米抗体代替传统的单克隆抗体的免疫均相方法；制备了多种新型冠状病毒n蛋白纳米抗体，elisa法筛选最佳抗体对，将抗体、纳米抗体偶联到纳米颗粒表面，制备得到两种靶向新型冠状病毒n蛋白的探针，进而对新型冠状病毒病毒进行快速富集及超灵敏检测(图1)。
22.实施例1，新型冠状病毒n蛋白、n蛋白纳米抗体的表达
23.取e.coil bl21(de3)甘油菌划线于平板，制备bl21(de3)的感受态细胞；将含有目的基因的表达载体的转入bl21(de3)感受态，挑取转化成功的单菌落接种于lb液体培养基，质粒小提试剂盒提取质粒并进行酶切验证，以确保表达载体的成功构建；挑取转化成功的表达载体接种lb/amp试管培养基，37℃过夜培养；接种40-60ml lb/amp液体培养基扩大培养，待菌体生长至od
600
约等于0.5-0.8，加入0.1-0.5mm iptg，22℃培养12-16h；将菌液转移至离心管，6000-8000rpm离心10-15min，收集菌体沉淀重悬于pbs缓冲液中，超声破碎仪破碎重悬菌体；破碎之后，将破碎液经ni-nat重力柱纯化后，sds-page检测蛋白的纯度，bca试剂盒测定蛋白浓度，超滤除去纯化蛋白中的咪唑；如图2-3所示，所表达的新型冠状病毒n蛋白及纳米抗体具有较好的纯度，图3表明所制备的纳米抗体与n蛋白有着优良的结合性能。
24.实施例2，配对新型冠状病毒纳米抗体与单克隆抗体的筛选
25.包被2.5-5μg/mln蛋白纳米抗体至酶标板，4℃过夜；0.05％pbst洗板三次，3-5％脱脂牛奶封闭，37℃孵育1-2h；0.05％pbst洗板三次，加入不同浓度的n蛋白(2500-20pg/ml)、稀释正常人血清(阴性对照)、pbs(空白对照)，37℃孵育45-60min；0.05％pbst洗板三
次，每孔加入0.5-1.5μg/ml新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体，37℃孵育45-60min；0.05％pbst洗板三次，每孔加入羊抗鼠igg抗体，37℃孵育45-60min；0.05％pbst洗板三次，加入tmb显色液，37℃孵育8-15min；每孔加入1-2m h2so4，测定od
450nm
吸光值，如果图4所示，制备的4条纳米抗体与新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体配对使用时，能较为灵敏的检测新型冠状病毒n蛋白，有较好的配对效果，elisa法检测n蛋白最低检测线为800pg/ml。
26.实施例3，磁性纳米微球-单克隆抗体、量子点荧光微球-纳米抗体探针的制备
27.量子点微球及磁性纳米颗粒表面含有羧基(-cooh)，采用以n-(3-二甲基氨基丙基)-n-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)为交联剂，一步法活化纳米颗粒表面的羧基，使其易与蛋白表面的氨基结合，实现将抗体偶联至纳米颗粒表面，为后续的n蛋白检测提供基础。
28.纳米抗体与量子点微球偶联步骤是根据量子点纳米球(qdnbs)偶联说明书并做出改良，详细步骤为：取10-20μl qbs
620
量子点荧光微球溶于0.5-1ml mes缓冲液(0.05m)，超声1-5min；投入4-6μl edc和4-6μl nhs，超声1-5min，25℃在旋转混合仪孵育20-30min；12000rmp离心10-15min，使用移液枪吸取上清，加入pbs缓冲液，12000rmp离心10-15min清洗一次；加入0.08-0.1mg的目的蛋白，重悬微球，以25℃在旋转混合仪偶联40-50min；8000rmp离心5-10min，加入pbs缓冲液清洗一次；加入1-2％bsa(pbs溶解)，25℃在旋转混合仪封闭1-2h；8000rmp离心5-10min，用保存液重悬沉淀，将制备好的探针放置4℃备用。
29.磁性纳米颗粒偶联步骤同量子点微球偶联，但不同的为，由于磁性纳米颗粒带有磁性，将离心分离步骤换为磁力架分离。同时，投入单克隆抗体后，偶联的最佳条件为：nhs/edc投入量为6-10μl、蛋白投入量为90-120μg、最佳偶联时间为50-70min。
30.合成探针偶联条件的优化及表征：
31.为确定磁性纳米微球及荧光微球的粒径和分散性，透射及扫描电镜分别进行表征；图5观察到荧光纳米微球的粒径约100nm，粒子呈现均匀的圆或椭圆状；图6观察到磁性纳米微球的平均粒径约300nm，粒子呈现圆或椭圆状，且呈现较好的分散性；参考上述探针合成的步骤，取不同质量的抗体(20μg、40μg、60μg、80μg、100μg)投入到经edc与nhs活化的纳米微球，0.6％琼脂糖凝胶电泳鉴定偶联情况，动态光散射分析仪简单纳米材料表面的zeta电位，如图7(a)及图8所示，在蛋白投入量为80-100μg时，量子点微球表面偶联蛋白达到饱和；在确定最佳抗体投入量的前提下，参考上述探针合成的步骤，在活化纳米材料的表面羧基时，优化edc、nhs(2μl、4μl、6μl、8μl、10μl)的投入量，0.6％琼脂糖凝胶电泳鉴定偶联情况，如图7(b)所示，edc、nhs投入量为4-6μl时效果最佳；在确定最佳抗体、edc、nhs投入量的前提下，参考上述探针合成的步骤，优化最佳偶联时间(30min、40min、50min、60min)，0.6％琼脂糖凝胶电泳鉴定偶联情况，如图7(c)所示，活化后的量子点微球与纳米抗体偶联40-50min时，量子点微球表面偶联蛋白达到饱和。
32.实施例4，基于纳米抗体均相检测新型冠状病毒n蛋白
33.将表达的新型冠状病毒n蛋白用pbs稀释至2500、1250、625、312、156、78、39、20、10pg/ml，取4-8μl量子点微球-纳米抗体探针及8-14μl投入100μl不同蛋白浓度中，设置人血清为阴性对照、pbs为空白对照，每个蛋白浓度、阴性对照及空白对照设置三个平行对照，37℃孵育20-30min；使用磁力架分离磁珠，使用pbs清洗两次后重悬磁珠，测定每个孔荧光信号，绘制标准曲线。如图9所示，均相免疫检测新型冠状病毒n蛋白的最低检测线为
0.15ng/ml。
34.以上所述，仅为本发明的优选实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
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技术特征：
1.一种基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，包括以下步骤：a、使用大肠杆菌表达系统制备了新型冠状病毒n蛋白和新型冠状病毒n蛋白纳米抗体n1、n2、n3、n4，并进一步鉴定了表达的新型冠状病毒n蛋白及纳米抗体的纯度与生物学活性；b、将制备的纳米抗体作为包被抗体，单克隆抗体作为配对抗体；c、将纳米抗体偶联至量子点微球表面，制备了靶向新型冠状病毒n蛋白的荧光纳米探针，为均相快检体系提供检测信号；d、将新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体偶联至磁性纳米微球的表面，制备了靶向新型冠状病毒n蛋白的磁性纳米探针，为均相体系快速分离核衣壳蛋白奠定基础；e、将制备的两种纳米探针投入不同浓度的新型冠状病毒n蛋白中，建立了均相检测新型冠状病毒n蛋白的免疫分析法，最低检测线为150pg/ml。2.根据权利要求1所述的基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，检测靶标为新型冠状病毒n蛋白。3.根据权利要求1所述的基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，配对抗体筛选方法是：纳米抗体为固相抗体，单克隆抗体为检测抗体；或将单克隆抗体作为固相抗体，纳米抗体作为检测抗体。4.根据权利要求1所述的基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，偶联纳米抗体的量子点微球投入量为4-6μl，磁性纳米微球的投入量为8-14μl。5.根据权利要求1所述的基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体配对纳米抗体n1、n2、n3、n4和新型冠状病毒n蛋白的序列分别为：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5。6.根据权利要求3所述的基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，配对抗体筛选方法中，纳米抗体的包被浓度为2.5-5μg/ml，单克隆抗体的投入量为0.5-1.5μg/ml。7.根据权利要求1所述的基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，步骤c通过以下方法实现，其中量子点微球的粒径平均100nm：c1、取量子点微球溶于缓冲液，超声1-5min，投入edc、nhs活化纳米微球表面的羧基；c2、离心去除活化剂，pbs缓冲液清洗一次，投入纳米抗体n1，偶联40-50min后，离心去除未偶联抗体；c3、加入1-2％bsa(pbs溶解)封闭微球，分离微球和上清，pbs洗两次，保存液重悬微球，将制备探针放置4℃备用。8.根据权利要求7所述的基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，偶联的条件为nhs/edc投入量为4-6μl、蛋白投入量为80-100μg、偶联时间为40-50min。9.根据权利要求1所述的基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，步骤d通过以下方法实现，其中磁性纳米微球的粒径平均300nm：
d1、取磁性纳米微球溶于缓冲液，超声1-5min，投入edc、nhs活化纳米微球表面的羧基；d2、磁力架分离微球与活化剂，pbs缓冲液清洗一次，投入单克隆抗体，偶联50-70min，磁力架分离磁珠，去除未偶联抗体；d3、加入1-2％bsa(pbs溶解)封闭微球，磁力架分离微球和上清，pbs清洗两次，保存液重悬微球，将制备探针放置4℃备用。10.根据权利要求9所述的基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，其特征在于，偶联的条件为：nhs/edc投入量为6-10μl、蛋白投入量为90-120μg、偶联时间为50-70min。

技术总结
一种基于纳米抗体-单抗夹心检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的均相方法，涉及抗原检测领域，本发明制备了多种新型冠状病毒核衣壳蛋白纳米抗体做为固相抗体，核衣壳蛋白单克隆抗体作为检测抗体，新型冠状病毒N蛋白作为检测靶标，通过酶联免疫吸附实验筛选出一组检测性能优良的抗体对，最低检测线为0.8ng/mL。此外，一步活化法将纳米抗体、单克隆抗体分别偶联到量子点微球及磁性纳米微球的表面，成功制备两种靶向新型冠状病毒核衣壳蛋白的探针，并构建了一种快速检测新型冠状病毒核衣壳蛋白的磁分离免疫均相方法，核衣壳蛋白的最低检测线为0.15ng/mL。本发明操作简单、成本低廉、反应速度快、可实现原位检测、配对抗体筛选效率高，在新型冠状病毒的快速检测中具有良好的应用前景。景。景。


技术研发人员：罗义 胡文进 毛大庆 袁青彬 蔺怀 刘奕辰
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2022.08.25
技术公布日：2023/8/14