LINC01978抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用

linc01978抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及linc01978抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌是一种严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第三位和第二位。对于早期确诊的crc患者，经手术治疗后的5年生存率可达80～90％。但是由于crc早期症状不明显，确诊时约50％的患者已到中晚期，结直肠癌已经发生转移，手术治疗辅助放化疗、化学药物治疗等手段具有其局限性，极大影响患者的治疗效果，导致患者5年生存率不及40％。因此，早期诊断和治疗是降低结直肠癌患者死亡率和改善预后的关键。
3.结直肠癌的发生发展是多基因调控的复杂过程。据全基因组测序表明，人类基因组序列中至少有93％的序列具有转录本活性，但编码蛋白质的基因序列仅占2％，剩下的是98％不具备编码蛋白质功能的非编码rna。其中，长链非编码rna(long non-coding rna,lncrna)是一类转录本长度大于200nt的非编码rna分子。大量研究表明，lncrna与结直肠癌的发生发展密切相关，参与结直肠癌发生发展的增殖、转移、侵袭和凋亡等生物学过程。针对lncrna在结直肠癌疾病领域的研究仍处于起步阶段，需要不断的探索和研究。目前，linc01978基因在结直肠癌中的生物学功能从未被研究过。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供linc01978抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.linc01978抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
7.优选的，所述linc01978抑制剂包括抑制linc01978转录和表达的干扰分子。
8.优选的，所述干扰分子包括shrna、sirna、dsrna、mirna、反义核酸。
9.优选的，所述shrna的功能序列如seq id no:1所示。
10.优选的，所述linc01978抑制剂用于：抑制结直肠癌细胞增殖；抑制结直肠癌细胞迁移；抑制结直肠癌细胞侵袭；或促进结直肠癌细胞凋亡。
11.优选的，所述药物包括有效成分以及药学上可接受的载体，所述有效成分为linc01978抑制剂。
12.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
13.本发明提供了linc01978抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。实验结果表明：敲除linc01978后可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，过表达linc01978后可促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，细胞凋亡减少。可见，linc01978抑制剂具有抑制结直肠癌发生发展的作用，存在潜在治疗效果，linc01978的抑制剂可用于制
备治疗结直肠癌的药物。本发明首次提出并验证linc01978作为结直肠癌的基因治疗新靶点，对于筛选抗结直肠癌新药具有重要意义，也为结直肠癌的治疗提供了一种新思路。
附图说明
14.图1为实施例1显微镜下观察细胞荧光携带情况；
15.图2为结直肠癌细胞转染linc01978后的mrna表达水平比较，注(****p《0.0001vs.oe-nc，##p《0.01vs.ko-nc，n＝3)；
16.图3为各组结直肠癌细胞增殖能力检测结果；
17.图4为各组结直肠癌细胞迁移能力检测结果；
18.图5为各组结直肠癌细胞侵袭能力检测结果；
19.图6为各组结直肠癌细胞凋亡能力检测结果。
具体实施方式
20.本发明提供了linc01978抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
21.本发明所述linc01978基因的序列为ncbi序列：101928738。
22.在本发明中，所述linc01978抑制剂优选包括抑制linc01978转录和表达的干扰分子；所述干扰分子优选包括shrna、sirna、dsrna、mirna、反义核酸，或能形成shrna、sirna、dsrna、mirna、反义核酸的构建物；所述shrna的功能序列如seq id no:1所示：gatgcagtgttgtgcacaa，所述shrna可用于敲低linc01978的表达。
23.在本发明中，所述linc01978抑制剂用于：抑制结直肠癌细胞增殖；抑制结直肠癌细胞迁移；抑制结直肠癌细胞侵袭；或促进结直肠癌细胞凋亡。实验结果表明：敲除linc01978后可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，过表达linc01978后可促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，细胞凋亡减少。
24.在本发明中，所述药物包括有效成分以及药学上可接受的载体，所述有效成分为linc01978抑制剂。
25.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
26.实施例1
27.构建linc01978的过表达和敲除细胞模型
28.1、细胞转染
29.(1)委托上海吉凯基因公司合成过表达linc01978载体，阴性对照载体是lv4(ef-1af/gfp)；
30.(2)设计linc01978 shrna序列：gatgcagtgttgtgcacaa(seq id no:1)。委托上海吉凯基因公司合成敲低linc01978载体，阴性对照载体是lv-1(pglvu6/gfp)。
31.(3)培养sw480细胞以1
×
105/ml的量接种于12孔板中，接种12孔，每孔加入1ml培养基(不含抗生素)培养12h。
32.(4)进行细胞转染，用200μl的opti-mem培养基稀释linc01978过表达或敲除载体及阴性对照，轻柔混合后，室温下静置5min。
33.(5)同时，用200μl的opti-mem培养基稀释5μl的lipofectamine 2000，轻柔混合
后，室温下静置5min。
34.(6)将稀释的表达载体与lipofectamine 2000混合，室温下静置25min，之后加入到相应组的细胞培养孔中，摇晃均匀。
35.(7)细胞放置在37℃、5％co2培养箱中培养24h后，换液处理。转染48h后，显微镜下观察细胞荧光携带情况，如图1所示。
36.由图1可知，过表达阴性对照(oe-nc组)、过表达-linc01978(oe-linc01978组)、敲低阴性对照(ko-nc组)、敲低-linc01978组(ko-linc01978组)细胞均携带绿色荧光，由此表明linc01978过表达载体、敲低载体均已成功转染到结直肠癌细胞中。
37.实施例2
38.1.细胞中总rna的提取
39.(1)各组孔板培养的细胞弃掉培养液，并用1ml的pbs缓冲液清洗3次，加入500μl的trizol试剂，移液器吹吸，充分混匀，室温下静置5min。
40.(2)将混匀的液体转移到1.5ml离心管。
41.(3)向每个离心管中加入与trizol体积比为1:5的氯仿(100μl)，盖紧盖子，将离心管剧烈震荡30s后于室温放置5min。
42.(4)4℃、12,000g离心15min，可见混合物分为三层，rna溶于上层透明液相中，将上清液转移到新的1.5ml离心管中。
43.(5)向离心管中加入与tirzol体积的异丙醇(-20℃预冷)，盖紧盖子，上下颠倒混匀几次后于室温放置10min。
44.(6)将离心管4℃、12,000g离心15min，去除上清液。
45.(7)向离心管中加入500μl的75％乙醇(用0.1％depc处理水配制)，盖紧盖子，震荡15s后于室温放置5min。
46.(8)将离心管4℃、12,000g离心15min，去除上清液。
47.(9)将离心管放于干净的超净工作台中风干30min，待离心管中无明显的水珠时，向离心管中加入10～15μl的0.1％depc处理水溶解rna。
48.(10)使用微量分光光度计检测rna浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，质量较好的rna可以直接用于下一步实验，或者置于-80℃长期保存。
49.2.逆转录
50.逆转录实验步骤按照逆转录试剂盒说明书进行操作，具体逆转录体系如下：
51.(1)去除基因组dna
52.表1 反应液的组成
53.54.注：按照以上方法在冰上进行反应液的配制，预先按照反应数+2的量配制反应混合物(除rna)，分装到每个反应管中，最后加入rna样品。
55.(2)反应管放置于室温，反应10min。
56.(3)逆转录pcr反应
57.表2 逆转录pcr反应液
[0058][0059]
(4)按照以上方法混合后，置于pcr仪中进行反转录，条件为37℃、15min，85℃、5s，4℃。
[0060]
上述去除基因组dna和逆转录反应，是takara primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser试剂盒中的试剂，根据试剂盒操作即可。
[0061]
3.荧光定量pcr
[0062]
(1)引物
[0063]
表3 荧光定量pcr引物序列
[0064][0065]
(2)反应体系
[0066]
表4 反应体系的组成
[0067][0068]
(3)反应条件
[0069]
表5 反应条件
[0070][0071]
反应结束后，由熔解曲线分析确认pcr产物特异性，有无杂带、引物二聚体。所得各样品ct值通过公式2
‑△△
ct
法计算出各样品mrna的相对表达量。其中，δct＝目的基因ct值-内参基因ct值，-δδct＝空白对照组δct平均值-各样品组δct值。具体结果见图2。
[0072]
由图2可知，与oe-nc组相比，oe-linc01978组细胞中linc01978的mrna表达水平显著升高；与ko-nc组相比，ko-linc01978组细胞中linc01978的mrna表达水平显著降低。以上结果说明，结直肠癌细胞中linc01978差异表达系统已经建立，后续实验可以在此基础上继续开展。
[0073]
(2)cck8法验证干扰linc01978对结直肠癌细胞增殖的影响
[0074]
使用rpmi-1640培养基培养sw480细胞(control组)、linc01978过表达组(oe-linc01978组)、linc01978过表达阴性对照组(oe-control组)、linc01978敲低组(ko-linc01978组)、linc01978敲低阴性对照组(ko-control组)共5组细胞，按照5
×
103个/孔细胞将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，加入适量新鲜培养基，于37℃、5％co2的细胞培养箱中过夜。细胞培养48h后，每孔加入20μl cck-8溶液，继续放置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养3h。选择450nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值，最后统计结果，具体结果见图3。
[0075]
由图3可知，与control组相比，oe-linc01978组细胞增殖能力显著增强，ko-linc01978组细胞增殖能力显著降低，oe-control组和ko-control组细胞增殖能力未见显著性差异。
[0076]
(3)划痕实验法验证干扰linc01978对结直肠癌细胞迁移的影响
[0077]
使用rpmi-1640培养基培养sw480细胞(control组)、linc01978过表达组(oe-linc01978组)、linc01978过表达阴性对照组(oe-control组)、linc01978敲低组(ko-linc01978组)、linc01978敲低阴性对照组(ko-control组)共5组细胞，按照5
×
104个/孔细胞将细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，加入适量新鲜培养基，于37℃、5％co2的细胞培养箱中过夜。用移液枪头垂直于细胞培养板划线，用pbs冲洗3次，用无血清的培养基继续培养，倒置显微镜下拍照，分别记录0和24h划痕的宽度，最后收集图片数据分析实验结果，具体结果见图4。
[0078]
由图4可知，在镜下40
×
观察并记录划痕宽度，与control组相比，oe-linc01978组细胞迁移能力显著增强，ko-linc01978组细胞迁移能力显著降低，oe-control组和ko-control组细胞迁移能力未见显著性差异。
[0079]
(4)transwell法验证干扰linc01978对结直肠癌细胞侵袭的影响
[0080]
将提前24h、4℃预冷的matrigel基质胶与预冷的无血清培养基按照1:3比例稀释，每个小室加入100μl稀释后的matrigel基质胶，放置培养箱至凝固。使用rpmi-1640培养基培养sw480细胞(control组)、linc01978过表达组(oe-linc01978组)、linc01978过表达阴性对照组(oe-control组)、linc01978敲低组(ko-linc01978组)、linc01978敲低阴性对照组(ko-control组)共5组细胞，用无血清的培养基调整细胞浓度至5
×
105/ml，取100μl滴于transwell上室，下室加含10％fbs的培养基500μl。常规培养48h后，用棉签擦净下室的matrigel基质胶，随后使用4％多聚甲醇固定，经结晶紫染色后，于显微镜下观察，拍照计数，具体结果见图5。
[0081]
由图5可知，与control组相比，oe-linc01978组细胞侵袭能力显著增强，ko-linc01978组细胞侵袭能力显著降低，oe-control组和ko-control组细胞侵袭能力未见显著性差异。
[0082]
(5)annexin v-fitc/pi双染色法验证干扰linc01978对结直肠癌细胞凋亡的影响
[0083]
使用rpmi-1640培养基培养sw480细胞(control组)、linc01978过表达组(oe-linc01978组)、linc01978过表达阴性对照组(oe-control组)、linc01978敲低组(ko-linc01978组)、linc01978敲低阴性对照组(ko-control组)共5组细胞，收集1
×
105个细胞，按照细胞凋亡试剂盒说明书使用100μl 1
×
binding buffer重悬细胞，加入5μl的fitc annexin v和10μl的pi染色工作液，将细胞置于37℃中避光孵育15min，加入400μl 1
×
annexin-binding buffer，混匀后放置于冰上，对annexin v-fitc荧光选择fitc通路检测，pi荧光选择pi通路检测，各组细胞依次上流式细胞仪检测，具体结果见图6。
[0084]
由图6可知，与control组相比，oe-linc01978组细胞凋亡比例显著降低，ko-linc01978组细胞凋亡比例显著上升，oe-control组和ko-control组细胞凋亡比例未见显著性差异。
[0085]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.linc01978抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述linc01978抑制剂包括抑制linc01978转录和表达的干扰分子。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述干扰分子包括shrna、sirna、dsrna、mirna、反义核酸。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述shrna的功能序列如seq id no:1所示。5.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述linc01978抑制剂用于：抑制结直肠癌细胞增殖；抑制结直肠癌细胞迁移；抑制结直肠癌细胞侵袭；或促进结直肠癌细胞凋亡。6.根据权利要求1～5任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括有效成分以及药学上可接受的载体，所述有效成分为linc01978抑制剂。

技术总结
本发明提供了LINC01978抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用，属于生物医药技术领域。实验结果表明：敲除LINC01978后可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，过表达LINC01978后可促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，细胞凋亡减少。可见，LINC01978抑制剂具有抑制结直肠癌发生发展的作用，存在潜在治疗效果，LINC01978的抑制剂可用于制备治疗结直肠癌的药物。本发明首次提出并验证LINC01978作为结直肠癌的基因治疗新靶点，对于筛选抗结直肠癌新药具有重要意义，也为结直肠癌的治疗提供了一种新思路。肠癌的治疗提供了一种新思路。肠癌的治疗提供了一种新思路。


技术研发人员：赵奕宁 高学仁
受保护的技术使用者：盐城师范学院
技术研发日：2022.08.08
技术公布日：2023/8/14