基于计算机视觉的单克隆质量控制的制作方法

1.本说明书涉及细胞生长的计算机实施的单克隆质量控制，其特别适用于开发用于制造生物药物的细胞系。


背景技术：

2.在用于生产生物药物的细胞系的开发期间，监管要求证明所产生的生产细胞是单克隆来源的。在控制细胞系的单克隆质量方面已经投入了大量的努力。一个重要和有效的方面涉及将单个细胞沉积到微量滴定井中的阶段。已经开发了类似细胞打印的复杂技术来改善细胞生长的单克隆性的可能性。
3.另一个方面是特别在细胞系生产的早期阶段，即在细胞沉积后不久，对细胞生长进行彻底的监测。今天，证明单克隆性的最常见的方法是基于在克隆产生过程之后的几天生长期间收集的显微镜图像。图像的评估是手动完成的。有经验的操作者监测细胞生长，并且如果细胞看起来不是单克隆的，则停止细胞生长。


技术实现要素：

4.期望进一步改善单克隆细胞生产的质量的可靠性。本文中描述的实施方式通过自动确定细胞培养物是否是单克隆的来解决该问题，如独立权利要求中所限定的。在从属权利要求中限定了优选实施方式。
5.因此，在一个方面，提供了用于自动监测(并且优选控制)细胞生长的单克隆质量的计算机实现的方法。该方法包括获取在细胞生长期间的不同时间拍摄的细胞培养物的图像序列(即至少第一图像和第二图像)，例如在拍摄细胞培养物的图像的时间之间具有预定的(优选恒定的)时间间隔。在一个示例中，图像之间的1天(即24小时)的恒定时间间隔可能是优选的。根据具体的细胞和生长条件，可以应用更短或更长的时间间隔。还可以根据细胞/细胞培养物的生长阶段应用变化的时间间隔。这些时间间隔可以是预定的或甚至可以在细胞培养物的生长期间动态地(优选自动地)调整，例如基于单克隆质量控制的中间结果，以便动态地(优选自动地)细化时间分辨率，从而在需要时增加评估的可靠性。
6.优选地，图像序列内的图像是以相同的图像格式获取的。这优选包括相同的空间分辨率和/或在细胞培养物中出现的光强度和/或亮度和/或颜色的相同表示。具体地，优选当拍摄图像时，准备相同或相似的照明条件。这可以改善后续图像分析的可靠性，特别是关于细胞培养物的时间发展。
7.该方法还包括处理图像序列中的每个图像，以识别细胞培养物中细胞的细胞位置，特别是识别细胞培养物中的单个细胞的细胞位置。该图像处理操作的结果可以是点位置的二维图，点位置中的每个代表细胞培养物中的一个细胞。可以将各种技术应用于图像处理，图像处理可以涉及(训练的)卷积神经网络和/或基于定向梯度和/或边缘检测器等的直方图的算法中的一个或多个。例如，深度神经网络可以在手动或自动标记的显微镜图像上被训练或可以已经在手动或自动标记的显微镜图像上被训练。可选地，深度神经网络可
以在合成图像上被训练或可以已经在合成图像上被训练。示例是背景图像，其中细胞形状被复制到具有已知位置和密度的图像中(例如，以点位置的图的形式)。也可以使用这样的组合，深度神经网络可能已经在大量合成图像集合上进行了训练，并且然后在较小的标记的显微镜图像集合上微调。在这种意义上，“标记的”可以意指附加地识别在图像上表示的细胞的点位置(例如，作为二维图)。
8.尽管经过训练的神经网络在与该方法的图像处理操作相关联的情况下可能特别有效，但是可替代地，可以采用其它已知的基于计算机的图像处理的技术。为了实现与本发明相关的进一步评估过程的目的，不需要评估/区分所识别的细胞的内部结构。相反，识别每个细胞的单个点位置就足够了。这可以通过对显微镜图像进行基于计算机的图像处理来非常有效地实现，该显微镜图像可以通过光学显微镜(例如，诸如明场显微镜或相差显微镜)获得。因此，当人类操作人员视觉地观察细胞培养物时，不再需要对细胞进行染色，这在其他方面通常是需要的。在图像中出现的细胞的实际内部结构(包括局部图像对比度的大小和/或形状和/或梯度)可以有效地用于自动识别和定位每个细胞，所识别的细胞的点位置可以设置为所识别的图形结构的中心点，并且可以基于图像的坐标系内的坐标来存储和处理点位置。
9.该方法还包括：对于图像序列中的图像中的至少一些(优选地对于图像中的至少两个，进一步优选地对于每个图像)，确定来自所识别的细胞位置的细胞数量；以及对于图像序列中的至少一个图像(优选地对于多个图像，或甚至对于每个图像)，确定来自所识别的细胞位置的细胞的空间分布。该方法可以特别地包括：对于图像序列中的图像中的至少一个(优选地对于图像中的至少两个，进一步优选地对于每个图像)，确定来自所识别的细胞位置的细胞数量和来自所识别的细胞位置的细胞的空间分布。尽管如果确定或评估图像序列中的多个或所有图像的空间分布是最有效的，但是甚至可以基于来自至少一个图像的细胞的空间分布已经做出细胞生长的有意义的评估和对单克隆质量的相当可靠的决定。
10.该方法还包括评估所确定的细胞数量和所确定的细胞的空间分布与作为单克隆生长的特征的预定的评估条件的顺应性(compliance)。作为单克隆生长的特征的评估条件可以是对于至少一个图像、优选地对于多个图像，预定的细胞的最大数量(阈值)。该阈值(最大)数量可以根据自细胞生长开始以来所经过的时间和/或细胞的类型和/或特定生长条件来具体地预定。因此，这种阈值可以根据例如细胞倍增时间来定义。
11.更具体地，在优选的实施方式中，预定的评估条件限定了细胞的单克隆数量生长速率的阈值(例如，在监测的细胞培养物的生长条件下，单克隆细胞系预期的每次细胞数量的最大增加)。在这种情况下，评估所确定的细胞数量与该预定的评估条件的顺应性可以包括将细胞数量生长速率确定为：图像序列中的两个图像的所确定的细胞数量的差值与拍摄该两个图像的时间之间的时间间隔的比率；并且将确定的细胞数量生长速率与单克隆数量生长速率的阈值进行比较。
12.该方法还包括基于所评估的与所述预定的评估条件的顺应性，评价并且输出单克隆质量指标。该输出可以直接呈现给用户，作为对所监测的细胞生长是否是单克隆的明确决定。可选地或附加地，可以根据细胞生长被评价为非单克隆的警告将输出呈现给用户。优选地，这样的信息可以在已经评价后立即输出，甚至在连续的生长过程期间，使得可以停止生长过程，并且没有进一步的时间、材料和努力投入在非单克隆细胞培养物中。可选地或另
外地，输出可以作为细胞培养物为单克隆的概率值呈现给用户。优选地，这种概率值可以与补充评价结果(例如，在细胞生长期间确定的细胞数量生长速率或其时间发展，和/或细胞位置(例如，对于随后的图像中的一个或多个)的分布的图形图像，和/或其时间发展)一起呈现。因此，人类用户可以基于概率值和补充评价结果做出关于细胞培养物的单克隆质量的最终决定。
13.在优选的实施方式中，评估与预定的评估条件的顺应性包括：基于所确定的细胞数量，评估至少一个概率值(在下文中称为基于细胞计数的概率值)，该基于细胞计数的概率值表示所述细胞培养物是单克隆的概率；以及基于所确定的细胞的空间分布，评估至少一个另外的概率值(在下文中称为基于细胞分布的概率值)，该基于细胞分布的概率值表示所述细胞培养物是单克隆的概率。在本实施方式中，可以至少基于所述基于细胞计数的概率值和所述基于细胞分布的概率值来评价单克隆质量指标。
14.因此，来自不同标准的结果可以以概率方式组合，这意指每个评估结果可以表示基于当前证据的单克隆的概率。然后可以使用例如贝叶斯公式组合这些概率以基于所有证据形成细胞培养物为单克隆的最终概率(或决定)。不同的结果也可以以加权的方式组合，这意指它们对最终的决定具有不同的影响。这些权重可以使用统计推断或机器学习方法自动找到或由专家用户手动设置。
15.优选地，确定细胞的空间分布可以包括：对于至少一个图像，确定为该至少一个图像识别的两个细胞位置之间的距离。此外，评估所确定的空间分布与预定的评估条件的顺应性可以包括将所确定的距离与(预定的)阈值距离进行比较。在优选实施方式中，对于至少一个图像，确定为该至少一个图像识别的两个细胞位置之间的距离包括：确定为该至少一个图像识别的任何两个细胞位置的最大距离，其中，评估所确定的空间分布与预定的评估条件的顺应性包括：将所确定的最大距离与(预定的)阈值距离进行比较。这种方法被证明对于第一对图像(例如细胞生长的天数)特别有效。
16.在优选的实施方式中，确定细胞的空间分布包括：对于图像序列中的至少两个(直接或间接)后续图像，确定两个图像中的第一个图像的细胞位置和两个图像中的第二个图像的细胞位置之间的位移，其中，评估所确定的空间分布与预定的评估条件的顺应性可以包括将所确定的位移与(预定)阈值位移进行比较。在优选实施方式中，对于图像序列中的至少两个(直接或间接)后续图像，确定细胞位置之间的位移包括：确定任意两个细胞位置的最大位移，其中任意两个细胞位置中的一个细胞位置在两个后续图像中的第一个图像中被识别，任意两个细胞位置中的另一个细胞位置在两个后续图像中的第二个图像中被识别，并且其中，评估所确定的空间分布与预定的评估条件的顺应性可以包括将所确定的最大位移与(预定)阈值距离进行比较。
17.在优选实施方式中(具体地，如果要确定不同图像之间的细胞的位移)，该方法还可以包括自动对准图像序列中的(该)至少两个后续图像。这可能意指使用图像对准算法来确保两个图像中的相同位置是指井中的相同物理位置。这种对准可以通过井的物理边缘和/或固定标记和/或基于细胞位置/分布本身来实现。在后一种情况下，可以基于后续图像之间的细胞位置的位置偏移的最小均方根来实现对准。
18.在另一个优选实施方式中，该方法还可以包括：对于图像序列中的至少一个图像(优选对于多个图像，或甚至对于每个图像，最优选至少对于最后一个图像)，从所识别的细
胞位置确定空间相干特性(例如，至少一个空间相干值)；以及评估所确定的空间相干特性与作为单克隆生长的特征的预定的相干条件的顺应性。在这种情况下，基于所评估的与预定的相干条件的顺应性，可以额外地评价(和输出)单克隆质量指标。这种应用用于评价的空间相干标准的方法对于接近细胞生长过程结束的图像(例如，对于最后的图像)是特别有效的。例如，如果在最后一天得到的细胞集落(colony)(培养物)不是空间相干的，则细胞可能被标记为不是单克隆的。空间相干可能意指细胞恰好位于一个聚类(cluster)中。在一个实施方式中，如果找到多于一个的聚类，例如使用具有用于区分聚类的限定距离阈值的基于距离的聚类算法，则可以认为细胞集落在空间上是非相干的。示例算法是单链接分级聚类(gower，john c.和gavin js ross“最小生成树和单链接聚类分析(minimum spanning trees and single linkage cluster analysis)，皇家统计学会期刊：c系列(应用统计)18.1(1969)：54-64)。在另一个实施方式中，如果井中所有细胞之间的距离分布大于(预定的)距离阈值，则可以认为细胞集落在空间上是非相干的。计算距离分布的示例方法是计算最后一天所有细胞之间的距离并计算距离的百分位间范围，例如第10百分位和第90百分位之间的范围。如果百分位间范围宽于定义的阈值，则将细胞标记为空间非相干。
19.在优选的实施方式中，所述预定的评估条件可以限定所述细胞的区域生长速率的阈值。在这种情况下，确定细胞的空间分布包括：对于所述图像序列中的至少两个图像，确定细胞生长区域，作为由相应图像内的细胞培养物覆盖的区域。优选地，评估所确定的细胞的空间分布与所述预定的评估条件的顺应性可以包括：基于对于所述图像序列中的至少两个图像确定的所述细胞生长区域的变化以及拍摄所述两个图像的时间之间的时间间隔，确定细胞区域生长速率；并且将所确定的细胞区域生长速率与单克隆区域生长速率的所述阈值进行比较。
20.在该具体实施方式的一个优选实现方式中，确定所述细胞生长区域可以包括：确定包围所述细胞培养物中所识别的细胞位置的圆圈的最小半径，作为由相应图像内的细胞培养物覆盖的区域。在该具体实施方式的另一个优选实现方式中，确定所述细胞生长区域可以包括：对每个图像执行细胞分割处理，以将细胞的每个识别的细胞位置周围的细胞区域确定为由所述细胞覆盖的区域；并且将所述细胞生长区域确定为每个图像的所述细胞培养物中所确定的细胞区域所覆盖的区域。
21.在优选实施方式中，该方法可以包括：确定所述图像序列中的至少一个图像中的所识别的细胞的细胞位置的密度分布；从所确定的密度分布来评估细胞的聚类点的外观；以及根据评估细胞的聚类点的外观来确定所述单克隆质量。更优选地，所述预定的评估条件限定阈值聚类距离值，其中，如果确定两个或更多个聚类点以彼此相距超过预定的阈值聚类距离值的距离出现在所述密度分布中，则可以决定所述细胞培养物不是单克隆的。
22.在另一方面，本发明提供了用于自动监测细胞生长的单克隆质量的相应计算机系统。具体地，该计算机系统包括：
[0023]-图像获取模块，用于获取在细胞生长期间的不同时间拍摄的细胞培养物的图像序列；
[0024]-图像处理模块，用于处理所述图像序列中的每个图像，以识别所述细胞培养物中细胞的细胞位置；
[0025]-细胞计数模块，用于为所述图像序列的图像中的至少一些确定来自所识别的细
胞位置的细胞数量；
[0026]-空间分布模块，用于为所述图像序列中的至少一个图像确定(st30)来自所识别的细胞位置的细胞的空间分布；
[0027]-顺应性评估模块，用于评估所确定的细胞数量和所确定的细胞的空间分布与作为单克隆生长的特征的预定的评估条件的顺应性；
[0028]-评价模块，用于基于所评估的与所述预定的评估条件的顺应性来评价单克隆质量指标；以及
[0029]-输出接口，用于输出所评价的单克隆质量指标。
[0030]
在又一方面，本发明提供了包括程序代码的计算机程序产品，当所述程序代码在计算机系统中被加载和执行时，使得计算机系统执行根据本文中描述的任何方法的操作。
附图说明
[0031]
在下面的示例性附图和描述中阐述了一个或多个实现方式的细节。根据说明书、附图和权利要求书，其它特征将是显而易见的。然而，应当理解，即使分别描述了实施方式，不同实施方式的单个特征也可以与其它实施方式相结合。
[0032]
图1示出了描述根据本发明实施方式的方法的流程图；
[0033]
图2示出了说明基于单克隆质量的评价的细胞分布的示例性标准的示意图，即a)示出了最大距离标准，以及b)示出了使用作为具体示例的第1天和第2天之间的位置最大错位标准；
[0034]
图3示出了形成的第4天细胞培养物的示例性明场显微镜图像，其中细胞在左图像中是空间相干的，并且在右图像中是非相干的；以及
[0035]
图4示出了图3中所示的明场显微镜图像中的细胞之间的距离分布，从而比较了空间相干和空间非相干细胞分布。顶部直方图示出了空间相干的细胞的距离分布，而底部直方图示出了空间非相干细胞培养物中的距离。
具体实施方式
[0036]
在下面的文本中，将参考附图给出示例的详细描述。应当理解，可以对实施方式进行各种修改。特别地，一个示例的一个或多个元素可以被组合并且在其它示例中被使用以形成新的示例。
[0037]
图1示出了表示根据本发明的示例性实施方式的方法的过程的示意性流程图，其中在一定时间内(例如在几天内)自动地观察和评估细胞系的发展(例如用于制造生物药物)。示例性地，细胞培养物的生长可以从定位在微量滴定井中的单个细胞开始，并且可以基于在细胞生长期间的不同时间采集的细胞培养物的图像序列，考虑其单克隆发育来监测和评估。在一个示例中，可以每天至少拍摄一次至少一个显微镜图像。最优选地，基于在规则的(例如恒定的)时间间隔(例如每24小时)中拍摄的图像进行评估。
[0038]
虽然图1示意性地示出了在进行如下面进一步描述的图像10的分析/处理st20和单克隆质量的评估之前获取(收集)st10显微镜图像10的初始过程，但是图像10可以被分析/处理，并且可以在获取图像的每个时间间隔之后(至少预先或部分地)评估单克隆质量。这种连续的质量评估可以支持在早期可能丢弃非单克隆细胞培养物，以便减少不必要的循
环时间或错误地继续生长在早期可以被证明是非单克隆的细胞培养物。
[0039]
在图1的示例中，可以每天拍摄一次相应的显微镜图像10，即在从单个细胞开始细胞生长之后的第0天、第1天
……
第n天中的每一天拍摄一次相应的显微镜图像10。显微镜图像可以是允许(自动)识别单个细胞的位置的任何类型的显微镜图像。虽然本发明不限于光学显微镜，但是光学显微镜的至少一些技术，例如，诸如明场显微镜和/或相差显微镜，对于本文中描述的评估是充分确立的和非常有效的。优选地，图像序列中的图像包括明场显微镜图像。已经发现，为了实施本发明，光学显微镜的这些具体示例是非常有效的，因为它们足以允许计算机支持的图像分析以可靠地识别细胞位置，同时避免可能不可靠地影响细胞生长的进一步的细胞制备过程，如染色。
[0040]
作为图1的实施方式中的下一个操作，该方法包括处理st20图像序列中的每个图像以识别细胞培养物中细胞的细胞位置20。这些细胞位置可以被存储，并且可以根据细胞位置在预定坐标系中的坐标的集合来进行后续处理。每个细胞位置可以被定义为该坐标系中的点位置。在优选实施方式中，可以训练深度神经网络来识别细胞位置，例如通过语义分割(将细胞与背景分离)、用于定位和/或实例分割的预测细胞区域提议、细胞密度的预测，细胞位置的稀疏编码的回归、或其它目标。
[0041]
如图1进一步所示，至少一些图像的细胞位置20，优选地所有图像的细胞位置20用于确定st40与每个图像对应的细胞50的相应数量。在该实施方式中，对于图像序列中的每个图像，在细胞生长期间，当对细胞培养物是单克隆的情况拍摄相应图像时，可以预期用于细胞培养物的细胞的最大数被提供作为阈值60。然后将每个图像的实际确定的细胞数50与相应的阈值60进行比较st50，从而评估所确定的细胞数与作为单克隆生长的特征的预定的评估条件的最大允许的细胞数60的顺应性结果70。顺应性结果70可以表示每个单独图像的比较结果，即作为对单独的细胞计数是否超过相应的阈值的问题的回答。
[0042]
具体而言，对于所有的天数或天数的子集，可以将细胞计数与每天细胞的最大允许数进行比较。细胞的最大允许数可以基于预期的生长速率来计算。因此，基于细胞生长天数内的细胞计数，可以作出关于细胞是否是单克隆的(第一/初步)决定。
[0043]
优选地独立于细胞计数，该方法包括：对于图像序列中的至少一个图像(优选地为多个或甚至所有图像)，确定st30来自所识别的细胞位置的细胞的空间分布。优选地，但在图1中未示出，这可以包括对准图像，这意指使用图像对准算法来确保两个或更多个图像中的相同位置是指井中的相同物理位置。在图1中所示的实施方式中，确定细胞的空间分布可以包括：确定细胞的距离和/或位错。用于对所确定的细胞的空间分布与作为单克隆生长的特征的预定的评估条件的顺应性进行相应评估的标准可以被提供为相应的阈值30。
[0044]
在图2中示出了用于确定空间分布和用于评估所确定的具有预定的评估条件的细胞的空间分布的顺应性的优选实现方式。图2中的示意图a)表示从指定日期拍摄的单个图像中识别的细胞位置。对于这些细胞位置，确定在相同的培养物中的任何两个细胞之间的最长距离。如果该距离高于限定的阈值距离30，则细胞可以被标记为(潜在地)不是单克隆的。基本原理是，如果两个细胞位于彼此远离，则它们不太可能是来源于单个细胞通过细胞分裂产生。在优选的实施方式中，该过程可特别应用于第0天至第2天，其中井中的细胞相对较少(通常为1到10个)。具体地说，这个过程甚至可以限于前两个图像/天或前三个图像/天。
[0045]
在另一方面，在图2的示意图b)中示出了优选的位错分析。具体地，细胞位置可以在记为第n天(例如，第1天)的一天和记为第n+1天(例如，第2天)的接下来的一天之间进行比较。如果从第n天的任何细胞到第n+1天的细胞的距离大于限定的阈值距离30，则细胞可以被标记为(潜在地)不是单克隆的。基本原理是，预计细胞在第n天和n+1天之间不会移动太远。如果在第n+1天的细胞远离第n天的细胞，则它们可能源自在第n天处于悬浮和散焦(out-of-focus)并且在第n+1天陷入焦点的细胞。在实施方式中，该步骤可以被限制在前两天或前三天，其中它是特别有效的。
[0046]
作为另一个可选的方面，如图1中虚线所示，该方法可以包括评估st70在实验的最后一天的细胞的位移和空间分布。这可能是最保守的试验，并且在细胞需要移入和移出培养箱的情况下不适用或不太适用，因为移动板的过程可能搅乱细胞聚类。图3中示出相干和非相干细胞聚类的说明性示例，相应的距离直方图如图4示出。
[0047]
具体地，如果在最后一天得到的细胞培养物(集落)位于比限定的阈值距离90更远离实验第一天的细胞的位置，则细胞可以被标记为不是单克隆的。在实施方式中，该距离可以被计算为从细胞生长的第一天的细胞到最后一天的细胞的平均质心的最大距离。在另一实施方式中，细胞生长的第一天的细胞与最后一天的细胞之间的距离可以计算为从第一天的细胞到最后一天的细胞的中值距离。
[0048]
如果在最后一天得到的细胞集落不是空间相干的，则细胞可以被标记为(潜在地)不是单克隆的。空间相干可能意指细胞恰好位于一个聚类中。在一个实施方式中，如果使用具有限定的用于区分聚类的距离阈值的基于距离的聚类算法找到一个以上的聚类，则可以认为细胞集落在空间上是非相干的。示例算法是单链接分级聚类(从gower和gavin，1969获知，如前已经提及)。在另一个实施方式中，如果井中所有细胞之间的距离的分布大于限定的距离阈值，则可以认为细胞集落在空间上是非相干的。计算距离分布的示例方法是计算最后一天所有细胞之间的距离并计算距离的百分位间范围，例如第10百分位和第90百分位之间的范围。如果百分位间范围宽于定义的阈值，则细胞可以被标记为(潜在地)不是单克隆的。
[0049]
最佳阈值30、60、90可以使用机器学习方法(例如，经训练以从多克隆培养物分类单克隆的决策树)基于历史决策自动地决定。可选地，可以由专家用户设置阈值30、60、90。
[0050]
然后，来自不同标准的结果可以例如以概率方式组合st60，这意指每个评估结果表示基于当前证据的单克隆的概率。然后可以使用例如贝叶斯公式组合这些概率以基于所有证据形成单克隆的最终概率。不同的结果也可以以加权的方式组合，这意指它们对最终的决定具有不同的影响。这些权重110可以使用统计推断或机器学习方法自动找到或由专家用户手动设置。
[0051]
该方法还包括基于所评估的与预定的评估条件30、50、90的顺应性来评价和输出单克隆质量指标80。该输出80可以呈现给用户，例如在图形用户界面中或打印在报告中。图像处理的结果(即，细胞位置)和/或细胞计数也可以呈现给用户。可选地和/或附加地，结果(至少单克隆质量指标80)可以通过应用编程接口(api)呈现给自主实验室环境的基于计算机的系统部分，其中单克隆决策(单克隆质量指标)可以考虑控制系统。

技术特征：
1.用于自动监测细胞生长的单克隆质量的计算机实现的方法，包括：-获取(st10)在细胞生长期间的不同时间拍摄的细胞培养物的图像序列(10)；-处理(st20)所述图像序列中的每个图像，以识别所述细胞培养物中细胞的细胞位置；-对于所述图像序列中的图像中的至少一些，确定(st40)来自所识别的细胞位置的细胞数量；-对于所述图像序列中的至少一个图像，确定(st30)来自所识别的细胞位置的细胞的空间分布；-评估所确定的细胞数量和所确定的细胞的空间分布与作为单克隆生长的特征的预定的评估条件的顺应性；以及-基于所评估的与所述预定的评估条件的顺应性，评价并且输出单克隆质量指标。2.根据权利要求1所述的方法，其中，评估与预定的评估条件的顺应性包括：基于所确定的细胞数量，评估至少一个基于细胞计数的概率值，所述基于细胞计数的概率值表示所述细胞培养物是单克隆的概率；以及基于所确定的细胞的空间分布，评估至少一个基于细胞分布的概率值，所述基于细胞分布的概率值表示所述细胞培养物是单克隆的概率，其中，至少基于所述基于细胞计数的概率值和所述基于细胞分布的概率值来评价单克隆质量指标。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，确定(st30)细胞的空间分布包括：对于至少一个图像，确定对于所述至少一个图像识别的两个细胞位置之间的距离；以及其中，评估所确定的空间分布与预定的评估条件的顺应性包括：将所确定的距离与阈值距离进行比较。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，确定(st30)细胞的空间分布包括：对于所述图像序列中的至少两个图像，确定所述两个图像中的第一个图像的细胞位置与所述两个图像中的第二个图像的细胞位置之间的位移；以及其中，评估所确定的空间分布与预定的评估条件的顺应性包括：将所确定的位移与阈值位移进行比较。5.根据权利要求4所述的方法，还包括：自动对准所述图像序列中的至少两个后续图像。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：对于所述图像序列中的至少一个图像，从所识别的细胞位置确定(st70)空间相干特征；以及评估所确定的空间相干特征与作为单克隆生长的特征的预定的相干条件的顺应性，其中，基于所评估的与所述预定的相干条件的顺应性，额外地评价所述单克隆质量指标。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述预定的评估条件限定所述细胞的单克隆数量生长速率的阈值；以及其中，评估所确定的细胞数量与所述预定的评估条件的顺应性包括：将细胞数量生长速率确定为：所述图像序列中的两个图像的所确定的细胞数量的差值与拍摄所述两个图像的时间之间的时间间隔的比率；以及
将所确定的细胞数量生长速率与所述单克隆数量生长速率的所述阈值进行比较。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述预定的评估条件限定所述细胞的区域生长速率的阈值；其中，确定所述图像序列中的至少一个图像的细胞的空间分布包括：对于所述图像序列中的至少两个图像，确定细胞生长区域，作为由相应图像内的细胞培养物覆盖的区域；以及其中，评估所确定的细胞的空间分布与所述预定的评估条件的顺应性包括：基于对于所述图像序列中的两个图像确定的所述细胞生长区域的变化以及拍摄所述两个图像的时间之间的时间间隔，确定细胞区域生长速率；以及将所确定的细胞区域生长速率与单克隆区域生长速率的所述阈值进行比较。9.根据权利要求8所述的方法，其中，确定所述细胞生长区域包括：确定包围所述细胞培养物中所识别的细胞位置的圆圈的最小半径，作为由相应图像内的细胞培养物覆盖的区域。10.根据权利要求8所述的方法，其中，确定所述细胞生长区域包括：对每个图像执行细胞分割处理，以将细胞的每个识别的细胞位置周围的细胞区域确定为由所述细胞覆盖的区域；以及将所述细胞生长区域确定为每个图像的所述细胞培养物中所确定的细胞区域所覆盖的区域。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括：确定所述图像序列中的至少一个图像中的所识别的细胞的细胞位置的密度分布；从所确定的密度分布来评估细胞的聚类点的外观；以及根据评估细胞的聚类点的外观来确定所述单克隆质量。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述预定的评估条件限定阈值聚类距离值；以及其中，如果确定两个或更多个聚类点以彼此相距超过预定的阈值聚类距离值的距离出现在所述密度分布中，则决定所述细胞培养物不是单克隆的。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述图像序列中的所述图像包括明场显微镜图像。14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中，处理(st20)所述图像序列中的每个图像以识别所述细胞培养物中细胞的细胞位置是通过训练的深度神经网络执行的，优选通过卷积神经网络执行的。15.用于自动监测细胞生长的单克隆质量的计算机系统，包括：-图像获取模块，用于获取在细胞生长期间的不同时间拍摄的细胞培养物的图像序列(10)；-图像处理模块，用于处理所述图像序列中的每个图像，以识别所述细胞培养物中细胞的细胞位置；-细胞计数模块，用于为所述图像序列的图像中的至少一些确定来自所识别的细胞位置的细胞数量；-空间分布模块，用于为所述图像序列中的至少一个图像确定(st30)来自所识别的细
胞位置的细胞的空间分布；-顺应性评估模块，用于评估所确定的细胞数量和所确定的细胞的空间分布与作为单克隆生长的特征的预定的评估条件的顺应性；-评价模块，用于基于所评估的与所述预定的评估条件的顺应性来评价单克隆质量指标；以及-输出接口，用于输出所评价的单克隆质量指标。

技术总结
本说明书涉及细胞生长的单克隆质量的计算机实现的监测，其特别适用于开发用于制造生物药物的细胞系。在一个方面，提供了计算机实现的方法，包括：获取(ST10)在细胞生长期间的不同时间拍摄的细胞培养物的图像序列(10)；处理(ST20)图像序列中的每个图像，以识别细胞培养物中细胞的细胞位置；对于图像序列的图像中的至少一些，确定(ST40)来自所识别的细胞位置的细胞数量；对于图像序列中的至少一个图像，确定(ST30)来自所识别的细胞位置的细胞的空间分布；评估所确定的细胞数量和所确定的细胞的空间分布与作为单克隆生长的特征的预定的评估条件的顺应性；以及基于所评估的与预定的评估条件的顺应性，评价并且输出单克隆质量指标。标。标。


技术研发人员：里卡德
受保护的技术使用者：赛多利斯司特蒂姆数据分析公司
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2023/8/14