用于免疫测定的包含二溴哒嗪二酮的标记物及其生产和使用方法与流程

用于免疫测定的包含二溴哒嗪二酮的标记物及其生产和使用方法
1.相关申请的交叉引用/通过引用并入的声明
2.不适用。
3.关于联邦政府资助的研究或开发的声明
4.不适用。
5.背景
6.胰腺癌占美国所有癌症的约3％，并且占所有癌症死亡的约7％。由于缺乏体征或症状，胰腺癌是难以早期诊断的。到开始观察到症状时，肿瘤经常已长得非常大或已经扩散到胰腺外。因此，胰腺癌是所有癌症中存活率最低的癌症之一。
7.肿瘤标志物可用于各种癌症的诊断和管理中。特别地(但非限制性地)，癌抗原19-9(ca 19-9)是关于胰腺癌和结肠直肠癌的肿瘤标志物。ca 19-9是一种糖蛋白，lewis血型抗原的唾液酸化形式，并且在血清中作为粘蛋白存在。ca 19-9由正常人胰腺细胞和胆管细胞以及胃、结肠、子宫内膜和唾液上皮合成，并且血清中的ca 19-9水平升高可以是胰腺、胃和肝胆恶性肿瘤的指示。针对ca 19-9的最初的单克隆抗体由人结肠癌细胞系开发，如1979年公开的(koprowski等人(1979)somatic cellgenet.，5：957-971)，并且关于ca 19-9的许多不同的免疫测定自那以后已得到开发并且是商购可得的。这些自动化的、商购可得的ca 19-9测定的性能特性也已得到评价(参见例如(但不限于)stern等人(2001)clin chem lab med.，39：1278-1282；以及la’ulu等人(2007)am j clin pathol，127：436-440)。自动化的、商购可得的ca 19-9测定的非限制性实例包括centaurca 19-9测定(siemens healthcare diagnostics inc.，tarrytown，ny)；i2000ca 19-9xr测定(abbott diagnostics，abbott park，il)；2000gi-ma测定(diagnostic products，los angeles，ca)；elecsys e170ca 19-9测定(roche diagnostics，indianapolis，in)；以及dxi 800gi monitor(beckman coulter，fullerton，ca)。
8.尽管自动化的、商购可得的免疫测定的可用性，但对于这些测定观察到的灵敏度、准确度和环境温度效应(ate)需要改进。
9.使用功能化的二溴哒嗪二酮的抗体-药物-缀合物(adc)已在用于治疗用途的药物研究中得到报道(参见例如，bahou等人(2018)organic&biomolecular cbemistry，16：1359-1366；tsuchikama等人(2018)protein cell，9：33-46；以及美国专利申请公开号us 2015/0031861(2015年1月29日公开))。建议通过经由新的巯基化学将还原的完整抗体缀合在一起，这些adc的结合亲和力和长期稳定性可以更好地得到保存，以用于治疗用途。特别地，dibrpd接头平台已用于adc(robinson等人(2017)rsc adv.，7：9073-9077；maruani等人(2015)nat.commun.，6：6645)、抗体缀合物(lee等人(2017)chem.sci.，8：2056-2060；lee等人(2016)cbem.sci.，7：799-802)、抗体导向光敏剂(maruani等人(2015)chem.commun.，51：15304-15307；bryden等人(2018)bioconjugate chem.，29：176-181)、蛋白质-蛋白质缀合
物(morgan等人(2015)org.niomol.chem.，13：4165-4168)、以及靶向纳米治疗剂(greene等人(2018)chem.sci.，9：79-87)的生成中。
10.然而，这种抗体缀合技术尚未在诊断行业中进行探索。
11.因此，本领域需要用于免疫测定中的新的和改进的标记物、接头和试剂，其克服现有技术的缺点和缺陷。本公开涉及此类组合物以及含有其的试剂盒和微流体装置及其生产和使用方法。
附图说明
12.图1示意性地描绘了按照本公开，用于检测癌症标志物ca 19-9的免疫测定的测定形式和原理的一个非限制性实施方案。免疫测定采用包括用单克隆抗ca 19-9抗体共价标记的顺磁性颗粒(pmp)的固相试剂，以及包括抗ca 19-9单克隆抗体-吖啶鎓酯(ca 19-9-mab-ae)缀合物的发光试剂(lite reagent)。
13.图2示意性地描绘了两种ca 19-9-mab-ae缀合物的结构：ca 19-9-mab-mcc-heg-dmae和ca 19-9-mab-teg-t spae。
14.图3示意性地描绘了按照本公开设计且合成的五种不同的二溴哒嗪二酮-吖啶鎓酯(dibrpd-ae)标记物的结构。
15.图4示意性地描绘了按照本公开构建的两种ca 19-9-mab-ae缀合物的结构：ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae和ca 19-9-mab-disfpd-teg-tspae。
16.图5示意性地描绘了图2的ca 19-9-mab-mcc-heg-dmae缀合物的合成。
17.图6示意性地描绘了图2的ca 19-9-mab-teg-tspae缀合物的合成。
18.图7示意性地描绘了图3的三种dibrpd-ae标记物的合成。
19.图8示意性地描绘了图3的另外两种dibrpd-ae标记物的合成。
20.图9示意性地描绘了图4的ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae缀合物的合成。
21.图10示意性地描绘了图4的ca 19-9-mab-disfpd-teg-tspae缀合物的合成。
22.图11含有四种mab-ae缀合物在非还原条件和还原条件下的sds page凝胶的照片。4-20％标准，tgx sds page，非还原和还原，以及biosafe考马斯染色。泳道2-mw标准品。泳道4-yy106908455a：ca 19-9mab mcc heg-dmae。泳道5-yy106908455b：ca 19-9mab baatspae。泳道6-yy107758234：ca 19-9mab disfpd tspae。泳道7-yy108033040b：ca 19-9mab disfpd heg-dmae。泳道8-单独的ca 19-9mab。泳道11-还原的yy106908455a。泳道12-还原的yy106908455b。泳道13-还原的yy107758234。泳道14-还原的yy108033040b。泳道15-还原的ca 19-9ab。
23.图12图解示出了使用具有不同接头化学的ca 19-9-mab-x-heg-dmae缀合物(其中“x”是nhs、mcc和disfpd)生成的标准曲线。使用由ca19-9抗体(克隆1116ns 19-9)包被的顺磁性颗粒，以及含有nhs-heg-dmae、mcc-heg和disfpd-heg-dmae的ae标记物的抗体缀合物，来生成结合曲线。
具体实施方式
24.在通过示例性语言和结果详细解释本公开的至少一个实施方案之前，应理解，本公开在其应用方面并不限于下述描述中阐述的构建细节和组分布置。本公开能够具有其它
实施方案，或者能够以各种方式实践或进行。因此，本文使用的语言意图给予最广泛的范围和含义；并且实施方案意欲是示例性的-而非详尽的。另外，应理解，本文采用的措辞和术语是用于描述的目的，并且不应被视为限制性的。
25.除非本文另有定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应该具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。前述技术和程序一般根据本领域众所周知，并且如在本说明书自始至终引用且讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法执行。与本文所述的分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学结合利用的命名法以及实验室程序和技术是本领域众所周知和常用的那些。标准技术用于化学合成和化学分析。
26.本说明书中提到的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物指示本公开所属领域的技术人员的技术水平。在本技术的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物明确地通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个个别专利或出版物具体地和个别地指出通过引用并入。
27.按照本公开，无需过度实验可以制备且执行本文公开的所有制品、组合物、试剂盒和/或方法。虽然已按照特定实施方案描述了制品、组合物、试剂盒和/或方法，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文描述的制品、组合物、试剂盒和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序应用变化，而不脱离本公开的概念、精神和范围。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改被认为在如由所附权利要求限定的本公开的精神、范围和概念内。
28.如按照本公开利用的，除非另有说明，否则下述术语应理解为具有下述含义：
29.当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，术语“一个”或“一种”可以意指“一个/种”，但它也与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/种”以及“一个/种或多于一个/种”的含义一致。因此，除非上下文另有明确说明，否则术语“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“化合物”可以指一种或多种化合物、两种或更多种化合物、三种或更多种化合物、四种或更多种化合物、或者更多数目的化合物。术语“多个”指“两个或更多个”。
30.术语“至少一个”的使用应理解为包括一个以及多于一个的任何数目，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100等。术语“至少一个”可以延伸直到100或1000或更多，这取决于它与之附接的术语；另外，100/1000的数量并不视为限制性的，因为更高的限制也可产生令人满意的结果。另外，术语“x、y和z中的至少一个”的使用应理解为包括单独的x、单独的y和单独的z，以及x、y和z的任何组合。例如，序数数字术语(即“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅用于区分两个或多个项目的目的，并不意欲暗示项目超过另一个的任何顺序或次序或重要性或者任何添加次序。
31.权利要求中术语“或”的使用用于意指包含性的“和/或”，除非明确指出仅指替代物或除非替代物是互相排斥的。例如，条件“a或b”满足下述中的任一种：a为真(或存在)且b为假(或不存在)，a为假(或不存在)且b为真(或存在)，并且a和b均为真(或存在)。
32.如本文使用的，对“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(an embodiment)”、“一些实施方案”、“一个实例(one example)”、“例如”或“一个实例(an example)”的任何提及意指与实施方案结合描述的特定元件、特征、结构或特性包括在至少
一个实施方案中。例如，在说明书各处出现的短语“在一些实施方案中”或“一个实例”并不一定都指相同的实施方案。进一步地，对一个或多个实施方案或实例的所有提及被解释为对权利要求是非限制性的。
33.本技术自始至终，术语“约”用于指示值包括组合物/仪器/装置的固有误差变化、用于确定值的方法、或研究物体中存在的变化。例如但不作为限制，当利用术语“约”时，指定值可以从指定值变化正或负百分之二十、或百分之十五、或百分之十二、或百分之十一、或百分之十、或百分之九、或百分之八、或百分之七、或百分之六、或百分之五、或百分之四、或百分之三、或百分之二或百分之一，如此类变化适于执行所公开的方法并且如本领域普通技术人员所理解的那样。
34.如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)、或“含有(contain)”(以及任何形式的含有，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容或开放式，并且不排除另外未列举的要素或方法步骤。
35.如本文使用的，术语“或其组合”指该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”预期包括以下中的至少一种：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果次序在特定背景下是重要的，则也是ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个项目或术语的重复的组合，例如bb、aaa、aab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等等。本领域技术人员应理解，除非根据上下文另外显而易见，否则通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制。
36.如本文使用的，术语“基本上”意指随后描述的事件或情况完全发生、或者随后描述的事件或情况在很大程度上或范围内发生。例如，当与特定事件或情况相关时，术语“基本上”意指随后描述的事件或情况在至少80％的时间、或至少85％的时间、至少90％的时间、或至少95％的时间发生。术语“基本上相邻的”可以意指两个项目彼此100％相邻，或者两个项目彼此紧密相邻，但并非彼此100％相邻，或者两个项目之一的一部分与另一个项目并非100％相邻，而是与另一个项目紧密相邻。
37.如本文使用的，短语“与
……
相关”和“与
……
偶联”包括两个部分彼此的直接相关/结合以及两个部分彼此的间接相关/结合两者。例如，相关/偶联的非限制性实例包括一个部分通过直接键或通过间隔基团与另一个部分的共价结合，一个部分直接或借助于与部分结合的特异性结合对成员与另一个部分的非共价结合，例如通过将一个部分溶解于另一个部分中或通过合成、并且将一个部分涂布到另一个部分上，将一个部分掺入另一个部分内。
38.术语“类似物”和“衍生物”在本文中可互换使用，并且指这样的物质，其在其结构中包含与给定化合物相同的基本碳骨架和碳官能度，但也可以含有关于其的一个或多个取代。如本文所用，术语“取代”应理解为指用残基r替换化合物上的至少一个取代基。在某些非限制性实施方案中，r可以包括h，羟基，硫醇，选自氟化物、氯化物、溴化物或碘化物的卤化物，选自下述之一的c1-c4化合物：任选取代的线性、分支或环状烷基，以及线性、分支或环状烯基，其中任选的取代基选自一个或多个烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳
基烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基，其各自是任选取代的，其中所述任选的取代基选自以下中的一个或多个：烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、烷基芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基、苯基、氰基、羟基、烷基、芳基、环烷基、氰基、烷氧基、烷硫基、氨基、-nh(烷基)、-nh(环烷基)2、羧基和-c(o))-烷基。
39.如本文所用，术语“样品”应理解为包括可以按照本公开利用的任何类型的生物样品。可以利用的流体生物样品的实例包括但不限于全血或其任何部分(即血浆或血清)、尿、唾液、痰、脑脊液(csf)、皮肤、肠液、腹腔内液、囊液、汗、间质液、细胞外液、泪、粘液、膀胱冲洗液、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液、其组合等等。
40.术语“特异性结合配偶体”或“分析物特异性结合剂”应理解为指能够与靶分析物特异性结合的任何分子。例如但不限于，结合剂/结合配偶体可以是抗体、受体、配体、适体、分子印迹聚合物(即无机基质)、其任何片段及其任何组合或衍生物、以及能够特异性结合靶分析物的任何其它分子。
41.术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体地(但不限于)涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、上述任一种的片段、以及上述任一种的缀合物，只要它们显示出分析物结合的所需生物活性。因此，术语“抗体”或“抗体肽”指全长免疫球蛋白分子(即完整抗体)或其抗原结合片段，其与完整抗体竞争特异性抗原结合。抗原结合片段可以通过重组dna技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割而产生。抗原结合片段包括fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fv、scfv、二硫键连接的fv、fd、双抗体、单链抗体、单结构域抗体(例如但不限于)、以及保留完整抗体的可变区的至少一部分的其它抗体片段或其缀合物、抗体替代蛋白或肽(即改造的结合蛋白/肽)及其组合或衍生物。参见例如，hudson等人(nature med.(2003)9：129-134)。抗体可以具有任何类型或类别(例如，igg、ige、igm、igd和iga)或亚类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。
42.如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”指保留结合抗原的能力的一个或多个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。在术语抗体的“抗原结合片段”内包含的结合片段的实例包括但不限于fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fv、scfv、二硫键连接的fv、fd、双抗体、单链抗体、单结构域抗体(例如但不限于)、分离的cdrh3以及保留完整抗体的可变区的至少一部分的其它抗体片段。这些抗体片段使用常规重组和/或酶促技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选抗原结合。
43.如本文所用，“抗体重链”指以其天然存在的构象的所有抗体分子中存在的两种类型的多肽链中较大的链。
44.如本文所用，“抗体轻链”指以其天然存在的构象的所有抗体分子中存在的两种类型的多肽链中较小的链。κ和λ轻链指两种主要的抗体轻链同种型。
45.术语“cdr”及其复数“cdrs”指抗体或抗体片段的互补决定区(cdr)，其决定抗体或抗体片段的结合特性。在大多数情况下，三个cdr存在于轻链可变区中(cdrl1、cdrl2和cdrl3)，并且三个cdr存在于重链可变区中(cdrh1、cdrh2和cdrh3)。cdr促成抗体分子的功能活性，并且由构成脚手架(scaffolding)或框架区的氨基酸序列分开。在各种cdr中，cdr3
序列且特别是cdrh3是最多样化的，并且因此具有对抗体特异性的最大贡献。存在用于确定cdr的至少两种技术：(1)基于跨物种序列可变性的方法(即，通过引用以其整体并入的kabat等人，sequences of proteins of immunological interest(national institute of health，bethesda，md.(1987))；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(通过引用以其整体并入的chothia等人，nature，342：877(1989))。
46.术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或t细胞受体的任何蛋白质决定簇。在某些实施方案中，表位是由抗体特异性结合的抗原区域。表位决定簇通常包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在某些实施方案中，表位可以具有特异性三维结构特性(例如，“构象表位”)、以及比电荷特性。
47.如果特定抗体特异性结合两个表位，则表位被定义为与另一个表位“相同”。在某些实施方案中，具有不同的一级氨基酸序列的多肽可以包含相同的表位。在某些实施方案中，相同的表位可以具有不同的一级氨基酸序列。如果不同的抗体竞争与该表位的特异性结合，则它们被说成结合相同的表位。
48.当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的抗原时，它“特异性结合”抗原。在某些实施方案中，抗体包含特异性结合特定表位的抗原结合位点。在某些此类实施方案中，抗体能够结合不同的抗原，只要不同的抗原包含该特定表位或紧密相关的表位。在某些情况下，例如，来自不同物种的同源蛋白质可能包含相同的表位。在某些实施方案中，抗体特异性结合抗原，其解离常数不大于10-6
m、10-7
m、10-8
m或10-9
m。当抗体特异性结合受体或配体(即，反受体)时，它可以基本上抑制受体与配体的粘附。如本文所用，当过量的抗体使受体与配体结合的数量减少至少约20％、40％、60％或80％、85％或90％(如在体外竞争性结合测定中测量的)时，抗体基本上抑制受体与配体的粘附。
[0049]“分离的”抗体是已与它在其中产生环境的组分分开和/或从其中回收的抗体。其生产环境的污染物组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可能包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施方案中，如可通过至少三种不同的方法测量的，抗体将被纯化至：1)如通过lowry方法确定的，按重量计大于50％，例如按重量计多于75％、或按重量计多于85％、或按重量计多于95％、或按重量计多于99％的抗体；2)通过使用旋杯式测序仪足以获得至少10个残基的n末端或内部氨基酸序列，例如至少15个残基的序列的程度；或3)使用考马斯蓝或可替代地银染色，在还原条件或非还原条件下，通过sds-page的同质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体在其中产生的环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤进行制备。另外，“分离的抗体”基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体。然而，分离的抗体可以与其它相关抗原具有一些交叉反应性。
[0050]
术语“抗体突变体”指抗体的氨基酸序列变体，其中一个或多个氨基酸残基已进行修饰。此类突变体必须与氨基酸序列具有小于100％的序列同一性或相似性，所述氨基酸序列与抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75％，例如至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。
[0051]
如本文所用，术语“单克隆抗体”指从特异性结合相同表位的基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然存在的突变之外，构成该群体的各个抗体是相同的。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂形成对
比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优点在于，在一种生产方法中，它们可以通过杂交瘤培养物进行合成，并且因此不受其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆的”指示抗体的特性为从基本上同质的抗体群体中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法的抗体生产。例如，在一个实施方案中，按照本公开产生的单克隆抗体可以通过首先由kohler和milstein(nature，256：495(1975))描述的杂交瘤方法进行制备。
[0052]
按照本公开利用的单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法产生，所述方法包括但不限于有意免疫方案的结果；在疾病或癌症过程中，导致抗体天然产生的免疫应答的结果；噬菌体衍生抗体；等等。除上文列出的杂交瘤生产方法之外，本公开的单克隆抗体可以通过其它各种方法生产，所述方法例如但不限于重组dna方法(参见例如美国专利号4,816,567)；从噬菌体展示文库中分离抗体片段(参见例如，clackson等人，nature(1991)352：624-628；和marks等人，j.mol.biol.(1991)222：581-597)；以及各种其它单克隆抗体生产技术(参见例如，harlow和lane(1988)antibodies：alaboratory manual(cold spring harbor laboratory，cold spring harbor，n.y.))。进一步地，可以用于本文公开或另外考虑的缀合物和方法中的许多单克隆抗体是广泛商购可得的，并且因此其进一步描述被视为不必要的。
[0053]
如本文所用，“基本上纯的”意指目标种类是存在的占优势种类(即，在摩尔基础上，它比组合物中的任何其它各个种类更丰富)。一般地，基本上纯的组合物将构成组合物中存在的所有大分子种类的多于约50％，例如多于约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和99％。在一个实施方案中，目标种类被纯化至基本同质性(通过常规检测方法在组合物中无法检测到污染物种类)，其中所述组合物基本上由单一大分子种类组成。
[0054]“分析物”是能够被分析物特异性结合配偶体例如(但不限于)抗体识别的分子。分析物包含至少一个抗原决定簇或“表位”，其是与分析物特异性结合配偶体(即，抗体)结合的分析物区域。
[0055]
如本文所用，术语指基于发光氧通道测定(luminescentoxygen channeling assay)技术的商业上使用的免疫测定技术。高级化学发光测定例如在美国专利号5,340,716(ullman等人)中进行描述，所述美国专利的全部内容通过引用明确并入本文。目前可用的技术具有高灵敏度并使用几种试剂。特别地，测定要求这些试剂中的两种(被称为“感光珠(sensibead)”和“发光珠(chemibead)”)由其它特异性结合配偶体测定试剂以这样的方式保持，由此感光珠和发光珠彼此紧密接近，以实现信号。当暴露于以特定波长的光时，感光珠释放单线态氧，并且如果两种珠紧密接近，则单线态氧转移到发光珠；这引起化学反应，其导致发光珠释放出可以在不同波长下进行测量的光。
[0056]
例如(但不限于)，类似于loci测定的测定可以包括(i)组合物，其包含：单线态氧可激活的化学发光化合物以及被激活的化学发光化合物激发的荧光分子；以及(ii)包含能够在其激发态下生成单线态氧的敏化剂的组合物。
[0057]
本公开的某些非限制性实施方案涉及可以与分析物特异性结合剂，例如(但不限于)分析物结合蛋白或肽(例如但不限于抗体或其片段)一起利用的标记物。在某些非限制
性实施方案中，标记物包括经由间隔物(b)连接的二溴哒嗪二酮(dibrpd)和信号分子(a)，并具有式i的结构：
[0058][0059]
其中：“a”包含选自发光标记物和酶促标记物的信号分子；“b”是选自烷基、烯基、炔基或芳烷基(其可以是线性或分支的)的间隔物，其中所述间隔物含有0至20个杂原子；并且当n＝1时，“c”是包含1至40个碳原子和0至20个杂原子的基团。
[0060]
例如但不限于，标记物可以具有式ii或iii的结构：
[0061][0062]
可以按照本公开利用本领域已知或本文另外考虑的任何发光标记物。可以利用的特定类型的发光标记物的非限制性实例包括化学发光标记物、荧光标记物、发光氧通道珠或类似组合物、电化学发光(ecl)标记物等等、以及其任何组合。
[0063]
本领域已知或本文另外考虑的任何化学发光标记物可以用作式i中的“a”的信号分子。许多不同的化学发光标记物是本领域已知并且商购可得的；进一步地，选择特定的化学发光标记物以按照本公开使用完全在本领域普通技术人员的技能内。
[0064]
在特定的非限制性实施方案中，按照本公开利用的化学发光标记物具有式iv的结构：
[0065][0066]
其中“r1”选自具有1至35个碳原子和0至20个杂原子的烷基、烯基、炔基或芳烷基；磺丙基或磺丁基；和基团-ra-z，其中ra是选自具有1至35个碳原子和0至20个杂原子的烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基团。另外，“r2”置于c1至c4的一个或多个位置处，并且每个“r2”独立地选自氢、烷基、or、oh、sr、sh、nh2和nr’r”，其中r、r’和r”各自独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基和芳烷基，其中每个基团含有0至20个杂原子。另外，“r3”置于c5至c8的一个或多个位置处，并且每个“r3”独立地选自氢、烷基、or、oh、sr、sh、nh2和nr’r”，其中r、r’和r”各自独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基和芳烷基，其中每个基团含有0至20个杂原子。进一步地，“x”是氧或氮，并且当“x”是氧时，“z”被省略，且当“x”是氮时，“z”是so
2-y。另外，“y”是选自卤化或未卤化的、支链或直链烷基；取代或未取代的芳基；和杂环基团的基团。“y”基团还包含0至20个杂原子，并且进一步包含连接到式i的间隔物“b”的官能团。另外，“a
‑”
是引入的抗衡离子，例如(但不限于)与所述吖啶鎓核的四价氮配对，并且“a
‑”
选自ch3so
4-、fso
3-、cf3so
4-、c4f9so
4-、ch3c6h4so
3-、卤化物、cf3coo-、ch3coo-和no
3-。
[0067]
在特定的非限制性实施方案中，按照本公开利用的化学发光标记物是具有式v的结构的化学发光吖啶鎓酯：
[0068]
[0069]
其中：“r
1”、“r
2”、“r
3”和“a
‑”如上文参考式iv所定义的；“r
4”和“r
8”各自独立地选自氢或烷基、烯基、炔基、烷氧基(-or)、烷硫基(-sr)或取代的氨基，其作用于例如(但不限于)通过空间和/或电子效应来稳定吖啶鎓核和“y”部分之间的-cox-键合。另外，“r
5”、“r
6”和“r
7”各自独立地选自氢或烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其中每个基团含有0至20个杂原子。另外，“r
5”、“r
6”和“r
7”之一进一步包含与式i的间隔物“b”连接的官能团。可以按照本公开利用的官能团包括但不限于下述基团：
[0070][0071]
在特定的非限制性实施方案中，按照本公开利用的化学发光标记物是具有式vi的结构的二甲基苯基吖啶鎓酯：
[0072][0073]
其中“r
1”是甲基或磺丙基；“r
2”和“r
3”各自独立地选自氢或甲氧基、磺丙氧基或聚(乙)二醇氧基；并且“r
6”是与式i的间隔物“b”连接的酰胺基(conh-)。“a
‑”如式iv中所定义的。
[0074]
本领域已知或本文另外考虑的任何荧光标记物可以用作式i中的“a”的信号分子。许多不同的荧光标记物是本领域已知并且商购可得的；进一步地，选择特定的荧光标记物以按照本公开使用完全在本领域普通技术人员的技能内。可以利用的荧光标记物的非限制性实例包括呫吨衍生物，例如(但不限于)荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红和得克萨斯红；二吡咯亚甲基衍生物，例如(但不限于)bodipy和氮杂-bodipy；花青衍生物，例如(但不限于)花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青和部花青；方酸衍生物和环取代的方酸，例如(但不限于)seta和square染料；方酸轮烷衍生物；萘衍生物，例如(但不限于)丹磺酰和prodan衍生物；香豆素衍生物；噁二唑衍生物，例如(但不限于)吡啶基噁唑、硝基苯并噁二
唑和苯并噁二唑；蒽衍生物，例如(但不限于)蒽醌，包括draq5、draq7和cytrak orange；芘衍生物，例如(但不限于)级联蓝(cascade blue；)；噁嗪衍生物，例如(但不限于)尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫和噁嗪170；吖啶衍生物，例如(但不限于)原黄素、吖啶橙和吖啶黄；芳基次甲基衍生物，例如(但不限于)金胺、结晶紫和孔雀石绿；四吡咯衍生物，例如(但不限于)卟吩、酞菁和胆红素。
[0075]
可以按照本公开利用本领域已知或本文另外考虑的任何发光氧通道珠或类似组合物。其非限制性实例包括(i)包含单线态氧可激活的化学发光以及被激活的化学发光化合物激发的荧光分子的组合物；以及(ii)包含能够在其激发态下生成单线态氧的敏化剂的组合物。其特定的非限制性实例包括含有二甲基噻吩和铕染料的loci发光珠。
[0076]
可以按照本公开利用本领域已知或本文另外考虑的任何电化学发光(ecl)标记物。许多不同的ecl标记物是本领域已知并且商购可得的；进一步地，选择特定的ecl标记物以按照本公开使用完全在本领域普通技术人员的技能内。其一个非限制性实例是钌络合物。
[0077]
可以按照本公开利用本领域已知或本文另外考虑的任何酶促标记物。许多不同的酶促标记物是本领域已知并且商购可得的；进一步地，选择特定的酶促标记物以按照本公开使用完全在本领域普通技术人员的技能内。可以利用的酶促标记物的非限制性实例包括辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(alp)；β-半乳糖苷酶(β-gal)、葡萄糖氧化酶(go)等等、以及其任何组合。
[0078]
在一个特定的非限制性实施方案中，标记物是具有式vii的结构的二溴哒嗪二酮-二甲基苯基吖啶鎓酯(dibrpd-dmae)：
[0079][0080]
其中“a
‑”
如式iv中所定义的。
[0081]
在一个特定的非限制性实施方案中，标记物是具有式viii的结构的二溴哒嗪二酮-六(乙)二醇-二甲基苯基吖啶鎓酯(dibrpd-hegae)：
[0082][0083]
在一个特定的非限制性实施方案中，标记物是具有式ix的结构的二溴哒嗪二酮-两性离子吖啶鎓酯(dibrpd-zae)：
[0084][0085]
在一个特定的非限制性实施方案中，标记物是具有式x的结构的二溴哒嗪二酮-三乙二醇-三磺基丙基吖啶鎓酯(dibrpd-teg-tspae)：
[0086][0087]
在一个特定的非限制性实施方案中，标记物是具有式xi的结构的二溴哒嗪二酮-2-异丙基吖啶鎓酯(dibrpd-isozae)：
[0088][0089]
本公开的某些非限制性实施方案涉及缀合物，其包含本文上文描述或另外考虑的任何标记物中的一种或多种。例如(但不限于)，缀合物可以包括具有能够还原为两个巯基的至少一个二硫键的分析物特异性结合剂，并且任何这些标记物中的至少一种直接或间接地附接到分析物特异性结合剂的两个巯基，从而形成缀合物。
[0090]
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，缀合物具有式xii的结构：
[0091][0092]
其中“结合剂”表示分析物特异性结合剂，并且“a”、“b”和“c”如式i中所定义的。在特定的(但非限制性的)实施方案中，“a”定义为具有式iv、v或vi之一的结构。
[0093]
例如(但不限于)，缀合物可以具有式xiii或xiv的结构：
[0094][0095]
其中“结合剂”表示分析物特异性结合剂，并且“a”、“b”和“c”如式i中所定义的。
[0096]
分析物特异性结合剂可以是本领域已知或本文另外考虑的任何蛋白质或肽，只要该蛋白质/肽具有能够还原为两个巯基的至少一个二硫键，并且可以与标记物缀合以按照本公开发挥功能。在某些非限制性实施方案中，分析物特异性结合剂具有至少两个、至少三个或至少四个二硫键(或更多个)，每个二硫键能够被还原为两个巯基用于附接到标记物。
[0097]
分析物特异性结合剂可以结合对于其需要检测的任何靶分析物。在某些非限制性实施方案中，靶分析物可以是癌症标志物或心脏标志物。癌症标志物的非限制性实例包括ca 19-9、ca 125、ca 15-3、前列腺特异性抗原(psa)、癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白(afp)、人绒毛膜促性腺激素(hcg)等等。心脏标志物的非限制性实例包括肌钙蛋白(tni)、bnp(b型利钠肽)、probnp(b型利钠肽原；例如但不限于n末端b型利钠肽原(nt-probnp))、肌酐激酶(ck-mb)、乳酸脱氢酶(ldh)等等。
[0098]
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂选自单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、分析物结合蛋白或其片段、肽及其组合或衍生物。
[0099]
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是单克隆抗体或其片段。单克隆抗体或其片段的铰链区包括在其铰链区中的四个链间二硫键，并且所述四个链间二硫键各自可以被还原为两个巯基，用于附接到本公开的任何标记物。因此，作为蛋白质含有单克隆抗体(或其片段)的缀合物可以包括在其中的最多四个标记物分子。
[0100]
由于标记物的附接在单克隆抗体的非可变铰链区中发生，因此单克隆抗体的抗体特异性是完全无关的；任何单克隆抗体(或其片段)结合标记物的能力不依赖于抗体特异性。因此，可以按照本公开利用任何单克隆抗体(或其片段)，并且因此，可以按照本公开使用的抗体(或其片段)的特性或结构的进一步描述被视为不必要的。
[0101]
在一个特定的(但非限制性的)实施方案中，单克隆抗体或其片段是抗ca 19-9单克隆抗体或其片段。抗ca 19-9单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗ca 19-9单克隆抗体可以得自abcam(cambridge，uk)；abnova corporation(walnut，ca)；agilent technologies(santa clara，ca)；antibodies-online inc.(limerick，pa)；biocare medical(pacheco，ca)；biorbyt ltd.(st.louis，mo)；creative diagnostics(shirley，ny)；cell sciences(newburyport，ma)；eastcoast bio(north berwick，me)；enzo life sciences，inc.(farmingdale，ny)；fitzgerald industries international(acton，ma)；lifespan biosciences(seattle，wa)；mybiosource，inc.(san diego，ca)；origene technologies，inc.(rockville，md)vraybiotech life(peachtree corners，ga)；sigmaaldrich(st.louis，mo)；thermo fisher scientific(waltham，ma)；us biological life sciences(salem，ma)；以及许多其它公司。
[0102]
在一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗ca125单克隆抗体或其片段。抗ca125单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗ca125单克隆抗体可以得自agilent technologies(santa clara，ca)；anogen(mississauga，on)；biocare medical(pacheco，ca)；biorbyt ltd.(st.louis，mo)；creative diagnostics(shirley，ny)；enzo life sciences，inc.(farmingdale，ny)；hytest ltd.(turku，芬兰)；mybiosource，inc.(sandiego，ca)；progen(wayne，pa)；qed bioscience inc.(san diego，ca)；prosci，inc.(poway，ca)；raybiotech life(peachtree corners，ga)；usbiological life sciences(salem，ma)；以及许多其它公司。
[0103]
在另一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗ca-15-3单克隆抗体或其片段。抗ca-15-3单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如
(但不限于)，可以按照本公开利用的抗ca-15-3单克隆抗体可以得自abeomics(san diego，ca)；biorbyt ltd.(st.louis，mo)；cell sciences(newburyport，ma)；creative diagnostics(shirley，ny)；lifespan biosciences(seattle，wa)；mybiosource，inc.(san diego，ca)；novus biologicals(centennial，co)；origene technologies，inc.(rockville，md)；us biological life sciences(salem，ma)；以及许多其它公司。
[0104]
在另一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗前列腺特异性抗原(抗psa)单克隆抗体或其片段。抗psa单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗psa单克隆抗体可以得自abeomics(san diego，ca)；anogen(mississauga，on)；biorbyt ltd.(st.louis，mo)；bioss inc.(boston，ma)；g-biosciences(st.louis，mo)；huabio(boston，ma)；mybiosource，inc.(san diego，ca)；nsj bioreagents(san diego，ca)；origene technologies，inc.(rockville，md)；raybiotech life(peachtree corners，ga)；us biological lifesciences(salem，ma)；以及许多其它公司。
[0105]
在另一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗癌胚抗原(抗cea)单克隆抗体或其片段。抗cea单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗cea单克隆抗体可以得自abcain(cambridge，uk)；abeomics(san diego，ca)；biorbyt ltd.(st.louis，mo)；biovision inc.(milpitas，ca)；g-biosciences(st.louis，mo)；huabio(boston，ma)；lifespan biosciences(seattle，wa)；mybiosource，inc.(san diego，ca)；nsj bioreagents(san diego，ca)；raybiotech life(peachtree corners，ga)；thermo fisher scientific(waltham，ma)；以及许多其它公司。
[0106]
在另一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗人绒毛膜促性腺激素(抗hcg)单克隆抗体或其片段。抗hcg单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗hcg单克隆抗体可以得自anogen(mississauga，on)；biorbyt ltd.(st.louis，mo)；bioss inc.(boston，ma)；biovision inc.(milpitas，ca)；creative diagnostics(shirley，ny)；eastcoast bio(north berwick，me)；mybiosource，inc.(san diego，ca)；origene technologies，inc.(rockville，md)；raybiotech life(peachtree corners，ga)；us biological life sciences(salem，ma)；以及许多其它公司。
[0107]
在另一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗肌钙蛋白(抗tni)单克隆抗体或其片段。抗tni单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗tni单克隆抗体可以得自bio-rad(hercules，ca)；biorbyt ltd.(st.louis，mo)；bioss inc.(boston，ma)；lifespan biosciences(seattle，wa)；mybiosource，inc.(san diego，ca)；novus biologicals(centennial，co)；qed bioscience inc.(san diego，ca)；raybiotech life(peachtree corners，ga)；santa cruz biotechnology，inc.(dallas，tx)；thermo fisher scientific(waltham，ma)；以及许多其它公司。
[0108]
在另一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗b型利钠肽(抗bnp)单克隆抗体或其片段。抗bnp单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得
的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗bnp单克隆抗体可以得自abcam(cambridge，uk)；bio-rad(hercules，ca)；biorbyt ltd.(st.louis，mo)；bioss inc.(boston，ma)；hytest ltd.(turku，芬兰)；lifespan biosciences(seattle，wa)；mybiosource，inc.(san diego，ca)；novus biologicals(centennial，co)；thermo fisher scientific(waltham，ma)；us biological life sciences(salem，ma)；以及许多其它公司。
[0109]
在另一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗probnp单克隆抗体或其片段。抗probnp单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗probnp单克隆抗体可以得自biorbyt ltd.(st.louis，mo)；us biological life sciences(salem，ma)；以及许多其它公司。
[0110]
在另一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗肌酸酐激酶-mb(抗ck-mb)单克隆抗体或其片段。抗ck-mb单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗ck-mb单克隆抗体可以得自abcam(cambridge，uk)；bio-rad(hercules，ca)；biorbyt ltd.(st.louis，mo)；bioss inc.(boston，ma)；lifespan biosciences(seattle，wa)；mybiosource，inc.(san diego，ca)；novus biologicals(centennial，co)；raybiotech life(peachtree corners，ga)；santa cruz biotechnology，inc.(dallas，tx)；thermo fisher scientific(waltham，ma)；us biological life sciences(salem，ma)；以及许多其它公司。
[0111]
在另一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是抗乳酸脱氢酶(抗ldh)单克隆抗体或其片段。抗ldh单克隆抗体是本领域众所周知并且广泛商购可得的；例如(但不限于)，可以按照本公开利用的抗ldh单克隆抗体可以得自abcam(cambridge，uk)；lifespanbiosciences(seattle，wa)；millipore sigma(st.louis，mo)；mybiosource，inc.(san diego，ca)；origene technologies，inc.(rockville，md)；santacruz biotechnology，inc.(dallas，tx)；thermo fisher scientific(waltham，ma)；us biological life sciences(salem，ma)；以及许多其它公司。
[0112]
在其它特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是非抗体蛋白质或肽。非抗体分析物结合剂是本领域众所周知的且已进行广泛研究，并且因此其进一步的描述被视为不必要的。可以按照本公开利用的其特定非限制性实例包括叶酸结合蛋白(fbp)、fk-506结合蛋白(fkbp)、vb12内在因子等等、以及其任何片段。
[0113]
当分析物特异性结合剂具有至少两个、至少三个或至少四个二硫键(或更多个)时，每个二硫键能够被还原为两个巯基用于附接到标记物，则缀合物可以包括关于结合剂中存在的每个二硫键的标记物。例如(但不限于)，缀合物可以包括直接或间接地附接到分析物特异性结合剂的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或更多种标记物。在一个特定的(但非限制性的)实例中，抗体具有在其铰链区中的四个链间二硫键，并且因此一种、两种、三种或四种标记物可以与每个单克隆抗体结合。当缀合物中存在两种或更多种标记物时，标记物可以是相同和/或不同的。
[0114]
本公开的某些非限制性实施方案涉及免疫测定试剂盒，其含有本文公开或另外考虑的任何标记物和/或缀合物中的一种或多种。标记物和/或缀合物的选择将取决于待利用的特定测定形式，并且此类选择完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0115]
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，免疫测定试剂盒包括第一试剂，其包
含本文上文描述的或本文另外考虑的任何缀合物(并且含有具有与之附接的至少一种标记物的第一分析物特异性结合剂)；以及包含固相的第二试剂，所述固相具有与之直接或间接地附接的第二分析物特异性结合剂(其中所述第二分析物特异性结合剂可以是本文公开或另外考虑的任何分析物特异性结合剂)。第一试剂和第二试剂的第一分析物特异性结合剂和第二分析物特异性结合剂各自特异性结合待检测的靶分析物的表位。在一个特定的(但非限制性的)实施方案中，第一分析物特异性结合剂和第二分析物特异性结合剂所结合的靶分析物的表位基本上不重叠，使得第一分析物特异性结合剂和第二分析物特异性结合剂可以同时结合相同的靶分析物分子。
[0116]
任何单克隆抗体或其片段都可以用作第一试剂和第二试剂的第一分析物特异性结合剂和第二分析物特异性结合剂，只要两种抗体可以同时结合相同的靶分析物分子。
[0117]
在本公开的某些非限制性实施方案中，第一试剂和第二试剂的单克隆抗体或其片段各自是抗ca 19-9单克隆抗体或其片段。抗ca 19-9单克隆抗体/其片段是本领域已知并且商购可得的；参见例如(但不限于)来自fujirebio diagnostics inc.(malvern，pa)的抗ca 19-9mab(目录号：210-580；克隆1116ns19-9)，或本文上文公开的其它抗ca 19-9单克隆抗体/片段中的任一种。
[0118]
试剂盒中存在的测定试剂可以以允许其按照本公开发挥功能的任何形式提供。例如但不限于，每种试剂可以以液体形式提供，并且以散装和/或单一等分试样形式设置在试剂盒内。可替代地，在一个特定的(但非限制性的)实施方案中，一种或多种试剂可以以单一等分试样冻干试剂的形式设置在试剂盒中。干燥试剂在微流体装置中的使用在美国专利号9,244,085(samproni)中进行详细描述，所述美国专利的全部内容在此通过引用明确并入本文。
[0119]
除本文上文详细描述的测定试剂之外，试剂盒还可以进一步含有其它试剂，用于进行本文描述或另外考虑的任何特定测定。这些另外试剂的性质将取决于特定的测定形式，并且其鉴定完全在本领域普通技术人员的技能内；因此，其进一步描述被视为不必要的。另外，取决于组分/试剂的交叉反应性和稳定性，试剂盒中存在的组分/试剂可以各自在分开的容器/区室中，或者各种组分/试剂可以组合在一个或多个容器/区室中。另外，试剂盒可以包括组分/试剂设置于其中的微流体装置。
[0120]
试剂盒中的各种组分/试剂的相对量可以广泛变化，以提供组分/试剂的浓度，其基本上优化在测定方法期间需要发生的反应，并且进一步基本上优化测定的灵敏度。在适当的情况下，试剂盒中的一种或多种组分/试剂可以作为干粉例如冻干粉末提供，并且试剂盒可以进一步包括用于溶解干燥试剂的赋形剂；以这种方式，可以从这些组分获得具有适当浓度的试剂溶液，用于执行按照本公开的方法或测定。可以包括在试剂盒中的其它试剂的非限制性实例包括洗涤溶液、稀释溶液、赋形剂、干扰溶液、阳性对照、阴性对照、校准试剂、质量对照试剂等等。另外，试剂盒可以进一步包括解释如何使用该试剂盒的一组书面说明书。这种性质的试剂盒可以用于本文描述或另外考虑的任何方法中。
[0121]
本公开的某些非限制性实施方案涉及生产本文公开或另外考虑的任何缀合物的方法。该方法包括在这样的条件下，使具有至少一个二硫键的分析物特异性结合剂与本文描述或另外考虑的任何标记物中的至少一种一起温育，所述条件使分析物特异性结合剂的每个二硫键还原为两个巯基，并且将至少一种标记物直接或间接地缀合到分析物特异性结
合剂的两个巯基，且从而产生缀合物。
[0122]
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂选自单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、分析物结合蛋白或其片段、肽及其组合或衍生物。
[0123]
在一个特定的(但非限制性的)实施方案中，分析物特异性结合剂是单克隆抗体或其片段，并且至少一个二硫键在单克隆抗体或其片段的铰链区中。
[0124]
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，单克隆抗体或其片段是抗ca 19-9单克隆抗体或其片段。
[0125]
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，缀合物包括直接或间接地附接到分析物特异性结合剂的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或更多种标记物。
[0126]
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，通过该方法产生的缀合物进一步定义为具有式xii、xiii或xiv的结构。在一个特定的(但非限制性的)实施方案中，式xii、xiii或xiv各自中的“a”可以进一步定义为具有式iv、v或vi之一的结构。
[0127]
本公开的某些非限制性实施方案涉及利用本文公开或另外考虑的任何缀合物，来检测样品中的靶分析物的方法。在该方法中，样品同时或者全部或部分序贯地与本文公开或另外考虑的任何缀合物中的一种或多种组合，以形成混合物，并且使混合物在允许缀合物与样品中存在的靶分析物结合的条件下温育，从而形成复合物；然后，检测复合物。
[0128]
在该方法的特定(但非限制性)实施方案中，样品同时或者全部或部分序贯地与本文上文详细描述的免疫测定试剂盒的第一试剂和第二试剂(即，包含具有与之直接或间接地缀合的至少一种disfpd-ae的单克隆抗体或其片段的第一试剂、以及包含用单克隆抗体或其片段标记的固相的第二试剂)组合，以形成混合物。然后使混合物在允许第一试剂和第二试剂与样品中存在的任何靶分析物结合的条件下温育，从而形成复合物。即，第一试剂和第二试剂的分析物特异性结合剂各自特异性结合靶分析物的表位，并且表位基本上不重叠，使得两种分析物特异性结合剂可以结合相同的靶分析物分子。然后通过本领域已知的任何方法来检测第一试剂-靶分析物-第二试剂的复合物。
[0129]
需要关于生物标志物(例如但不限于癌症生物标志物，例如ca 19-9)的存在的测定的任何样品，都可以用作按照本公开的方法的样品。样品的非限制性实例包括生物样品，例如但不限于全血或其任何部分(即血浆或血清)、尿、唾液、痰、脑脊液(csf)、皮肤、肠液、腹腔内液、囊液、汗、间质液、细胞外液、泪、粘液、膀胱冲洗液、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液及其组合。特定的非限制性实例包括裂解的全血细胞和裂解的红血细胞。
[0130]
如上文提到的，该方法的各种组分以组合(同时或序贯地)提供。当该方法的各种组分序贯地添加时，组分的添加次序可以变化；本领域普通技术人员可以确定将不同组分加入测定中的特定所需次序。当然，最简单的添加次序是同时添加所有材料并确定由此产生的信号。可替代地，每个组分或组分组可以序贯地组合。在某些实施方案中，可以在一次或多次添加之后涉及温育步骤。
[0131]
在其下温育混合物的条件可以广泛变化，只要复合物在此类条件下形成。基于夹心测定形式的免疫测定被广泛执行，并且免疫测定条件是本领域众所周知的；因此，适当测定条件的选择完全在本领域普通技术人员的能力范围内，并且因此其进一步描述被视为不必要的。
[0132]
所利用的特定检测方法可以广泛变化，只要复合物可以在此类方法下被检测到。
以夹心测定形式形成的复合物的检测被广泛执行，并且检测程序是本领域众所周知的；因此，适当检测方法的选择完全在本领域普通技术人员的能力范围内，并且因此其进一步描述被视为不必要的。
[0133]
该方法可以进一步包括一个或多个另外的步骤，以增加测定的准确度和/或精确度。例如(但不限于)，该方法可以进一步包括一个或多个洗涤步骤，用于在复合物形成的检测之前从反应中去除未结合的(或非特异性结合的)试剂。
[0134]
本公开的某些另外的非限制性实施方案涉及微流体装置，其包括本文上文描述的免疫测定试剂盒的任何组分。特别地，某些非限制性实施方案包括用于检测样品中的ca 19-9抗原的微流体装置。微流体装置包括(i)通过其施加样品的入口通道；以及(ii)能够与入口通道流体连通的至少第一区室。(ii)的区室含有本文上文详细描述的免疫测定试剂盒的第一试剂和第二试剂。
[0135]
在某些非限制性实施方案中，(ii)的第一试剂和第二试剂(以及任何另外的元件，如本文上文所述的)存在于同一区室中。在替代的非限制性实施方案中，第一试剂和第二试剂(以及任何另外的元件，如本文上文所述的)在两个或更多个区室之间拆分。
[0136]
该装置可以具有允许该装置按照本公开发挥功能的区室的任何布置和各种组分在其间的分布。
[0137]
微流体装置的任何区室都可以进行密封，以将设置于其中的试剂维持在基本上气密的环境中直到其使用；例如，含有冻干试剂的区室可以进行密封，以防止试剂的任何无意重构。入口通道和一个区室以及两个区室可以被描述为彼此“能够流体连通”；该短语指示每个区室可能仍是密封的，但这两个区室在其中或其间形成的密封刺穿后能够具有在其间的流体流动。
[0138]
本公开的微流体装置可以具有本领域已知或本文另外考虑的任何其它所需的特征。例如但不限于，本公开的微流体装置可以进一步包括读取室；读取室可以是含有本文上文所述试剂中的一种或多种的任何区室，或者读取室可以与含有一种或多种试剂的所述区室流体连通。微流体装置可以进一步包括一个或多个另外的区室，其含有其它溶液，例如(但不限于)洗涤溶液、稀释溶液、赋形剂、干扰溶液、阳性对照、阴性对照、质量对照等等。这些另外的区室可以与一个或多个其它区室流体连通。例如，微流体装置可以进一步包括含有洗涤溶液的一个或多个区室，并且这些区室可能能够与装置的任何其它区室流体连通。在另一个实例中，微流体装置可以进一步包括含有用于溶解一种或多种干燥试剂的赋形剂的一个或多个区室，并且该区室可能能够与装置的任何其它区室流体连通。在又一个进一步的实例中，微流体装置可以包括含有稀释溶液的一个或多个区室，并且该区室可能能够与装置的任何其它区室流体连通。
[0139]
实施例
[0140]
下文提供了实施例。然而，应理解本公开在其应用方面并不限于本文公开的具体实验、结果和实验室程序。相反，实施例仅作为各个实施方案之一提供并且意欲为示例性的而非详尽的。
[0141]
背景：先前对于siemenscentaur分析仪开发了使用nhs化学，采用抗体-heg-dmae缀合物用于检测癌症标志物ca 19-9的免疫测定，但测定的灵敏度、准确度和环境温度效应(ate)需要改进。因此，本实施例涉及提供更稳固的测定性能的新测定试剂的
设计和生产。
[0142]
在该实施例中，合成了一系列缀合物，包括ca 19-9-mab-mcc-heg-dmae、ca 19-9-mab-teg-tspae、ca 19-9-mab-二硫哒嗪二酮(disfpd)-heg-dmae和ca 19-9-mab-disfpd-teg-tspae。所有ca 19-9-mab-ae都在siemenscentaur上使用夹心测定形式进行评估(图1)。
[0143]
在一个非限制性实施方案中，advia centaur ca 19-9测定是使用直接化学发光技术的两步夹心免疫测定，所述技术使用单一单克隆抗体1116-ns-19-9用于固相和发光试剂两者。抗体与固相中的顺磁性颗粒共价偶联，并且同一抗体克隆用发光试剂中的吖啶鎓酯进行标记。该系统将75μl样品分配到比色皿内，然后在4.75分钟后，添加350μl固相。使该混合物在37℃下温育8.25分钟，随后为使用洗涤1的洗涤步骤，以去除过量的未结合抗原。在第一次洗涤后，加入100μl试剂水以使颗粒重悬浮。然后使100μl发光试剂与固相结合的ca 19-9抗原反应，用于另外18分钟温育，在其中它再次用洗涤1进行洗涤。然后将各300μl的酸试剂和碱试剂加入比色皿中，以启动化学发光反应。在患者样品中存在的ca 19-9浓度与通过系统检测到的相对光单位(rlu)的量之间存在直接关系。
[0144]
一种特定的(但非限制性的)缀合物，ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae，证实了关于新测定要求的有希望的性能，并且被选为主要的(但非限制性的)候选缀合物用于新缀合物中的原型测定。本公开代表了新型二溴哒嗪二酮-吖啶鎓酯(dibrpd-ae)标记物在诊断用途中的首次应用。
[0145]
试剂设计和合成：本实施例中的ca 19-9免疫测定试剂包括一种固相(sp)和一种发光试剂(图1)。固相试剂含有用单克隆抗ca 19-9抗体共价标记的磁性颗粒。发光试剂含有ca 19-9-mab-ae缀合物。固体试剂和发光试剂两者均构成夹心测定。mab包被的固相的合成是众所周知且直截了当的过程，并且因此其进一步描述被视为不必要的。因此，本实施例集中于新的ca 19-9-mab-ae缀合物的合成及其在ca 19-9免疫测定中的性能。在当前商业化的centaur ca 19-9测定中，发光试剂是mab-heg-dmae，其使用胺-nhs化学进行制备。由于来自mab的胺基对抗体结合亲和力是非常敏感的，因此重现相同的ae缀合物用于良好的测定性能是非常具有挑战性的。因此，在本实施例中，使用巯基化学设计了新的mab-ae缀合物(图2)。一般的共识是，使用定位于mab的铰链区中的巯基用于缀合应该并不干扰mab结合位点，并且所得到的缀合物甚至可能具有更好的免疫测定性能。基于这种想法，如下制备缀合物。
[0146]
最初选择含有马来酰亚胺基团的化合物mcc-heg-dmae，以使用硫醇化学制备ca 19-9-mab缀合物用于早期研究(图5)。使用缓冲液(50mm硼酸盐、5mmedta，ph 8.0)，使ca 19-9mab(fujirebio diagnostics inc.，7.6mg/ml，12mg)与nap25柱进行缓冲液交换，然后使用amicon ultra离心式过滤器(millipore，ultracel-30k)将mab溶液浓缩至5mg/ml。将dl-二硫苏糖醇(dtt，99.0％，6.83mg)溶解于1.69ml缓冲液(50mm硼酸盐、5mm edta，ph 8.0)中，以制备4.0mg/ml溶液。将dtt溶液(0.0474ml)加入mab(5.768mg)溶液内，具有反应混合物中的dtt总浓度(1mm)。使反应混合物在21℃下温育1.5小时，然后通过nap25柱在缓冲液(0.1m磷酸盐、300mm nacl、5mm edta，ph 7.0)上进行纯化。将dmae-heg-mcc(在dmso中以2.5mm的77.9μl)加入ca 19-9抗体(2.922mg)中，其中试剂与抗体为10：1的摩尔比。反应小瓶用铝箔进行包裹，在21℃下摇动两个小时，然后用新鲜制备的缓冲溶液(0.1m nem，在
0.1m pbs edta ph7.0中的39μl)进行猝灭。使用缓冲液(20mm磷酸盐、150mmnacl，ph 8.0)，通过sephadex g-25柱纯化所得到的缀合物。
[0147]
早期数据指示了，ca 19-9-mab-heg-dmae缀合物产生良好的测定曲线。考虑到这种令人鼓舞的初始性能，还使用相同的化学制备了ca 19-9-mab-teg-tspae缀合物(图6)。使用缓冲液(50 mm硼酸盐、5mmedta，ph 8.0)，使ca 19-9mab(fujirebio diagnostics inc.，7.6mg/ml，12mg)与nap25柱进行缓冲液交换，然后使用amicon ultra离心式过滤器(millipore，ultracel-30k)将mab溶液浓缩至5mg/ml。将dl-二硫苏糖醇(dtt，6.83mg)溶解于1.69ml缓冲液(50mm硼酸盐、5mm edta，ph8.0)中，以制备4.0mg/ml溶液。将dtt溶液(0.0474ml)加入mab(5.768mg)溶液内，具有反应混合物中的dtt总浓度(1mm)。使反应混合物在21℃下温育1.5小时，然后通过nap25柱在缓冲液(0.1m磷酸盐、300mm nacl、5mm edta，ph 7.0)上进行纯化。将tspae-teg-baa(在dmso中以2.5mm的30.0μl)加入ca 19-9抗体(2.253mg)中，其中试剂与抗体为5：1的摩尔比。反应小瓶用铝箔进行包裹，在21℃下摇动两个小时，然后用新鲜制备的缓冲溶液(0.1m nem，在0.1m pbs edta ph 7.0中的16.8μl)进行猝灭。使用缓冲液(50mm磷酸盐、150mm nacl，ph6.0)，通过sephadex g-25柱纯化所得到的缀合物。
[0148]
然而，ca 19-9-mab-mcc-heg-dmae和ca 19-9-mab-teg-tspae缀合物两者均都具有不利的环境温度效应(ate)和/或测定性能中的精确度问题。
[0149]
最近以来，使用功能化的二溴哒嗪二酮的抗体-药物-缀合物(adc)已在药物研究中得到报道。建议通过经由新的巯基化学将还原的完整抗体缀合在一起，可以更好地保存这些adc的结合亲和力和长期稳定性，以用于治疗用途。然而，这种缀合技术仍未对于诊断行业中的用途进行探索。因此，发明人假设这种生物缀合技术可以应用于按照本公开的诊断测定试剂的制备中。因此，设计并合成了一系列新的dibrpd ae，例如(但不限于)dibrpd-heg-dmae、dibrpd-teg-t spae、dibrpd-dmae、dibrpd-zae和dibrpd-iso-zae (图3和7-8)。通过使用接头dibrpd-heg-dmae和dibrpd-teg-tspae，制备了两种新的重桥接缀合物，ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae和ca 19-9-mab-disfpd-teg-tspae，用于新的ca 19-9免疫测定。
[0150]
用于生产dibrpd-dmae的程序(图7)：将dibrpd(bd104613833-4)(16.2mg，45.5μmol)溶解于乙腈(0.5ml)中。添加edc.ch3i(27.0mg，91.0μmol)和nhs(7.0mg，60.7μmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后冷却至0℃。在0℃下，将反应混合物缓慢加入在乙腈(1.0ml)和ph7.2缓冲液(1.0ml)中的dmae-ed(13.0mg，30.3μmol)溶液中，并且允许反应在0℃下温育1小时。然后，将反应温度逐渐升至室温。通过分析型hplc监测反应。粗反应混合物经由制备型hplc (phenomenex，luna c18(2)，250x30mm，5mm，260nm，20ml/分钟，20-60％/40分钟，60-100％/5分钟，100％b/15分钟；a：水+0.05％tfa；b：乙腈+0.05％tfa)进行纯化。收集所需的产物级分，在等于或低于-70℃的温度下冷冻，并冻干。获得纯度为91％的所需产物dibrpd-dmae(5.1mg黄色粉末，16％产率)。mh+：764.31、766.42。分析型hplc：6.4分钟。phenomenex，kinetex c18，50x4.6mm，2.6um，100a，10-50％/10分钟，1ml/分钟，260nm.；a：水+0.05％dfa；b：乙腈+0.05％dfa。
[0151]
用于生产dibrpd-teg-tspae的程序(图7)：将dibrpd(bd104613833-4)(7.1mg，20.0μmol)溶解于乙腈(1ml)中。添加dcc(6.2mg，30.0μmol)和nhs(2.3mg，20.0μmol)。将反
应混合物在室温下搅拌30分钟。将反应混合物缓慢加入在ph 7.2缓冲液(2ml)中的tspae-teg-nh2(18.0mg，20.0μmol)溶液中，并且允许反应在室温下温育1小时。通过分析型hplc监测反应。过滤白色沉淀物。粗滤液经由制备型hplc(phenomenex，luna c18(2)，250x30mm，5mm，20ml/分钟，260nm，10-40％/40分钟，40-100％/5分钟；a：水+0.05％tfa；b：乙腈+0.05％tfa)进行纯化。收集所需的产物级分，在等于或低于-70℃的温度下冷冻，并冻干。获得纯度为100％的所需产物dibrpd-tspae(19.5mg橙色粉末，79％产率)。mh+：1236.45；1238.62；1240.01。分析型hplc：4.0分钟。phenomenex，kinetex c18，50x4.6mm，2.6um，100a，10-50％/10分钟，1ml/分钟，260nm.；a：水+0.1％dfa；b：乙腈+0.1％dfa。
[0152]
用于生产dibrpd-heg-dmae的程序(图7)：将dibrpd(bd104613833-4)(7.5mg，21.2μnol)溶解于乙腈(1ml)中。添加dcc(6.6mg，31.8μmol)和nhs(2.4mg，21.2μmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物缓慢加入在dmf(0.5ml)和ph 7.2缓冲液(0.5ml)中的nsp-dmae-heg-nh2(16.0mg，21.2μmol)溶液中，并且允许反应在室温下温育2小时。通过分析型hplc监测反应。过滤白色沉淀物。粗滤液经由制备型hplc(phenomenex，luna c18(2)，250x30mm，5mm，20ml/分钟，260nm，10-40％/40分钟，40-100％/5分钟；a：水+0.05％tfa；b：乙腈+0.05％tfa)进行纯化。收集所需的产物级分，在等于或低于-70℃的温度下冷冻，并冻干。获得纯度为100％的所需产物dibrpd-hegae(11.2mg黄色粉末，48％产率)。mh+：1092.31；1094.34。分析型hplc：6.2分钟。phenomenex，kinetex c18，50x4.6mm，2.6um，100a，10-50％/10分钟，1ml/分钟，260nm.；a：水+0.1％dfa；b：乙腈+0.1％dfa。
[0153]
用于生产dibrpd-isozae的程序(图8)：将dibrpd(bd104613833-4)(10.3mg，29.0μmol)溶解于乙腈(1.0ml)中。添加dcc(10.9mg，52.7μmol)和nhs(6.1mg，52.7μmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物缓慢加入在dmf(0.5ml)和ph 7.2缓冲液(0.5ml)中的isozae-nh2(21.1mg，26.3μmol)溶液中，并且允许反应在室温下温育2小时。通过分析型hplc监测反应。过滤白色沉淀物。粗滤液经由制备型hplc(phenomenex，luna c18(2)，250x30mm，5mm，20ml/分钟，260nm，10-40％/40分钟，40-100％/5分钟；a：水+0.05％tfa；b：乙腈+0.05％tfa)进行纯化。收集所需的产物级分，在等于或低于-70℃的温度下冷冻，并冻干。获得纯度为100％的所需产物dibrpd-isozae(12.0mg橙色粉末，40％产率)。mh+：1137.31；1139.09；mna+：1161.47。lc/ms：5.6分钟。phenomenex，kinetex c18，50x4.6mm，2.6um，100a，10-50％/10分钟，1ml/分钟，260nm.；a：水+0.05％dfa；b：乙腈+0.05％dfa。
[0154]
用于生产dibrpd-zae的程序(图8)：将dibrpd(bd104613833-4)(5.5mg，15.3μmol)溶解于乙腈(0.5ml)中。添加edc.ch3i(6.8mg，23.0μmol)和nhs(2.2mg，19.2μmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后冷却至0℃。在0℃下，将反应混合物缓慢加入在乙腈(1.0ml)和ph 7.2缓冲液(1.0ml)中的zae-nh2(9.5mg，12.8μmol)溶液中，并且允许反应在0℃下温育1小时。通过分析型hplc监测反应。粗反应混合物经由制备型hplc(phenomenex，luna c18(2)，250x30mm，5mm，260nm，20ml/分钟，10-40％/40分钟，40-100％/5分钟，100％b/15分钟；a：水+0.05％tfa；b：乙腈+0.05％tfa)进行纯化。收集所需的产物级分，在等于或低于-70℃的温度下冷冻，并冻干。获得纯度为96％的所需产物dibrpd-zae(9.3mg黄色粉末，67％产率)。mh+：1079.45、1081.20。分析型hplc：4.5分钟。phenomenex，kinetex c18，50x4.6mm，2.6um，100a，10-50％/10分钟，1ml/分钟，260nm.；a：水+0.05％dfa；b：乙腈+0.05％dfa。
[0155]
ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae如下进行制备(图9)：使用缓冲液(50mm硼酸盐、0.15m nacl、5mm edta，ph 8.0)，使ca 19-9mab(fujirebio diagnostics inc.，9mg，7.6mg/ml，1.184ml)与nap25柱进行缓冲液交换。在tcep的存在下，以10：1的tcep：ab摩尔比，使抗体与dibrpd-heg-dmae以10∶1的试剂与抗体的摩尔比进行缀合。向ab (1.0mg，4.0ml)中逐滴加入dibrpd-heg-dmae(以2.5mm的26.7μl)，使混合物在4-8℃下摇动2小时，然后加入tcep(3.82μl，5mg/ml)。使反应混合物在4-8℃下摇动16小时，并且使用缓冲液(20 mm磷酸盐、0.15m nacl，ph 8.0)，通过g25柱进行纯化。
[0156]
ca 19-9-mab-disfpd-teg-tspae如下进行制备(图10)：使用缓冲液(50mm硼酸盐、0.15m nacl、5mm edta，ph 8.0)，使ca 19-9mab(fujirebio diagnostics inc.，3mg，7.6mg/ml，0.40ml)与nap10柱进行缓冲液交换。在tcep的存在下，以10：1的tcep：ab摩尔比，使抗体与tspae-teg-dibrpd以10：1的试剂与抗体的摩尔比进行缀合。向ab (3.0mg，6.0ml)中逐滴加入tspae-teg-dibrpd(以2.5mm的80μl)，使混合物在4-8℃下摇动2小时，然后加入tcep。使反应混合物在4-8℃下摇动16小时，并且使用缓冲液(50mm mes、0.15m nacl，ph6.0)，通过g25柱进行纯化。
[0157]
ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae和ca 19-9-mab-disfpd-teg-tspae的生物缀合过程在图9-10中进行展示。图11显示了所有四种缀合物的sds page-考马斯凝胶。另外，所有缀合物的性能将在下文的测定节段中进行讨论。
[0158]
siemenscentaur ca 19-9免疫测定性能：使用可从siemenshealthcare diagnostics inc.(tarrytown，ny)获得的centaurxp自动化免疫测定分析仪，来进行ca 19-9-mab-ae缀合物的评估。使用原型ca 19-9免疫测定来确定四种不同缀合物的结合曲线和精确度，所述原型ca 19-9免疫测定采用两步形式(参见图1)，在很大程度上类似于当前商业化的centaur ca 19-9测定。在以ph 7.6的dipso(3-(n，n-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸)缓冲液中用ca 19-9抗体(克隆1116ns19-9)包被的顺磁性颗粒充当固相，并且在步骤1中与样品进行反应，随后为磁分离和洗涤。在步骤2中，将缀合物以0.4μg/ml的浓度加入以ph 7.6的dipso缓冲液中，随后为温育、磁分离和化学发光信号的定量测量。
[0159]
关于图12，通过运行一系列标准品，对于ca19-9-mab-x-heg-dmae缀合物生成了结合曲线和信号比数据。标准品由掺有ca19-9抗原的正常人血清的基质进行制备。mcc-heg-dmae和disfpd-heg-dmae缀合物使用相同的缓冲液组分和固相本体进行制备并稀释至0.4μg/ml的相同浓度。固相和发光试剂缓冲液两者均由dipso、edta四钠盐、硫酸庆大霉素、两性霉素b、正常小鼠血清、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、叠氮化钠和ecosurfeh-9进行制备。发光试剂缓冲液还具有胆酸钠。使用商业ca19-9试剂来测试nhs-heg-dmae缀合物。每个标准品在advia centaurxp仪器上以6个重复运行，并且通过对于每个绘制信号相对于平均浓度来生成曲线。
[0160]
关于表1，通过运行一系列标准品，对于ca19-9-mab-x-heg-dmae缀合物生成了结合曲线和信号比数据。制备mcc-heg-dmae和disfpd-heg-dmae缀合物，并使用相同的缓冲液组分和固相本体稀释至相同浓度。使用商业ca19-9试剂来测试nhs-heg-dmae缀合物。每个标准品在advia centaur xp仪器上以6个重复运行，并且通过对于每个，绘制信号相对于平
均浓度来生成曲线。通过获取最低信号，并且将其除以第二低的信号(标准品2/标准品1)或最高信号(标准品9/标准品1)，来确定信号比。
[0161]
关于ca 19-9-mab-nhs-heg-dmae、ca 19-9-mab-mcc-heg-dmae和ca 19-9-mab-二硫哒嗪二酮(disfpd)-heg-dmae的曲线形状是相似的，伴随绝对信号中的适度差异。信号比对于disfpd连接的缀合物是最高的(图12和表1)。
[0162]
关于表2，关于ca19-9-mab-x-heg-dmae缀合物的批内精确度使用与表1所述相同的试剂进行确定。样品包括跨越测定范围的质量对照材料和血清库实验对象组。使用每种试剂以6个重复运行样品，并且对于每个，确定批内百分比变异系数(％cv)。计算关于每种试剂的平均％cv值，以确定跨越所有样品的平均精确度。
[0163]
精确度对于ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae是最好的，随后为ca 19-9-mab-nhs-heg-dmae和ca 19-9-mab-mcc-heg-dmae(表2)。
[0164]
关于表3，使用与上述相同的试剂，比较了关于nhs-heg-dmae和disfpd-hegg-dmae的环境温度效应。完成测试以确定跨越仪器的工作温度(18℃至30℃)的效应。在每个温度点完成两次测试运行，每个测试运行在分开的2天进行重复。这导致在6个测试日内完成的总共12次运行：3个温度x2次运行/温度(每天)x2个测试日。在每次运行期间，所有样品以最少3个重复进行处理。来自这些运行的数据求平均值，并且在每个温度下产生校准曲线。这些曲线然后用于计算来自其它温度运行的结果。根据这些数据，百分比偏差被计算为高温结果和低温结果之间的差异。平均百分比偏差被确定为关于每个样品跨越所有温度组合的百分比偏差。
[0165]
关于表4，其标准曲线用八个水平的标准品生成，每个水平以3个重复进行处理。发光试剂由0.2μg/ml ca19-9-mab-teg-tspae或0.2μg/ml ca19-9-mab-disfpd-heg-dmae组成。固相试剂由与单克隆抗ca 19-9抗体(克隆1116-ns-19-9)共价偶联的顺磁珠组成。使用advjacentaur系列免疫测定分析仪来执行测试。计算变异系数(％cv)以给出每种缀合物的批内精确度，并且确定关于所有样品的中值％cv值。
[0166]
关于表5，使用advia centaur系列免疫测定分析仪来执行hegae-disfpd和tspae-disfpd发光试剂的环境温度评估。发光试剂由0.2μg/ml ca19-9-mab-disfpd-heg-dmae或0.1μg/ml ca19-9-mab-disfpd-teg-tspae组成。固相试剂由与单克隆抗ca 19-9抗体(克隆1116-ns-19-9)共价偶联的顺磁珠组成。测试在温度室中在2天的过程中在18℃和30℃下完成。使用八个水平的标准品生成标准曲线，每个水平以3个重复进行处理。对于各4个重复的一系列血清库和qc样品进行信号(以rlu计)测量，并且对于每个，使用标准曲线确定分析物。百分比偏差计算为：((在18℃下的ca19-9(u/ml)-(在30℃下的ca19-9(u/ml))/(平均ca19-9(u/ml))。显示了总体平均、最小和最大个体偏差。
[0167]
在分开的研究中，比较了ca 19-9-mab-disfpd-teg-tspae缀合物与ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae的标准曲线、信号比和精确度。disfpd-teg-tspae单克隆抗体缀合物给出比disfpd-heg-dmae单克隆抗体缀合物高得多的信号，尽管其信号/背景比略微更低。在本研究的限度内，关于两者的批内精确度是可比较的(表4)。
[0168]
在温度控制室中在同一分析仪上测量环境温度效应。在24℃环境温度下生成校准曲线，并且在18℃和30℃环境温度下测量血清库和qc。使用24℃曲线将这些信号转换为浓度，并且比较所获得的浓度。
[0169]
对于ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae和ca 19-9-mab-nhs-heg-dmae缀合物比较了环境温度效应。ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae显示了明显优于现有技术缀合物的性能(表3)。
[0170]
在分开的实验中，比较了关于ca 19-9-mab-disfpd-teg-tspae缀合物与ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae缀合物的环境温度效应。关于两者的温度效应是可比较的，尽管个体血清库之间的效应范围对于disfpd-heg-dmae缀合物更窄(表5)。
[0171]
表1：关于ca 19-9-mab-x-heg-dmae缀合物(x＝nhs、mcc和disfpd)的结合曲线和信号比
[0172][0173]
表2：关于ca 19-9-mab-x-heg-dmae缀合物(x＝nhs、mcc和disfpd)的批内精确度
[0174][0175]
表3：关于ca 19-9-mab-x-heg-dmae缀合物(x＝nhs和disfpd)的环境温度效应环境温度效应：基于在24℃下的校准，在18℃和30℃之间的％偏差
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表4：关于ca 19-9-mab-teg-tspae与ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae缀合物比较的标准曲线、信号比和批内精确度
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表5：关于ca 19-9-mab-disfpd-teg-tspae与ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae缀合物比较的环境温度效应
[0180][0181]
结论：成功地设计并合成了一系列新的dibrpd-ae，例如(但不限于)dibrpd-heg-dmae、dibrpd-teg-tspae、dibrpd-dmae、dibrpd-zae和dibrpd-iso-zae(图3)。通过使用这些新型dibrpd-ae标记物，还合成了新的ca 19-9mab-ae缀合物(图2和4)，并且对于在新的原型ca 19-9免疫测定中的使用进行评估(表1-5；图12)。基于总体测定性能，测试的多种缀合物满足初步测定要求(表1-5)，其中(例如但不限于)ca 19-9-mab-disfpd-heg-dmae (图9)是用于开发商业ca 19-9免疫测定的极佳候选物。本实施例代表了新型dibrpd-ae标记物在诊断行业中的抗体缀合物制备中的首次应用。
[0182]
虽然本文所述的某些实施方案公开了抗ca 19-9抗体的用途，但应理解，该特定抗体和靶分析物的用途仅用于示例目的。相反，如本文所述的dibrpd-ae分子与抗体的结合在抗体的铰链区中发生，并且因此完全不依赖于存在的特定互补决定区。因此，本公开的缀合方法可以与任何抗体或其片段一起利用。同样地，抗体缀合物在本文所述的特定夹心免疫测定中的用途也仅用于示例的目的。本公开的缀合物可以与本领域已知或本文另外考虑的在其中利用抗体的任何免疫测定一起利用。
[0183]
因此，按照本公开，已提供了完全满足上文阐述的目标和优点的组合物、试剂盒和装置，以及其生产和使用方法。尽管本公开已与上文阐述的具体附图、实验、结果和语言结合进行描述，但明显的是许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。相应地，意图涵盖落入本公开的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。

技术特征：
1.一种标记物，其包含：经由间隔物(b)连接的二溴哒嗪二酮(dibrpd)和信号分子(a)，并具有式i的结构：其中：“a”包含选自发光标记物和酶促标记物的信号分子；“b”是选自烷基、烯基、炔基或芳烷基的间隔物，其中所述间隔物含有0至20个杂原子；和当n＝1时，“c”是包含1至40个碳原子和0至20个杂原子的基团。2.权利要求1的标记物，其中式i的“a”是具有式iv的结构的化学发光化合物：其中：“r1”选自：具有1至35个碳原子和0至20个杂原子的烷基、烯基、炔基或芳烷基；磺丙基或磺丁基；和基团-r
a-z，其中r
a
是选自具有1至35个碳原子和0至20个杂原子的烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基的二价基团；“r2”置于c1至c4的一个或多个位置处，并且每个“r2”独立地选自氢、烷基、or、oh、sr、sh、nh2和nr’r”，其中r、r’和r”各自独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基和芳烷基，其中每个基团含有0至20个杂原子；“r3”置于c5至c8的一个或多个位置处，并且每个“r3”独立地选自氢、烷基、or、oh、sr、sh、nh2和nr’r”，其中r、r’和r”各自独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基和芳烷基，其中每个
基团含有0至20个杂原子；“x”是氧或氛；当“x”是氧时，“z”被省略，且当“x”是氮时，“z”是so
2-y；“y”是选自卤化或未卤化的、支链或直链烷基；取代或未取代的芳基；和杂环基团的基团；其中“y”基团包含0至20个杂原子，并且其中“y”基团进一步包含连接到式i的间隔物“b”的官能团；和“a
‑”是选自ch3so
4-、fso
3-、cf3so
4-、c4f9so
4-、ch3c6h4so
3-、卤化物、cf3coo-、ch3coo-和no
3-的抗衡离子。3.权利要求2的标记物，其中式i的“a”是具有式v的结构的化学发光化合物：是具有式v的结构的化学发光化合物：其中：“r
4”和“r
8”各自独立地选自氢或烷基、烯基、炔基、烷氧基(-or)、烷硫基(-sr)或取代的氨基；“r
5”、“r
6”和“r
7”各自独立地选自氢或烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其中每个基团含有0至20个杂原子；和“r
5”、“r
6”和“r7”之一进一步包含与式i的间隔物“b”连接的官能团。4.权利要求2的标记物，其中式i的“a”是具有式vi的结构的化学发光二甲基苯基吖啶鎓酯：
其中：“r
1”是甲基或磺丙基；“r
2”和“r
3”各自独立地选自氢或甲氧基、磺丙氧基或聚(乙)二醇氧基；和“r6”是与式i的间隔物“b”连接的酰胺基(conh-)。5.权利要求2的标记物，其进一步定义为具有式vii的结构的二溴哒嗪二酮-二甲基苯基吖啶鎓酯(dibrpd-dmae)：6.权利要求2的标记物，其进一步定义为具有式viii的结构的二溴哒嗪二酮-六(乙)二醇-二甲基苯基吖啶鎓酯(dibrpd-hegae)：
7.权利要求2的标记物，其进一步定义为具有式ix的结构的二溴哒嗪二酮-两性离子吖啶鎓酯(dibrpd-zae)：8.权利要求2的标记物，其进一步定义为具有式x的结构的二溴哒嗪二酮-三乙二醇-三磺基丙基吖啶鎓酯(dibrpd-teg-tspae)：9.权利要求2的标记物，其进一步定义为具有式xi的结构的二溴哒嗪二酮-2-异丙基吖啶鎓酯(dibrpd-isozae)：10.一种缀合物，其包含：具有能够还原为两个巯基的至少一个二硫键的分析物特异性结合剂；和权利要求1-9中任一项的至少一种标记物，其直接或间接地附接到分析物特异性结合剂的两个巯基，从而形成缀合物；和其中所述缀合物具有式xii的结构：
其中“结合剂”表示分析物特异性结合剂，并且“a”、“b”和“c”如式i中所定义的。11.权利要求10的缀合物，其中所述分析物特异性结合剂选自单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、分析物结合蛋白或其片段、肽及其组合。12.权利要求11的缀合物，其中所述分析物特异性结合剂是单克隆抗体或其片段，并且其中至少一个二硫键在所述单克隆抗体或其片段的铰链区中。13.权利要求12的缀合物，其中所述单克隆抗体或其片段是抗ca 19-9单克隆抗体或其片段。14.权利要求11的缀合物，其中所述分析物特异性结合剂选自叶酸结合蛋白(fbp)、fk-506结合蛋白(fkbp)和vb12内在因子或其片段。15.权利要求10的缀合物，其进一步定义为包含直接或间接地附接到所述分析物特异性结合剂的至少两种标记物。16.一种免疫测定试剂盒，其包含：第一试剂，其包含权利要求10-15中任一项的缀合物；和包含固相的第二试剂，所述固相具有与之直接或间接地附接的第二分析物特异性结合剂，其中所述第二分析物特异性结合剂对于缀合物的分析物特异性结合剂所结合的分析物是特异性的；和其中所述第一试剂和第二试剂的分析物特异性结合剂各自特异性结合待通过免疫测定检测的靶分析物的表位，并且所述表位基本上不重叠，使得所述第一试剂和第二试剂的分析物特异性结合剂可以同时结合相同的靶分析物分子。17.一种生产缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：在如下的条件下，使具有至少一个二硫键的分析物特异性结合剂与权利要求1-9中任一项的至少一种标记物一起温育，所述条件使所述分析物特异性结合剂的至少一个二硫键还原为两个巯基，并且将至少一种标记物直接或间接地缀合到分析物特异性结合剂的两个巯基，且从而产生缀合物。18.权利要求17的方法，其中所述分析物特异性结合剂选自单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、分析物结合蛋白或其片段、肽及其组合或衍生物。19.权利要求18的方法，其中所述分析物特异性结合剂是单克隆抗体或其片段，并且其中所述至少一个二硫键在所述单克隆抗体或其片段的铰链区中。20.权利要求19的方法，其中所述单克隆抗体或其片段是抗ca 19-9单克隆抗体或其片段。
21.权利要求17的方法，其中所述分析物特异性结合剂选自叶酸结合蛋白(fbp)、fk-506结合蛋白(fkbp)和vb12内在因子或其片段。22.权利要求17的方法，其中通过所述方法产生的缀合物包含直接或间接地附接到所述分析物特异性结合剂的至少两种标记物。23.一种检测样品中的靶分析物的方法，其包括以下步骤：将样品与权利要求16的免疫测定试剂盒的第一试剂和第二试剂组合，以形成混合物；使所述混合物在允许第一试剂和第二试剂与样品中存在的靶分析物结合的条件下温育，从而形成复合物；和检测所述复合物。

技术总结
公开了包括附接到信号分子的二溴哒嗪二酮的标记物，连同其生产和使用方法。还公开了附接到分析物特异性结合剂的标记物的缀合物，以及其生产和使用方法。还公开了含有标记物和/或缀合物的试剂盒，连同含有其的微流体装置。置。置。


技术研发人员：杨雅利 D
受保护的技术使用者：美国西门子医学诊断股份有限公司
技术研发日：2021.11.10
技术公布日：2023/8/13