利用三重共培养的体外肝病模型及其制备方法与流程

culture)肝细胞(hepatocyte)和肝星状细胞(hepatic stellate cell)的同时，将库普弗细胞(kupffer cell)从所述肝细胞及肝星状细胞隔开来间接共培养(indirect co-culture)的步骤。
11.将所述肝细胞和肝星状细胞培养成能够相互接触，将所述库普弗细胞培养成不与所述肝细胞及肝星状细胞接触，其中，所述肝细胞、肝星状细胞及库普弗细胞可以共享相同的培养基。
12.所述肝细胞可以为hepg2细胞及huh-7细胞中的一种或多种。
13.所述肝星状细胞可以为lx-2细胞。
14.所述库普弗细胞可以为永生化(immortalized)库普弗细胞。
15.还可以包括诱导所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞发生脂肪变性(steatosis)、炎症(inflammation)或纤维化(fibrosis)的步骤。
16.诱导所述脂肪变性的步骤可以是对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞进行游离脂肪酸(ffa，free fatty acids)处理的步骤，诱导所述炎症的步骤可以是对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞进行游离脂肪酸及脂多糖(lps，lipopolysaccharide)处理的步骤，诱导所述纤维化的步骤可以是对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞进行游离脂肪酸及肿瘤生长因子β1(tgf-β1)处理的步骤。
17.还可以包括对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞处理选自由a1腺苷受体(a1ar)、a
2a
腺苷受体(a
2a
ar)、a
2b
腺苷受体(a
2b
ar)、a3腺苷受体(a3ar)、β-抑制蛋白(arrestin)、法尼酯x激活受体(fxr)及甲状腺激素受体-β(thr-β)组成的组中的一种或多种激动剂(agonist)、部分激动剂(partial agonist)、拮抗剂(antagonist)或部分拮抗剂(partial antagonist)的步骤。
18.还可以包括对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞测量选自由脂肪变性、炎症及纤维化组成的组中的一种或多种指标的步骤。
19.所述指标可以为选自由a3腺苷受体(a3ar)、法尼酯x激活受体(fxr)、甲状腺激素受体-β(thr-β)、c-c基序趋化因子配体2(ccl2)、赖氨酰氧化酶(lox)、ⅰ型胶原α1(col1a1)、ⅳ型胶原α1(col4a1)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-1β(il-1β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、平滑肌肌动蛋白α2(acta2)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(timp1)、金属蛋白酶组织抑制因子-2(timp2)、肿瘤生长因子β1(tgf-β1)、趋化因子(c-x-c基序)配体8(cxcl8)、脂质(lipid)、胶原蛋白(collagen)、活性氧(reactive oxygen species)、α平滑肌肌动蛋白(α-sma)及纤连蛋白(fibronectin)组成的组中的一种或多种。
20.开始培养并经过144小时后，所述肝细胞与肝星状细胞的细胞数量之比可以为2-7:1。
21.开始培养并经过144小时后，所述肝细胞和肝星状细胞之和与所述库普弗细胞的细胞数量之比可以为1:1-5。
22.所述肝病可以为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，nash)和/或非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，nafld)。
23.为了解决所述另一技术问题，根据本发明的一个实施例的利用三重共培养(triple co-culture)的体外(in vitro)肝病模型包括：第一培养器，收容有肝细胞(hepatocyte)和肝星状细胞(hepatic stellate cell)；以及第二培养器，与所述肝细胞及
肝星状细胞隔开配置，收容有库普弗细胞(kupffer cell)，其中，所述第二培养器的底面形成有尺寸比所述库普弗细胞小的多个孔隙(pore)，还包括通过所述多个孔隙同时填充所述第一培养器及第二培养器的培养基。
24.所述多个孔隙的平均尺寸可以为0.1μm-0.6μm。
25.所述培养基可以包括选自由胎牛血清(fbs，fetal bovine serum)、青霉素/链霉素(p/s，penicillin/streptomycin)、谷氨酰胺(glutamine)、葡萄糖(glucose)、丙酮酸钠(sodium pyruvate)、青霉素/链霉素(hyclone
tm
)、杜氏改良伊戈尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium)、embryomax
tm
2mm l-谷氨酰胺、embryomax
tm
胚胎干细胞专用胎牛血清及embryomax
tm
杜氏改良伊戈尔培养基高糖组成的组中的一种或多种。
26.其他实施例的具体事项包括在详细说明中。
27.根据本发明的实施例的利用三重共培养的体外肝病模型及其制备方法实现比单培养更相似的体内环境，从而可以进行快速且高度准确的分析，同时与普通的直接共培养相比，易于样本的采集及测量。
28.根据本发明实施例的效果不限于以上示例的内容，更多效果包括在本说明书中。
附图说明
29.图1为示出根据本发明的一个实施例的利用三重共培养(triple co-culture)的体外(in vitro)肝病模型制备方法的示意图。
30.图2为根据本发明的实验例的肝癌细胞系(human hepatocellular carcinoma cell line)和人肝星状细胞(human hepatic stellate cell line)的直接共培养(direct co-culture)示意图及各个检查点(checkpoint)的细胞图像。
31.图3为示出根据本发明的实验例的单培养(mono-culture)与三重共培养(triple co-culture)方法的差异的示意图。
32.图4为示出根据本发明的实验例的细胞培养、游离脂肪酸(free fatty acid，ffa)处理步骤及测量检查点的示意图。
33.图5至图7为根据本发明实验例对诱导肝脂肪变性(hepatic steatosis)的多个细胞测量a3腺苷受体、法尼酯x激活受体、甲状腺激素受体-β及脂质表达量的图表。
34.图8至图9为根据本发明实验例对诱导肝炎症(hepatic inflammation)的多个细胞测量c-c基序趋化因子配体2、il-1β、il-6、a3腺苷受体等的表达量的图表。
35.图10至图14为根据本发明实验例对诱导肝纤维化(hepatic fibrosis)的多个细胞测量c-c基序趋化因子配体2、il-1β、il-6、a3腺苷受体、胶原蛋白等的表达量的图表。
具体实施方式
36.本发明的优点和特征以及实现它们的方法可通过参照后述的实施例而得以明确。但是，本发明不限于以下公开的实施例，而是以互不相同的多种方式实现，提供本发明只是为了向本发明所属技术领域的普通技术人员完整地告知本发明的范围，本发明仅由权利要求的范畴定义。
37.本说明书中所使用的术语用于说明实施例，并不旨在限制本发明。在本说明书中，“和/或”包括所提及的项目中的每一个以及一个以上的所有组合。并且，单数型还包括复数
modified eagle’s medium)、embryomax
tm
2mm l-谷氨酰胺、embryomax
tm
胚胎干细胞专用胎牛血清及embryomax
tm
杜氏改良伊戈尔培养基高糖组成的组中的一种或多种。在示例性实施例中，在三重共培养步骤之前，在将每种细胞单独培养的步骤中，可以在含有胎牛血清的培养基中培养每种细胞，在三重共培养步骤中，可以使用包括选自由青霉素/链霉素(hyclone
tm
)、杜氏改良伊戈尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium)组成的组中的一种或多种的培养基。在此情况下，在三重共培养步骤之前，可以逐渐减少胎牛血清的浓度，使其达到1％。然而，本发明的实施例不限于此。
50.因此，肝细胞和肝星状细胞相互混合而可以进行直接相互作用的直接共培养，肝细胞及肝星状细胞与库普弗细胞之间可以进行通过细胞因子(cytokine)等分泌物质相互作用的间接共培养。
51.所述细胞因子等分泌物质可以通过所述多个孔隙移动。所述多个孔隙的平均尺寸可以为0.6μm以下，优选地，可以为0.1-0.6μm，更优选地，可以约为0.4μm，但不限于此，还可以形成为可将库普弗细胞与肝细胞及肝星状细胞物理隔开的同时使细胞因子等分泌物质通过的其他尺寸。
52.所述肝细胞可以为hepg2细胞及huh-7细胞(human hepatocellular carcinoma cell)中的一种或多种，所述肝星状细胞可以为lx-2细胞(human hepatic stellate cell)。
53.所述肝细胞、肝星状细胞及库普弗细胞可以各自独立地为人体或动物来源细胞(primary cell)或永生化细胞(immortalized cell)。
54.在一些实施例中，所述库普弗细胞可以为永生化库普弗细胞。
55.肝细胞与肝星状细胞的细胞数量之比可以为2-7:1，具体地可以为3-6:1，肝细胞和肝星状细胞之和与库普弗细胞的细胞数量之比可以为1:0.5-5，具体地可以为1:1-5。
56.所述肝细胞、肝星状细胞及库普弗细胞可以在35-39℃，优选地，在约37℃下培养，在2-8％二氧化碳，优选地，在约5％二氧化碳条件下培养。由于每种细胞的最佳培养条件均不同，因此将3种细胞一起培养需要非常苛刻的条件，若偏离所述条件，则至少一些细胞种类可能无法正常培养。
57.本发明的肝病模型可以制备成用于筛选对非酒精性脂肪性肝炎(nash)和/或非酒精性脂肪性肝病(nafld)等肝病具有预防或治疗功效的物质。尤其，本发明的利用三重共培养的肝病模型通过反应肝细胞、肝星状细胞与库普弗细胞之间的相互作用来更近似地实现体内环境。由此，当用游离脂肪酸(ffa)等处理来诱导非酒精性脂肪性肝炎(nash)和/或非酒精性脂肪性肝病(nafld)时，相关指标(marker)可以快速且准确地表达，可以表现出高反应性及更加浓度依赖性反应。同样地，当对诱导非酒精性脂肪性肝炎(nash)和/或非酒精性脂肪性肝病(nafld)的模型进行有效物质处理来缓解非酒精性脂肪性肝炎(nash)和/或非酒精性脂肪性肝病(nafld)时，相关指标也可以快速且准确地表达。因此，若使用本发明的模型，则可以进行可靠性高、时间缩短的分析。即，本发明包括利用三重共培养制成的体外肝病模型的分析方法。
58.非酒精性脂肪性肝炎(nash)和/或非酒精性脂肪性肝病(nafld)是炎症、纤维化及脂肪变性等症状起到复合作用的疾病，只有综合考虑所述症状的相关指标，才可以更准确地判断特定药物的疗效、药理机制等。本发明的肝病模型可以更加迅速且准确地表达炎症、
纤维化及脂肪变性相关指标，从而对于非酒精性脂肪性肝炎(nash)和/或非酒精性脂肪性肝病(nafld)的可靠性高且可以进行有效的分析。
59.在一个实施例中，与对照组相比，当在本发明的肝病模型中用游离脂肪酸(ffa)等进行处理而诱导脂肪变性、炎症等时，作为分析非酒精性脂肪性肝炎(nash)和/或非酒精性脂肪性肝病(nafld)的重要指标的a3腺苷受体(a3ar)、法尼酯x激活受体(fxr)、甲状腺激素受体-β(thr-β)、c-c基序趋化因子配体2(ccl2)、赖氨酰氧化酶(lox)、ⅰ型胶原α1(col1a1)、ⅳ型胶原α1(col4a1)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-1β(il-1β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、平滑肌肌动蛋白α2(acta2)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(timp1)、脂质(lipid)、胶原蛋白(collagen)等表达量和/或表达率可以得到提高。
60.并且，当对通过体内实验验证作用机制的特定药物(例如，a3腺苷受体(a3ar)配体)进行处理时，与对照组相比，相关指标的表达量和/或表达率的变化较大，并可显现出更加依赖于浓度的倾向。其优点为可以显现出比对照组更接近体内环境的结果。
61.在一些实施例中，与对照组相比，在本发明的肝病模型中，作为分析炎症的重要促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokine)的肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-1β(il-1β)等分泌量或分泌率可以得到提高。在具体的实施例中，所述炎症性指标可通过如下方法分析，测量通过dcfda细胞内活性氧检测分析的活性氧(ros，reactive oxygen species)的变化、测量通过实时荧光定量聚合酶链反应(qrt-pcr)的信使核糖核酸(mrna)变化以及测量通过酶联免疫吸附剂测定(elisa，enzyme-linked immunosorbent assay)的蛋白质变化等。
62.与此独立地，与对照组相比，在本发明的肝病模型中，作为分析纤维化的重要促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokine)的肿瘤生长因子β1(tgf-β1)、α平滑肌肌动蛋白(α-sma)、i型胶原(collagen type-i)、金属蛋白酶组织抑制因子-2(timp-2)、纤连蛋白(fibronectin)等分泌量或分泌率可以得到提高。在具体的实施例中，所述纤维化指标可通过如下方法分析，测量通过实时荧光定量聚合酶链反应(qrt-pcr)的信使核糖核酸(mrna)变化以及测量通过酶联免疫吸附测定(elisa)的蛋白质变化等。
63.并且，与对照组相比，因处理游离脂肪酸(ffa)而导致的脂肪堆积，细胞内脂质含量(intracellular lipid content)、细胞内胶原蛋白(intracellular collagen)及细胞内活性氧(intracellular ros)中的一种或多种的变化较大且迅速。在具体的实施例中，脂肪变性分析可通过油红o(oil red o)染色来进行。
64.在一些实施例中，所述指标的测量可以在处理游离脂肪酸(ffa)后的144小时进行。
65.本发明的肝病模型通过将库普弗细胞与肝细胞及肝星状细胞物理隔开的间接共培养方法来培养，由此，具有能够轻松采集并测量与脂肪变性(steatosis)、炎症(inflammation)、纤维化(fibrosis)等有关的样本的优点。
66.即，本发明的三重共培养可实现比单培养更相似的体内环境且快速进行分析，同时，与普通的直接共培养相比，样本的采集及测量更加简单。
67.以下，通过制备例和实验例详细说明本发明的多个实施例，本发明的效果并不局限于以下实验例。
68.实验例1：细胞培养及继代培养(cell culture and subculture)
69.实验例1-1：huh-7人肝细胞癌细胞株(huh-7human hepatocellular carcinoma cell line)的细胞培养及继代培养
70.《huh-7人肝细胞癌细胞株：细胞培养》
71.在实验中所使用的huh-7人肝细胞癌细胞株(日本癌症资源库细胞库，日本)使用了含1％青霉素/链霉素(hyclone
tm
)、10％胎牛血清(fbs，gibco)的杜氏改良伊戈尔培养基(dulbecco’s modified eagle’smedium)[+]4.5g/l葡萄糖、l-谷氨酰胺、丙酮酸钠(杜氏改良伊戈尔培养基，康宁)来在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中进行了培养。
[0072]
《huh-7人肝细胞癌细胞株：继代培养》
[0073]
从二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)取出细胞培养皿并将细胞培养基全部去除，且用1x磷酸盐缓冲液(hyclone
tm
)清洗了一次。全部去除磷酸盐缓冲液之后，放入1x胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液(hyclone
tm
)并在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中放置了3分钟。在锥形管(spl)中混合新的完全培养基和细胞并在1300rpm下进行了3分钟的离心分离。在全部去除上层液之后，放入新的完全培养基，通过轻敲(tapping)或移液(pipetting)来使细胞再悬浮(resuspension)，使用自动细胞计数器(logos biosystems)来测量了细胞活力和细胞数量。之后，在新的培养皿放入细胞和培养液来使每单位面积的细胞数量达到2.5
×
104个细胞/cm2并将其晃动之后，在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中进行了培养。将huh-7细胞株的继代培养限制在10代(passage)以内。
[0074]
实验例1-2：imkc永生化小鼠库普弗细胞株(imkc immortalized mouse kupffer cell line)的细胞培养方法及继代培养
[0075]
《imkc永生化小鼠库普弗细胞株：细胞培养》
[0076]
在试验中所使用的imkc永生化小鼠库普弗细胞株(西格玛奥德里奇)使用了含1％青霉素/链霉素(hyclone
tm
)、10％胎牛血清(fbs，gibco)的杜氏改良伊戈尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium)[+]4.5g/l葡萄糖、l-谷氨酰胺、丙酮酸钠(杜氏改良伊戈尔培养基，康宁)来在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中进行了培养。
[0077]
《imkc永生化小鼠库普弗细胞株：继代培养》
[0078]
从二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中取出细胞培养皿并将细胞培养基全部去除，且用1x磷酸盐缓冲液(hyclone
tm
)清洗了一次。全部去除磷酸盐缓冲液之后，放入1x胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液(hyclone
tm
)并在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中放置了3分钟。在锥形管(spl)混合新的完全培养基和细胞并在1300rpm下进行了3分钟的离心分离。在全部去除上层液之后，放入新的完全培养，通过轻敲(tapping)或移液(pipetting)来使细胞再悬浮(resuspension)，使用自动细胞计数器(logos biosystems)来测量了细胞活力和细胞数量。之后，在新的培养皿放入细胞和培养液来使细胞数量达到原来细胞数量的1/6～1/10并将其晃动之后，在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中进行了培养。将永生化小鼠库普弗细胞的继代培养限制在10代(passage)以内。
[0079]
实验例1-3：lx-2人源肝星状细胞株(lx-2human hepatic stellate cell line)
的细胞培养及继代培养
[0080]
《lx-2人源肝星状细胞株：细胞培养》
[0081]
在试验中所使用的lx-2人源肝星状细胞株(西格玛奥德里奇)使用含1％青霉素/链霉素(hyclone
tm
)、2％胎牛血清(fbs，gibco)的杜氏改良伊戈尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium)[+]4.5g/l葡萄糖、l-谷氨酰胺、丙酮酸钠(杜氏改良伊戈尔培养基，康宁)来在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中进行了培养。
[0082]
《lx-2人源肝星状细胞株：继代培养》
[0083]
从二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)取出细胞培养皿并将细胞培养基全部去除，且用1x磷酸盐缓冲液(hyclone
tm
)清洗了一次。全部去除磷酸盐缓冲液，放入细胞消化液(磷酸盐缓冲液(0.2g/l kcl、0.2g/l kh2po4、8g/l nacl及1.15g/l na2hpo4)含有0.5mm edta
·
4na和3mg/l酚红，西格玛奥德里奇)并在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中放置了3分钟，在锥形管(spl)混合新的完全培养基和细胞并在1300rpm下进行了3分钟的离心分离。在全部去除上层液之后，放入新的完全培养基，通过轻敲(tapping)或移液(pipetting)来使细胞再悬浮(resuspension)，使用自动细胞计数器(logos biosystems)来测量了细胞活力和细胞数量。之后，在新的培养皿放入细胞和培养液来使细胞数量达到原来细胞数量的1/3～1/6并将其晃动之后，在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中进行了培养。将lx-2细胞株的继代培养限制在10代(passage)以内。
[0084]
实验例2：细胞体外非酒精性脂肪性肝炎nash(cellular in vitronash)模型：三重共培养系统(triple co-culture system)
[0085]
实验例2-1：准备游离脂肪酸(free fatty acid；油酸/棕榈酸(oleic/palmitic acid))-结合牛血清白蛋白(bovine serum alubumin)原液
[0086]
《准备6mm油酸牛血清白蛋白-结合原液》
[0087]
将317.5μl的油酸(c18:1)(mw282.46，西格玛奥德里奇，3.15m)与10ml 0.1n naoh(西格玛奥德里奇)混合来准备之后，在70℃条件下在恒温槽中使其熔化来制备100mm油酸液。在55℃恒温槽中，在游离脂肪酸牛血清白蛋白(西格玛奥德里奇)溶液每次缓慢放入200μl的100mm油酸液并使其与牛血清白蛋白结合。利用1n naoh(西格玛奥德里奇)来将溶液的ph调节成7.4。按1ml的试样(aliquot)来其保存在冷藏箱(deep freezer)或超低温冰箱(ultra-low freezers)(tsx系列，赛默飞世尔科技)。
[0088]
《准备3.3mm棕榈酸牛血清白蛋白-结合原液》
[0089]
将128.2mg的棕榈酸(c16:0)(mw 256.42，西格玛奥德里奇)与10ml 0.1n naoh(西格玛奥德里奇)混合来准备之后，在70℃条件下在恒温槽中使其熔化来制备50mm棕榈酸液。在55℃恒温槽中，在10％游离脂肪酸牛血清白蛋白(西格玛奥德里奇)溶液每次缓慢放入200μl的50mm棕榈酸液体并使其与牛血清白蛋白结合。利用1n naoh(西格玛奥德里奇)来将溶液的ph调节成7.4。按1ml的试样(aliquot)来将其保存在冷藏箱(deep freezer)或超低温冰箱(ultra-low freezers)(tsx系列，赛默飞世尔科技)。
[0090]
实验例2-2：准备脂多糖(lipopolysaccharide)原液
[0091]
在脂多糖o111：b4(西格玛奥德里奇)放入蒸馏水来制备了1mg/ml原液。按少量的
试样(aliquot)来将其保存在冷藏箱(deep freezer)或超低温冰箱(ultra-low freezers)(tsx系列，赛默飞世尔科技)。
[0092]
实验例2-3：准备肿瘤生长因子β1(tumor growth factorβ1)原液
[0093]
在重组人肿瘤生长因子β1蛋白(r&d systems)放入含有0.1％的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，西格玛奥德里奇)的无菌4mm hcl溶液来制备了2μg/ml原液。按少量的试样(aliquot)来将其保存在冷藏箱(deep freezer)或超低温冰箱(ultra-low freezers)(tsx系列，赛默飞世尔科技)。
[0094]
实验例2-4：用于三重共培养的细胞培养适应
[0095]
在huh-7(人肝细胞癌细胞株)、imkc(永生化小鼠库普弗细胞株)及lx-2(人源肝星状细胞株)的各自的完全培养基中，以逐渐减少胎牛血清的浓度来使其最终达到1％的方式在37℃，5％二氧化碳条件下，使细胞在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中适应2周。
[0096]
实验例2-5：制备用于三重共培养的细胞悬浮液
[0097]
从二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)取出正在培养的huh-7(人肝细胞癌细胞株)、imkc(永生化小鼠库普弗细胞株)及lx-2(人源肝星状细胞株)，将细胞培养基全部去除，且用1x磷酸盐缓冲液(hyclone
tm
)清洗了一次。全部去除磷酸盐缓冲液之后，放入细胞消化液(西格玛奥德里奇)并在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中放置了3分钟。在锥形管(spl)混合作为共培养皿的含1％青霉素/链霉素(hyclone
tm
)、1％胎牛血清(fbs，gibco)的杜氏改良伊戈尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium)[+]4.5g/l葡萄糖、l-谷氨酰胺、丙酮酸钠(杜氏改良伊戈尔培养基，康宁)和各个细胞并在1300rpm下进行了3分钟的离心分离。从各个锥形管(spl)全部去除上层液之后，放入新的共培养皿，通过轻敲(tapping)或移液(pipetting)来使细胞再悬浮(resuspension)，使用自动细胞计数器(logos biosystems)来测量了每种细胞株的细胞活力和细胞数量。
[0098]
实验例2-6：用于直接/间接共培养(direct/indirect co-culture)的细胞接种
[0099]
《直接共培养(direct co-culture)：肝细胞：造血干细胞》
[0100]
考虑到144小时的细胞培养实验，在经过细胞接种144小时后，以使准备的huh-7(人肝细胞癌细胞株)和lx-2(人源肝星状细胞株)的细胞悬浮液以使最终细胞融汇达到80～90％的方式如以下表1接种了细胞数量。以使huh-7(人肝细胞癌细胞株)和lx-2(人源肝星状细胞株)的细胞数量达到5:1比例的方式分别将其放入新的锥形管(spl)并通过轻敲(tapping)或移液(pipetting)来良好地混合细胞之后接种在细胞培养皿，在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中，将细胞固定了1小时(图2)。
[0101]
【表1】
[0102][0103]
《三重共培养(triple co-culture)：直接共培养(direct co-culture)+间接共培养(indirect co-culture)(库普弗细胞)》
[0104]
为了进行直接共培养(direct co-culture)而将细胞固定1小时之后，为了对应细胞与imkc(永生化小鼠库普弗细胞株)的间接共培养(indirect co-culture)而将0.4μm孔
径细胞培养物插入物(康宁)放在直接共培养皿的上部。在所放置的细胞培养插入物(康宁)放入imkc(永生化小鼠库普弗细胞株)的细胞悬浮液来使其的每单位面积的细胞数量达到15000个细胞/cm2并在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养了24小时(图1)。
[0105]
《对照组：单培养(mono-culture)》
[0106]
考虑到144小时的细胞培养及实验，在经过细胞接种144小时之后，以使通过相对于三重共培养(triple co-culture)的单培养(mono-culture)对照组准备的huh-7(人肝细胞癌细胞株)、imkc(永生化小鼠库普弗细胞株)及lx-2(人源肝星状细胞株)的细胞悬浮液的最终细胞融汇达到80～90％的方式如表2不同地调节了细胞数量。在新的锥形管(spl)放入各个细胞悬浮液并通过轻敲(tapping)或移液(pipetting)来良好地混合细胞之后接种在细胞培养皿，在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养了24小时。
[0107]
【表2】
[0108][0109]
图3为示出单培养(mono-culture)与三重共培养(triple co-culture)方法的差异的示意图。
[0110]
实验例2-7：基于游离脂肪酸(ffa)处理的体外肝脂肪变性(hepatic steatosis)诱导
[0111]
《游离脂肪酸(油酸/棕榈酸)处理》
[0112]
在处理游离脂肪酸24小时之前，取出在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养了24小时的以下表3的各个实验组的细胞培养皿并小心去除细胞培养基，放入包含1000μm游离脂肪酸(油酸：棕榈酸摩尔比为2:1)的共培养皿。在处理游离脂肪酸之后，在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养了144小时。在处理游离脂肪酸后的48小时、96小时更换了包含游离脂肪酸的共培养皿(图4)。
[0113]
【表3】
[0114][0115]
实验例2-8：基于处理游离脂肪酸+脂多糖的体外肝炎症(hepatic inflammation)诱导
[0116]
在处理脂多糖之前的72小时、96小时，取出在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养的所述表3的各个实验组的细胞培养皿并小心去除细胞培养基，在1000μm游离脂肪酸(油酸：棕榈酸摩尔比2:1)放入包含0.5ng/ml脂多糖的培养基。在处理脂多糖之后，在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养了48小时、72小时。
[0117]
实验例2-9：基于游离脂肪酸+肿瘤生长因子β1处理的体外肝纤维化(hepatic fibrosis)诱导
[0118]
在处理肿瘤生长因子β1之前的72小时，取出在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养的所述表3的各个实验组的细胞培养皿并小心去除细胞培养基，在1000μm游离脂肪酸(油酸：棕榈酸摩尔比2:1)放入包含2ng/ml、4ng/ml的肿瘤生长因子β1的培养基。在处理肿瘤生长因子β1之后，在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养了72小时。
[0119]
实验例3：在三重共培养系统中的各种指标变化测量
[0120]
实验例3-1：油红o染色：吸收度测量：细胞内脂质含量测量
[0121]
《细胞计数试剂盒8测量：正常化》
[0122]
为了通过处理游离脂肪酸以及测量各个实验组中的细胞毒性的油红o染色的正常化，使用细胞计数试剂盒8(cck-8，dojindo分子技术)，使用多功能酶标仪(赛默飞世尔科技)来在450nm中测量四唑盐因细胞内的脱氢酶而还原并转换成甲瓒的量的吸收度，由此确认了细胞毒性。在处理游离脂肪酸之后，取出在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养144小时的所述表3的各个实验组的细胞培养皿，将细胞计数试剂盒8(cck-8，dojindo分子技术)溶液分别放入与细胞培养基的1/10对应的量。在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中反应了2小时。在处理2小时之后，取出各个实验组的细胞培养皿，将100μl培养基转移到96-孔板，使用多功能酶标仪(赛默飞世尔科技)来在450nm中测量了吸收度。
[0123]
《油红o染色》
[0124]
为了测量因处理游离脂肪酸而导致细胞内脂质含量的含量变化而使用油红o染色试剂盒(abcam)，使用包含在试剂盒中的油红o溶液来将细胞内脂质含量染色之后，使用多功能酶标仪(varioskan
tm
lux，赛默飞世尔科技)来测量了吸收度。在完成细胞计数试剂盒8测量之后，全部去除细胞培养基，并用1x磷酸盐缓冲液(hyclone
tm
)清洗了一次。在细胞中处理甲醛溶液(西格玛奥德里奇)1小时来使其固着之后，用蒸馏水清洗了两次，并在60％的异丙醇(西格玛奥德里奇)处理了5分钟。放入油红o溶液(abcam)，在定轨振荡器(daihan，韩国)中轻轻晃动并在室温条件下染色了1小时。利用蒸馏水来将染色的细胞清洗了3次以上，通过显微镜观察之后，为了测量细胞内脂质含量而利用60％的异丙醇(西格玛奥德里奇)来再次清洗2次以上之后，放入100％异丙醇(西格玛奥德里奇)并在定轨振荡器(daihan)中轻轻晃动，并将细胞内脂质染色的油红o洗脱30分钟。为了分析洗脱的油红o的量，使用多功能酶标仪(赛默飞世尔科技)来在500nm中测量了相对于作为空白的100％异丙醇(西格玛奥德里奇)的吸收度。
[0125]
实验例3-2：天狼猩红染色：细胞内胶原测量
[0126]
《细胞计数试剂盒8测量：正常化》
[0127]
为了通过处理游离脂肪酸以及测量各个实验组的细胞毒性的天狼猩红染色的正常化而使用细胞计数试剂盒8(cck-8，dojindo分子技术)，使用多功能酶标仪(赛默飞世尔科技)来在450nm中测量四唑盐因细胞内脱氢酶而还原并转换成甲瓒的量，由此确认了细胞毒性。在处理游离脂肪酸之后，取出在37℃，5％二氧化碳条件下，在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中培养144小时的所述表3的各个实验组的细胞培养皿，将细胞计数试剂盒8(cck-8，dojindo分子技术)溶液分别放入与细胞培养基的1/10对应的量。在二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)中反应了2小时。在进行2小时处理之后，取出各个实验组的细胞培养皿并将100μl培养基转移到96-孔板之后，使用多功能酶标仪(赛默飞世尔科技)来在450nm中测量了吸收度。
[0128]
《天狼猩红染色》
[0129]
为了测定因处理游离脂肪酸而导致的细胞内胶原的含量变化而使用天狼星红溶液(abcam)，使用多功能酶标仪(赛默飞世尔科技)来测量了通过天狼星红色染料染色的细胞内胶原的吸收度。在完成细胞计数试剂盒8测量之后，全部去除细胞培养基，通过1x磷酸盐缓冲液(hyclone
tm
)清洗了两次。在细胞中处理波恩氏液(medilab)1小时并使其固着之后，将其放入到流动的自来水并清洗20分钟并在空气中进行了干燥。在干燥的细胞放入天狼星红溶液(abcam)，在定轨振荡器(daihan)中轻轻晃动并在室温条件下染色了2小时。从细胞中去除天狼星红溶液(abcam)并用0.01n的盐酸(西格玛奥德里奇)进行清洗来去除未结合天狼星红色染料。放入0.1n氢氧化钠溶液(西格玛奥德里奇)并在定轨振荡器(daihan)中轻轻晃动并洗脱被细胞内胶原染色的天狼星红30分钟。为了分析所洗脱的天狼星红的量而使用多功能酶标仪(赛默飞世尔科技)来在550nm中测量了相对于作为空白的0.1n氢氧化钠溶液的吸收度。
[0130]
实验例3-3：荧光定量聚合酶链反应：炎症及纤维化相关分子的信使核糖核酸表达确认
[0131]
《总核糖核酸提取》
[0132]
在处理游离脂肪酸处理的实验组中，使用trizol
tm
试剂(英杰)来提取总核糖核酸。从二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)取出细胞培养皿并全部去除细胞培养基之后，放入trizol
tm
试剂(英杰)来进行了5分钟的反应。通过移液(pipetting)来使细胞再悬浮(resuspension)，并转移到1.5ml微型离心管(axygen)。在trizol
tm
试剂的混合物放入氯仿(西格玛奥德里奇)并进行搅拌之后，在室温条件下反应了5分钟。利用微型离心机(labogene)来对混合物进行离心分离(12000xg，15分钟，4℃)，将包含总核糖核酸的上层液转移到新的1.5ml微型离心管(axygen)之后，添加异丙醇(西格玛奥德里奇)并使离心管倒转2-3次并在室温条件下进行了10分钟的反应。利用微型离心机(labogene)来对包含混合物的离心管进行离心分离(12000xg，15分钟，4℃)并去除上层液，且确保了剩余总核糖核酸沉淀。在总核糖核酸沉淀放入75％乙醇(西格玛奥德里奇)并使离心管倒转2-3次来实现良好地混合。利用微型离心机(labogene)来对混合物进行离心分离(13000rpm，5分钟，4℃)并去除上层液，并在室温条件下干燥了剩余总核糖核酸沉淀。将完成干燥的总核糖核酸沉淀溶解在无核酸酶水(英杰)，使用nanodrop2000分光光度计(赛默飞世尔科技)来在260nm和280nm中测量了吸收度并测量了核糖核酸纯度(260/280比例)和浓度(ng/μl)。作为排除标准，在260/280比例为1.9以下的情况下，判断为核糖核酸纯度较低，从而排除了用在实验
中。
[0133]
《互补脱氧核糖核酸(complementary dna)合成》
[0134]
在完成提取的总核糖核酸中，使用amfirivert互补脱氧核糖核酸合成铂预混液(gendepot，美国)来合成了基于逆转录的互补脱氧核糖核酸(complementary dna)。在0.2ml聚合酶链式反应管(axygen，美国)放入2x rt预混液和enzyme mix之后，添加总核糖核酸样本，用无核酸酶水(英杰)调节体积并进行移液来混合样本。利用微型离心机(labogene)来对包含混合物的聚合酶链式反应管(axygen)降速并放在冰上来保存。将聚合酶链式反应管(axygen)转移到热循环仪(miniamp
tm
plus，applied biosystems)并通过如下条件合成了互补脱氧核糖核酸，第一步骤(25℃，5分钟)、第二步骤(55℃，60分钟)、第三步骤(70℃，15分钟)、第四步骤(4℃，保持)。完成合成的互补脱氧核糖核酸被保存在冷藏箱超低温冰箱(tsx系列，赛默飞世尔科技)。
[0135]
《荧光定量聚合酶链反应》
[0136]
在完成合成的互补脱氧核糖核酸中，使用power sybr
tm
绿色聚合酶链反应预混液(applied biosystems)和实时聚合酶链反应系统(quantstudio
tm
3，applied biosystems)来进行了荧光定量聚合酶链反应。在0.2ml聚合酶链式反应管(axygen)放入2x power绿色聚合酶链反应预混液(applied biosystems)、互补脱氧核糖核酸、正向/反向引物并用蒸馏水调节体积之后，通过移液来混合了样本。对于荧光定量聚合酶链反应的靶分子及所使用的引物的信息如以下表4所示。利用微型离心机(labogene)来对包含混合物的聚合酶链式反应管(axygen)进行降速，并将混合物转移到96孔反应板(optical，applied biosystems)的各个孔。在转移有混合物的孔反应板(optical，applied biosystems)的上面附着胶膜(optical，applied biosystems)来进行密封，利用微型离心机(labogene)来进行离心分离(3000rpm，3分钟)。将装有混合物的96孔反应板转移到实时聚合酶链反应系统(applied biosystems)，通过如下条件进行了热循环反应酵素活化(95℃，10分钟)、聚合酶链反应[40次：变性(95℃，5秒钟)，退火(60℃，25秒钟)，延伸(72℃，30秒钟)]。在进行荧光定量聚合酶链反应之前，进行热循环仪(applied biosystems)来确立了对于各个靶分子的tm(引物熔化温度)值的条件并使用。结果分析根据实时聚合酶链反应系统制备公司的指南来进行。
[0137]
【表4】
[0138]
[0139]
[0140][0141]
实验例3-4：蛋白质印迹分析：a3腺苷受体表达变化确认
[0142]
《全细胞蛋白质提取》
[0143]
为了处理游离脂肪酸以及从实验组中提取整体细胞蛋白质，在1xripa裂解缓冲液(默克)放入不含乙二胺四乙酸的蛋白酶抑制剂混合物片剂(roche)并使其溶解来实现均质化之后，提取了整体细胞蛋白质。从二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技)取出细胞培养皿并将细胞培养基全部去除之后放入1x磷酸盐缓冲液(hyclone
tm
)。利用细胞刮刀来聚集细胞并在锥形管(spl)混合1x磷酸盐缓冲液(hyclone
tm
)和细胞并在1500rpm下离心分离了4分钟。去除一部分磷酸盐缓冲液，通过轻敲(tapping)或移液(pipetting)来使细胞再悬浮(resuspension)，并转移到1.5ml微型离心管(axygen)，利用微型离心机(labogene)来在1500rpm下离心分离了4分钟。将磷酸盐缓冲液全部去除并放入1x ripa裂解缓冲液并使其移液(pipetting)之后将其放在冰上并进行反应30分钟来使其均质化。利用微型离心机(labogene)来对均质化的样品进行离心分离(13000rpm，20分钟，4℃)并分离了上层液。使用bio-rad蛋白质检测试剂盒(bio-rad)，通过多功能酶标仪(赛默飞世尔科技)来在595nm中测量并定量了在所分离的上层液中所包含的整体细胞蛋白质的量的吸收度。
[0144]
《十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)》
[0145]
将通过离心分离来分离的蛋白质和4x laemmli样本缓冲液(bio-rad，美国)以3:1的比例混合之后，在95℃的温度条件下煮沸10分钟来使蛋白质变性之后，在冰中冷却来准备了蛋白质印迹样本。为了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳而将mini-protean tgx凝胶放置在mini-proteinⅱ双平板仪(bio-rad)之后，填充电泳缓冲液(三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸/十二烷基硫酸钠缓冲液，bio-rad)，将蛋白质大小标记(bio-rad)和每个样本分配到mini-protean tgx凝胶的每个孔中，用150伏特进行电泳，直到下降到底板，以便根据分子量分离了蛋白质。
[0146]
《蛋白质印迹转移》
[0147]
将硝酸纤维素印迹膜(amersham
tm
)浸泡在转移缓冲液，将浸泡在转移缓冲液的mini转印过滤纸(bio-rad)依次折叠并放置在mini转印细胞(bio-rad)之后，用200ma转印60分钟，当通过硝酸纤维素膜(bio-rad)结束蛋白质转移时，在定轨振荡器上，通过5％(w/v)脱脂牛奶溶液[三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(tbs)缓冲液(bio-rad)，0.1％tween
tm
20(赛默飞世尔科技)，5％difco
tm
脱脂牛奶(bd生物科学)]密封了硝化纤维薄膜(amersham
tm
)60分钟。
[0148]
《抗体孵育》
[0149]
为了蛋白质印迹分析而使用的初级抗体及处理条件如以下表5所示，对于蛋白质印迹内参的第一抗体使用了3-磷酸甘油醛脱氢酶(cell signaling technology)。将初级抗体分别适当稀释在5％(w/v)脱脂牛奶溶液之后，在4℃下利用定轨振荡器(daihan)来晃
动16小时并进行蛋白质转移后，用完成封闭的硝化纤维薄膜(amersham
tm
)进行处理。回收初级抗体溶液并用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水-t溶液[三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水缓冲液(bio-rad)，0.1％tween 20(赛默飞世尔科技)]清洗聚偏二氟乙烯膜(bio-rad)之后，将稀释在5％(w/v)脱脂牛奶溶液并在室温条件下利用定轨振荡器(daihan)晃动60分钟并进行了处理。回收次级抗体溶液并进行晃动，且用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水-t溶液清洗了硝化纤维薄膜(amersham
tm
)。
[0150]
以下表5整理了用于蛋白质印迹分析的初级抗体和次级抗体的信息。
[0151]
【表5】
[0152][0153]
《蛋白质测量及分析》
[0154]
将处理次级抗体并完成清洗的硝化纤维薄膜(amersham
tm
)放入supersignal
tm
west femto超敏底物(赛默飞世尔科技)并分别按适当的时间发色之后，使用imagequant
tm
las 500(ge healthcare)来进行了扫描。
[0155]
实验例4：基于fm101(a3腺苷受体配体)及对照物质处理的相关分子的各种指标变化测量
[0156]
实验例4-1：准备fm101及对照物质的复合物原料
[0157]
将在实验中使用的通过以下化学式a表示的fm101物质及对照组在二甲基亚砜(dmso)熔解成10mm之后，将其作为试样保存在冷藏箱或超低温冰箱(tsx系列，赛默飞世尔科技)(表6)。fm101物质作为a3腺苷受体配体(ligand)，确认了其在体内实验中调节a3腺苷受体(adenosine receptor)(excli j.2020feb 12；19:187-200.)。
[0158]
[化学式a]
[0159][0160]
【表6】
[0161][0162]
实验例4-2：基于油红o染色：吸收度测量：fm101及对照物质处理的细胞内脂滴变化测量
[0163]
《细胞计数试剂盒8测量：正常化》
[0164]
针对通过与所述实验例3-1相同的方法处理fm101及对照物质的各个细胞培养测量了吸收度。
[0165]
《油红o染色》
[0166]
针对通过与所述实验例3-1相同的方法处理fm101及对照物质的各个细胞培养测量了吸收度。
[0167]
实验例4-3：基于天狼猩红染色：细胞内胶原测量：fm101及对照物质处理的细胞内胶原变化测量
[0168]
《细胞计数试剂盒8测量：正常化》
[0169]
针对通过与所述实验例3-2相同的方法处理fm101及对照物质的各个细胞培养测量了吸收度。
[0170]
《天狼猩红染色》
[0171]
针对通过与所述实验例3-2相同的方法处理fm101及对照物质的各个细胞培养测量了吸收度。
[0172]
实验例4-4：基于荧光定量聚合酶链反应：fm101及对照物质处理的炎症及纤维化相关分子的信使核糖核酸表达变化确认
[0173]
《总核糖核酸提取》
[0174]
针对通过与所述实验例3-3相同的方法处理fm101及对照物质的各个细胞培养测量吸收度来测量了核糖核酸纯度和浓度。
[0175]
《互补脱氧核糖核酸(complementary dna)合成》
[0176]
针对通过与所述实验例3-3相同的方法处理fm101及对照物质的各个细胞培养合成了互补脱氧核糖核酸。
[0177]
《荧光定量聚合酶链反应》
[0178]
针对通过与所述实验例3-3相同的方法处理量fm101及对照物质的各个细胞培养进行了荧光定量聚合酶链反应。
[0179]
图5至图14示出所述实验例3及4的结果的图表。图5至图7为对所述实验例2-7的诱导肝脂肪变性的多个细胞的a3腺苷受体(a3ar)、法尼酯x激活受体(fxr)、甲状腺激素受体-β(thr-β)及脂质等指标的表达量，图8至图9示出对所述实验例2-8的诱导肝炎症的多个细胞
的c-c基序趋化因子配体2(ccl2)、白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-6(il-6)、a3腺苷受体(a3ar)等指标的表达量，图10至图14示出对所述实验例2-9的诱导肝纤维化的多个细胞的c-c基序趋化因子配体2(ccl2)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、a3腺苷受体(a3ar)、胶原蛋白等指标的表达量。
[0180]
如图5至图14所示，与被直接共培养的细胞不同，适用本发明的三重共培养肝病模型的多个细胞在诱导肝脂肪变性、肝炎症或肝纤维化时的各种指标的变化不同地显现。并且，当处理如fm101(a3腺苷受体配体)、cf102(a3腺苷受体激动剂)、奥贝胆酸(法尼酯x激活受体激动剂)及mgl-3196(甲状腺激素受体-β激动剂)等药物时，与直接共培养的多个细胞相比，显现出更高的反应性以及依赖浓度的反应性。尤其，与直接共培养的多个细胞相比，当三重共培养肝病模型处理游离脂肪酸等时的a3腺苷受体表达量变化及当处理fm101时的a3腺苷受体表达量变化显现出显著优秀的反应性及准确性。
[0181]
以上，以本发明的实施例为中心进行了说明，但这仅为例示，而并非限定本发明，只要是本发明所属技术领域的普通技术人员，则可知道在不超出本发明的实施例的本质特性的范围内可以进行以上未例示的多种变形和应用。例如，本发明的实施例中具体表示的各个结构要素可以变形实施。而且，与这种变形和应用有关的不同之处应包括在所附的权利要求范围所规定的本发明的范围内。

技术特征：
1.一种利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，包括在直接共培养肝细胞和肝星状细胞的同时，将库普弗细胞与所述肝细胞及肝星状细胞隔开来间接共培养的步骤。2.根据权利要求1所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，将所述肝细胞和肝星状细胞培养成能够相互接触，将所述库普弗细胞培养成不与所述肝细胞及肝星状细胞接触，其中，所述肝细胞、肝星状细胞及库普弗细胞共享相同的培养基。3.根据权利要求1所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，所述肝细胞为hepg2细胞及huh-7细胞中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，所述肝星状细胞为lx-2细胞。5.根据权利要求1所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，所述库普弗细胞为永生化库普弗细胞。6.根据权利要求1所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，还包括诱导所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞发生脂肪变性、炎症或纤维化的步骤。7.根据权利要求6所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，诱导所述脂肪变性的步骤是对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞进行游离脂肪酸处理的步骤，诱导所述炎症的步骤是对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞进行游离脂肪酸及脂多糖处理的步骤，诱导所述纤维化的步骤是对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞进行游离脂肪酸及肿瘤生长因子β1处理的步骤。8.根据权利要求6所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，还包括对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞处理选自由a1腺苷受体、a
2a
腺苷受体、a
2b
腺苷受体、a3腺苷受体，β-抑制蛋白、法尼酯x激活受体及甲状腺激素受体-β组成的组中的一种或多种激动剂、部分激动剂、拮抗剂或部分拮抗剂的步骤。9.根据权利要求6所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，还包括对所述肝细胞、肝星状细胞和/或库普弗细胞测量选自由脂肪变性、炎症及纤维化组成的组中的一种或多种指标的步骤。10.根据权利要求9所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，所述指标为选自由a3腺苷受体、法尼酯x激活受体、甲状腺激素受体-β、c-c基序趋化因子配体2、赖氨酰氧化酶、ⅰ型胶原α1、ⅳ型胶原α1、白细胞介素-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、平滑肌肌动蛋白α2、金属蛋白酶组织抑制因子-1、金属蛋白酶组织抑制因子-2、肿瘤生长因子β1、趋化因子(c-x-c基序)配体8、脂质、胶原蛋白、活性氧、α平滑肌肌动蛋白及纤连蛋白组成的组中的一种或多种。11.根据权利要求1所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，开始培养并经过144小时后，所述肝细胞与肝星状细胞的细胞数量之比为2-7:1。12.根据权利要求1所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，开始培养并经过144小时后，所述肝细胞和肝星状细胞之和与所述库普弗细胞的细胞数量之比为1:1-5。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的利用三重共培养的体外肝病模型制备方法，其中，所述肝病为非酒精性脂肪性肝炎和/或非酒精性脂肪性肝病。14.一种利用三重共培养的体外肝病模型，其中，包括：第一培养器，收容有肝细胞和肝星状细胞；以及第二培养器，与所述肝细胞及肝星状细胞隔开配置，收容有库普弗细胞，其中，所述第二培养器的底面形成有尺寸比所述库普弗细胞小的多个孔隙，还包括通过所述多个孔隙同时填充所述第一培养器及第二培养器的培养基。15.根据权利要求14所述的利用三重共培养的体外肝病模型，其中，所述多个孔隙的平均尺寸为0.1-0.6μm。16.根据权利要求14所述的利用三重共培养的体外肝病模型，其中，所述培养基包括选自由胎牛血清、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、葡萄糖、丙酮酸钠、青霉素/链霉素、杜氏改良伊戈尔培养基、embryomax
tm
2mm l-谷氨酰胺、embryomax
tm
胚胎干细胞专用胎牛血清及embryomax
tm
杜氏改良伊戈尔培养基高糖组成的组中的一种或多种。

技术总结
本发明涉及一种利用三重共培养的体外肝病模型及其制备方法，所述体外肝病模型的制备方法包括在直接共培养(direct co-culture)肝细胞(hepatocyte)和肝星状细胞(hepatic stellate cell)的同时，将库普弗细胞(kupffer cell)与所述肝细胞及肝星状细胞隔开来间接共培养(indirect co-culture)的步骤，由此实现比单培养更相似的体内环境，从而可以进行快速且高度准确的分析，同时与普通的直接共培养相比，易于样本的采集及测量。易于样本的采集及测量。易于样本的采集及测量。


技术研发人员：崔允杓 徐成旭 安尚烨 朴多仁 李明勋
受保护的技术使用者：未来制药有限公司
技术研发日：2021.11.24
技术公布日：2023/8/13