β冠状病毒温度敏感性株和疫苗的制作方法

β
冠状病毒温度敏感性株和疫苗
技术领域
1.本发明涉及β冠状病毒的温度敏感性株及使用其的疫苗。


背景技术：

2.目前，针对sars-cov-2的疫苗开发在全世界迅速推进。2020年10月目前批准的疫苗仅是由俄罗斯批准的卫星-v(sputnik v)(非专利文献1)。现有技术文献非专利文献
3.非专利文献1：the lancet，volume 396，issue 10255，p887-897，september 26，2020


技术实现要素：

发明所要解决的技术问题
4.然而，卫星-v仍然是实施临床试验的阶段，在安全性、有效性上疑问的声音也在提高。此外，即使假设开始接种疫苗，也依然存在效果小、或发现严重副作用的风险，不清楚是否成为抑制感染症流行的决定性手段。因此，对于针对sars-cov-2病毒的疫苗，期望进一步的选择项。
5.因此，本发明的目的至少在于提供一种有效的毒株，作为针对sars-cov-2病毒的疫苗的有效成分。此外，在如sars-cov-2病毒那样的β冠状病毒中，有除了sars-cov-2病毒以外还有可能存在的病毒，因此本发明的目的在于提供一种有效的毒株，作为针对一般的β冠状病毒的疫苗的有效成分。用于解决技术问题的手段
6.本发明人进行了深入研究，结果发现，关于sars-cov-2病毒的规定的突变株，人的体温(所谓的下呼吸道温度)下的增殖性降低，进一步地，通过对该规定的突变株进行回复突变试验，发现规定的责任突变(日语：責任変異)在一般的β冠状病毒中可引起在人的体温(所谓的下呼吸道温度)下的增殖性降低。本发明是基于该见解并进一步重复进行研究从而完成的发明。
7.在本发明中，“温度敏感性”是具有低温(即，人的上呼吸道温度)特异性增殖能力的性质，是通过获得高温(即，人的下气道温度)下的增殖能力受到限制的特性而发挥的性质。应予说明，在本说明书中，“低温驯化”这一用语以获得具有低温(即，人的上呼吸道温度)特异性增殖能力的性质的含义使用，其实际情况是该低温特异性的增殖能力通过获得在高温(即，人的下呼吸道温度)下的增殖能力受到限制的特性而发挥，因此可以说是以“温度敏感性化”的含义使用。另外，将被“温度敏感性化”的毒株称为“温度敏感性株”。因此，在本说明书中，“低温驯化株”和“温度敏感性株”的含义相同。另外，在本发明中，“责任突变”是指具有能够成为突变表型(表现生物性状的表型因突变而发生了变化)的原因或具有与突变表型的因果关系的突变，“温度敏感性能的责任突变”是指具有能够成为温度敏感性的
获得的原因或具有与温度敏感性的获得的因果关系的突变。本发明提供以下所示的方式的发明。
8.项1.一种β冠状病毒温度敏感性株，其包含非结构蛋白，所述非结构蛋白具有以下的(b)的突变、(e)和(f)的突变的组合、和/或(h)的突变作为温度敏感性能的责任突变：(b)nsp3中相当于序列号1所示的氨基酸序列的第445位的亮氨酸的氨基酸残基的突变、(e)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第248位的甘氨酸的氨基酸残基的突变、(f)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第416位的甘氨酸的氨基酸残基的突变、(h)nsp16中相当于序列号3所示的氨基酸序列的第67位的缬氨酸的氨基酸残基的突变。
9.作为上述项1的发明的具体例，可举出以下的发明。一种β冠状病毒温度敏感性株，其包含由以下的(i)、(ii)和(iii)中的至少任一种多肽构成的非结构蛋白：(i)以下的(i-1)～(i-3)中的至少任一种多肽:(i-1)由在序列号1所示的氨基酸序列中，具有第445位亮氨酸的突变(b’)作为责任突变的氨基酸序列构成的多肽(nsp3)、(i-2)由在序列号2所示氨基酸序列中，具有第248位甘氨酸的突变(e’)和第416位甘氨酸的突变(f’)作为责任突变的氨基酸序列构成的多肽(nsp14)、(i-3)由在序列号3所示氨基酸序列中，具有第67位缬氨酸的突变(h’)作为责任突变的氨基酸序列构成的多肽(nsp16)；(ii)在上述(i)的多肽的氨基酸序列中，除了上述责任突变所涉及的氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，构成获得了温度敏感性能的β冠状病毒的多肽；(iii)在上述(i)的多肽的氨基酸序列中的除了上述责任突变所涉及的氨基酸残基以外的氨基酸序列的序列一致性为50％以上，构成获得了温度敏感性的β冠状病毒的多肽。
10.项2.根据项1所述的病毒温度敏感性株，其中，所述β冠状病毒为sars-cov-2病毒。项3.根据项1或2所述的病毒温度敏感性株，其中，人的下呼吸道温度下的增殖能力与包含不具有上述责任突变的非结构蛋白的β冠状病毒的增殖能力相比降低。项4.根据项3所述的病毒温度敏感性株，其中，所述人的下呼吸道温度为36～38℃。项5.根据项1～4中任一项所述的病毒温度敏感性株，其中，上述(b)的突变是替换为苯丙氨酸，上述(e)的突变是替换为缬氨酸，上述(f)的突变是替换为丝氨酸，上述(h)的突变是替换为异亮氨酸。项6.根据项1～5中任一项所述的病毒温度敏感性株，其包含：在所述序列号1所示的氨基酸序列中，具有所述(b)的突变的所述nsp3，在所述序列号2所示的氨基酸序列中，具有所述(e)的突变和所述(f)的突变的所
述nsp14，和/或在所述序列号3所示的氨基酸序列中，具有所述(h)的突变的nsp16。项7.根据项1～6中任一项所述的病毒温度敏感性株，其具有所述(e)的突变和所述(f)的突变。项8.根据项1～6中任一项所述的病毒温度敏感性株，其具有上述(h)的突变。项9.根据项1～6中任一项所述的病毒温度敏感性，其具有所述(b)的突变。项10.一种减毒活疫苗，其包含如项1～9中任一项所述的病毒温度敏感性株。项11.根据项10所述的减毒活疫苗，其为经鼻给药。项12.根据项10所述的减毒活疫苗，其为肌内给药、皮下给药或皮内给药。项13.一种β冠状病毒基因疫苗，其包含编码非结构蛋白的基因，所述非结构蛋白具有以下的(b)的突变、(e)和(f)的突变的组合、和/或(h)的突变作为温度敏感性能的责任突变：(b)nsp3中相当于序列号1所示的氨基酸序列的第445位的亮氨酸的氨基酸残基的突变、(e)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第248位的甘氨酸的氨基酸残基的突变、(f)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第416位的甘氨酸的氨基酸残基的突变、(h)nsp16中相当于序列号3所示的氨基酸序列的第67位的缬氨酸的氨基酸残基的突变。项14.根据项13所述的基因疫苗，其为经鼻给药、肌内给药、皮下给药或皮内给药。发明效果
11.根据本发明，可提供有效的毒株作为针对β冠状病毒的疫苗的有效成分。
附图说明
12.图1表示sars-cov-2的温度敏感性化(低温驯化)方法。图2表示sars-cov-2的温度敏感性(低温驯化)的确认结果(cpe像)。图3a表示各个病毒株的突变分析结果。图3b表示温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18)的有可能回复突变的毒株所产生的cpe像。图3c表示温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18)的有可能回复突变的毒株所产生的cpe像。图3d表示导入了在温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18)中的突变的重组病毒的温度敏感性的确认结果。图3e表示导入了在温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18)中的突变的重组病毒的温度敏感性的确认结果。图4a表示温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18)的增殖性分析结果。图4b表示温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18)的增殖性分析结果。图5表示sars-cov-2感染仓鼠的体重变动。
图6表示sars-cov-2感染仓鼠的体重变动。图7表示肺内或鼻腔清洗液的病毒量。图8表示sars-cov-2感染仓鼠的肺图像。图9表示sars-cov-2感染仓鼠的肺组织学分析结果。图10表示sars-cov-2感染仓鼠的肺组织学分析(he染色和ihc染色)。图11表示sars-cov-2再感染仓鼠的体重变动。图12表示sars-cov-2感染后仓鼠的体重变动。图13表示sars-cov-2感染后恢复仓鼠血清的中和抗体效价。图14表示sars-cov-2的温度敏感性化(低温驯化)方法(g～l50系)。图15表示sars-cov-2的温度敏感性(低温驯化)的确认结果(cpe像)。图16a表示追加分离株(h50-11、l50-33、l50-40)的突变分析结果。图16b表示温度敏感性株(低温驯化株)(h50-11)的有可能回复突变的毒株所产生的cpe像。图16c表示温度敏感性株(低温驯化株)(l50-33、l50-40)的有可能回复突变的毒株所产生的cpe像。图17表示与温度敏感性株(低温驯化株)(h50-11、l50-33、l50-40)相关联地发现的碱基序列的缺失。图18表示在图17中所示的碱基序列的缺失以及其所编码的氨基酸序列的缺失的概要图。图19表示温度敏感性株(低温驯化株)(h50-11、l50-33、l50-40)的增殖性分析结果。图20表示sars-cov-2感染仓鼠的体重变动。图21表示sars-cov-2感染仓鼠的肺重量。图22表示肺内或鼻腔清洗液的病毒量。图23表示sars-cov-2再感染仓鼠的体重变动。图24表示sars-cov-2感染后仓鼠血清的中和抗体效价。图25表示温度敏感性株(低温驯化株)相对于sars-cov-2突变株的中和活性评价。图26表示基于温度敏感性株(低温驯化株)的给药途径的免疫诱导能力的比较。图27表示基于温度敏感性株(低温驯化株)的给药量的免疫诱导能力的比较。图28表示温度敏感性株(低温驯化株)相对于sars-cov-2突变株的中和活性评价。图29表示温度敏感性株(低温驯化株)相对于sars-cov-2突变株的中和活性评价。
具体实施方式
13.1.β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)的特征在于为包含具有规定的突变作为温度敏感性能的责任突变的非结构蛋白的β冠状病毒，是温度敏感性。
14.冠状病毒在形态学上为直径约100～200nm的球形，在表面具有突起。在病毒学上，冠状病毒被分类为套式病毒目
·
冠状病毒亚科
·
冠状病毒科。在脂质双层膜的包膜中，存在卷绕于核衣壳蛋白(也称为核衣壳)的正链的单链rna的基因组，在包膜的表面配置有刺
突蛋白(spike protein)(以下也称为“刺突”)、包膜蛋白(以下也称为“包膜”)、膜蛋白。病毒基因组的大小在rna病毒中为最长的约30kb。
15.冠状病毒根据遗传学特征分类为α、β、γ、δ的组。作为感染人的冠状病毒，已知有作为感冒的致病病毒的人冠状病毒229e、oc43、nl63、hku-1这4种，以及引起重症肺炎的在2002年发生的重症急性呼吸综合征(sars)冠状病毒和2012年发生的中东呼吸综合征(mers)冠状病毒。在α冠状病毒属中分类有人冠状病毒229e和nl63，在β冠状病毒属中分类有人冠状病毒oc43、hku-1、sars冠状病毒和mers冠状病毒。
16.sars-cov-2从初期的nc045512株反复进行突变，发现在英国检出的毒株、在南非检出的毒株、在印度检出的毒株等突变株。还可以考虑尚未检测出的突变株、今后新发生突变株的可能性。在本发明中，β冠状病毒属中所含的病毒并不限定于上述sars-cov-2的毒株，也包括除此以外的所有β冠状病毒(今后新检测出的其他sars-cov-2突变株和sars-cov-2以外的β冠状病毒)。
17.基于下述表1对本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)所具有的该规定的突变进行说明。表1中作为“责任突变”而表示的突变(b)、突变(e)和突变(f)的组合、和/或突变(h)是本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)必须含有的温度敏感性(低温驯化能力)的责任突变。表1中作为“其他突变”而表示的突变(a)、(c)、(d)、(g)、(i)～(m)是本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)可以任意含有的突变，本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)可以含有其他突变的至少任意一种，也可以不含有。
18.[表1]
[0019]
即，本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)所具有的温度敏感性能的责任突变为以下(b)的突变、(e)和(f)的突变的组合、和/或(h)的突变。(b)nsp3中相当于序列号1所示的氨基酸序列的第445位的亮氨酸的氨基酸残基的突变、(e)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第248位的甘氨酸的氨基酸残基的突变、
(f)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第416位的甘氨酸的氨基酸残基的突变、(h)nsp16中相当于序列号3所示的氨基酸序列的第67位的缬氨酸的氨基酸残基的突变。
[0020]
本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)除了上述责任突变以外，还可以包含以下的(a)、(c)、(d)、(g)、(i)～(m)中的至少任一种突变作为其他突变。(a)nsp3中相当于序列号1所示的氨基酸序列的第404位的缬氨酸的氨基酸残基的突变、(c)nsp3中相当于序列号1所示的氨基酸序列的第1792位的赖氨酸的氨基酸残基的突变、(d)nsp3中相当于序列号1所示的氨基酸序列的第1832位的天冬氨酸的氨基酸残基的突变、(g)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第504位的丙氨酸的氨基酸残基的突变、(i)刺突中相当于序列号4所示的氨基酸序列的第54位的亮氨酸的氨基酸残基的突变、(j)刺突中相当于序列号4所示的氨基酸序列的第739位的苏氨酸的氨基酸残基的突变、(k)刺突中相当于序列号4所示的氨基酸序列的第879位的丙氨酸的氨基酸残基的突变、(l)包膜中相当于序列号5所示的氨基酸序列的第28位的亮氨酸的氨基酸残基的突变、以及(m)核衣壳中相当于序列号6所示的氨基酸序列的第2位的丝氨酸的氨基酸残基的突变。
[0021]
序列号1为nc_045512(ncbi)的sars-cov-2中的nsp3的氨基酸序列；序列号2为nc_045512(ncbi)的sars-cov-2中的nsp14的氨基酸序列；序列号3为nc_045512(ncbi)的sars-cov-2中的nsp16的氨基酸序列。
[0022]
此外，序列号4为nc_045512(ncbi)的sars-cov-2中的刺突的氨基酸序列；序列号5为nc_045512(ncbi)的sars-cov-2中的包膜的氨基酸序列；序列号6为nc_045512(ncbi)的sars-cov-2中的核衣壳的氨基酸序列。
[0023]“相当于”是指，在本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)为nc_045512(ncbi)的sars-cov-2的突变株的情况下，在序列号1～3或1～6的氨基酸序列中的上述规定位置存在突变，在本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)为上述突变株以外的其它β冠状病毒突变株的情况下，在其它β冠状病毒突变株具有的多肽的与上述序列号1～3或1～6对应的氨基酸序列中的、与上述规定位置对应的位置存在突变。该对应的位置可以通过对nc_045512(ncbi)的sars-cov-2的序列号1～3或1～6的蛋白质、和与序列号1～3或1～6的蛋白质对应的其他β冠状病毒突变株的蛋白质进行氨基酸序列的比对来确定。
[0024]
本发明的病毒温度敏感性株(低温驯化株)只要与序列号1～3或1～6的氨基酸序列中的上述规定位置对应的氨基酸残基发生突变即可，因此并不限定于收录在nc_045512
(ncbi)中的特定的sars-cov-2的突变株，还包含其它β冠状病毒突变株(即，其他任意的sars-cov-2的突变株和β冠状病毒属中所含的sars-cov-2以外的病毒的突变株)。收录于nc_045512(ncbi)中的特定的sars-cov-2的突变株是指，该特定的sars-cov-2中序列号1～3或1～6所示的氨基酸序列中的上述规定位置中的至少任一个氨基酸残基发生了突变的突变株，其他的β冠状病毒突变株是指，其他任意的sars-cov-2的突变株(即，与其他任意的sars-cov-2中的上述序列号1～3或1～6对应的氨基酸序列中的、与上述规定位置对应的氨基酸残基发生了突变的突变株)、和β冠状病毒属中所含的sars-cov-2以外的病毒的突变株(即，β冠状病毒属中所含的sars-cov-2以外的病毒中的与上述序列号1～3或1～6对应的氨基酸序列中的、与上述规定位置对应的氨基酸残基发生了突变的突变株)这两者。
[0025]
其他β冠状病毒突变株中的与上述序列号1～3或1～6对应的氨基酸序列只要分别对多肽的特性没有显著影响，则允许与序列号1～3或1～6所示的氨基酸序列不同。对多肽的特性没有显著影响是指保持各自作为非结构蛋白、结构蛋白的功能的状态。具体而言，在与上述序列号1～3中的责任突变对应的氨基酸以外的部位、或在进一步具有其他突变的情况下，在与上述序列号1～6中的责任突变和其他突变对应的氨基酸残基以外的部位(以下也将与这些突变对应的氨基酸以外的部位记载为“任意不同部位”)中，允许与序列号1～3或1～6的不同。允许的不同可以是选自替换、添加、插入及缺失中的1种不同(例如替换)，也可以包含2种以上的不同(例如，替换及插入)。作为仅比较其他任意sars-cov-2中与上述序列号1～3或1～6对应的氨基酸序列与序列号1～3或1～6所示的氨基酸序列的任意不同部位而算出的序列一致性，只要为50％以上即可。在其他任意的sars-cov-2中，作为该序列一致性，可举出优选为60％以上或70％以上、更优选为80％以上、进一步优选为85％以上或90％以上、进一步优选为95％以上、96％以上、97％以上、或98％以上、更进一步优选为99％以上、特别优选为99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.9％以上。在剩余的任意的β冠状病毒中，作为该序列一致性，优选举出60％以上。在此，“序列一致性”表示基于blastpackage[sgi32 bit edition，version 2.0.12；available from national center for biotechnology information(ncbi，美国国家生物技术信息中心)]的bl2seq program(tatiana a.tatsusova，thomas l.madden，fems microbiol.lett.，vol.174，p247？250，1999)得到的氨基酸序列的一致性的值。参数设定为gap insertion cost value：11、gap extension cost value：1即可。
[0026]
即，本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)更具体如下所示：一种β冠状病毒温度敏感性(低温驯化)株，包含由以下的(i)、(ii)和(iii)中的至少任意一种多肽构成的非结构蛋白：(i)以下(i-1)～(i-3)的多肽中的至少一种：(i-1)由在序列号1所示的氨基酸序列中，具有第445位亮氨酸的突变(b’)作为责任突变的氨基酸序列构成的多肽(nsp3)、(i-2)由在序列号2所示氨基酸序列中，具有第248位甘氨酸的突变(e’)和第416位甘氨酸的突变(f’)作为责任突变的氨基酸序列构成的多肽(nsp14)、(i-3)由在序列号3所示氨基酸序列中，具有第67位缬氨酸的突变(h’)作为责任突变的氨基酸序列构成的多肽(nsp16)；(ii)在上述(i)的多肽的氨基酸序列中，除了上述责任突变所涉及的氨基酸残基
以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，构成获得了温度敏感性(低温驯化)能力的β冠状病毒的多肽；(iii)在上述(i)的多肽的氨基酸序列中的除了所述责任突变所涉及的氨基酸残基以外的氨基酸序列的序列一致性为50％以上，构成获得了温度敏感性(低温驯化)能力的β冠状病毒的多肽。
[0027]
在上述更具体的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)除了责任突变之外还包含其他突变的情况下，如以下所示，上述(i-1)和(i-2)的多肽(非结构蛋白)可以分别是除了责任突变之外还具有其他突变的以下的(i-1a)和(i-2a)的多肽，上述(i)的多肽还可以包含具有其他突变的以下的(i-4a)～(i-6a)的多肽(结构蛋白)。一种β冠状病毒温度敏感性(低温驯化)株，其包含结构蛋白、或者结构蛋白和非结构蛋白，所述结构蛋白、非结构蛋白由以下的(i)、(ii)和(iii)中的至少任意一种多肽构成：(i)以下的(i-1a)、(i-2a)、(i-3)中的至少一种、或除了其(等)之外还加上以下(i-4a)～(i-6a)中的至少任一种多肽:(i-1a)由在序列号1所示的氨基酸序列中，具有作为责任突变的第445位亮氨酸的突变(b’)和作为其他突变的第404位缬氨酸的突变(a’)、第1792位赖氨酸的突变(c’)和第1832位天冬氨酸的突变(d’)中的至少任一种突变的氨基酸序列构成的多肽(nsp3)、(i-2a)由在序列号2所示的氨基酸序列中，具有作为责任突变的第248位甘氨酸的突变(e’)和第416位甘氨酸的突变(f’)和作为其他突变的第504位丙氨酸的突变(g’)的氨基酸序列构成的多肽(nsp14)、(i-3)由在序列号3所示的氨基酸序列中，具有作为责任突变的第67位缬氨酸的突变(h’)的氨基酸序列构成的多肽(nsp16)、(i-4a)由在序列号4所示的氨基酸序列中，具有作为其他突变的第54位亮氨酸的突变(i’)、第739位苏氨酸的突变(j’)和第879位丙氨酸的突变(k’)中的至少任一种突变的氨基酸序列构成的多肽(刺突)、(i-5a)由在序列号5所示的氨基酸序列中，具有作为其他突变的第28位亮氨酸的突变(l’)的氨基酸序列构成的多肽(包膜)、(i-6a)由在序列号6所示的氨基酸序列中，具有作为其他突变的第2位丝氨酸的突变(m’)的氨基酸序列构成的多肽(核衣壳)；(ii)在上述(i)的多肽的氨基酸序列中，上述责任突变和其他突变所涉及的氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，构成获得了温度敏感性(低温驯化)能力的β冠状病毒的多肽；(iii)在上述(i)的多肽的氨基酸序列中的除了所述责任突变所涉及的氨基酸残基以外的氨基酸序列的序列一致性为50％以上，构成获得了温度敏感性(低温驯化)能力的β冠状病毒的多肽。
[0028]
上述(a’)～(m’)的突变分别是指在(a)～(m)的突变具体存在于序列号1～6的氨基酸序列的情况下的突变。即，上述(i)的多肽是在由nc_045512(ncbi)的sars-cov-2所具有的序列号1～6的氨基酸序列构成的多肽中导入责任突变或除此之外还导入其他突变的多肽。另外，上述(ii)和(iii)的多肽是在由其他β冠状病毒所具有的与序列号1～6的氨基
酸序列对应的氨基酸序列构成的多肽中导入责任突变或除此之外还导入其他突变的多肽。上述(ii)和(iii)的多肽的序列一致性的优选范围已经如上所述。
[0029]
通过具有上述责任突变，β冠状病毒能够获得温度敏感性(低温驯化)特性。本发明的病毒温度敏感性株(低温驯化株)在人的下呼吸道温度下的增殖能力至少低于在比人的下呼吸道温度低的温度下的增殖能力，优选不具有在人的下呼吸道温度下的增殖能力。在本发明中，温度敏感性(低温驯化)能力通过如下方式确认：在人的下呼吸道温度下使病毒温度敏感性株以moi＝0.01感染vero细胞后，在人的下呼吸道温度下培养1天后的培养上清液中的病毒效价(tcid50/ml)与在人的上呼吸道温度下使病毒温度敏感性株以moi＝0.01感染vero细胞后，在人的上呼吸道温度下培养1天后的培养上清液中的病毒效价相比，例如减少102以上、优选减少103以上。
[0030]
典型地，本发明的病毒温度敏感性株(低温驯化株)在人的下呼吸道温度下的增殖能力与不具有上述责任突变的情况下的人的下呼吸道温度下的增殖能力相比降低。这可以通过如下方式确认：在人的下呼吸道温度下使病毒温度敏感性株以moi＝0.01感染vero细胞后，在人的下呼吸道温度下培养1天后的培养上清液中的病毒效价(tcid50/ml)与在人的下呼吸道温度下使不具有上述责任突变的毒株以moi＝0.01感染vero细胞后，在人的下呼吸道温度下培养1天后的培养上清液中的病毒效价相比，例如减少102以上、优选减少103以上。
[0031]
作为人的下呼吸道温度的代表例，可举出约37℃，具体而言，可举出比后述的上呼吸道温度高的温度，优选为36～38℃，更优选为36.5～37.5℃或37～38℃。另外，本发明的病毒温度敏感性株(低温驯化株)也可以具有在低于人的下呼吸道温度的温度下的增殖能力。例如，作为比人的下呼吸道温度低的温度，例如也可以包含人的上呼吸道温度(作为具体例，约32℃～35.5℃)。
[0032]
上述责任突变不存在于病毒感染细胞时重要的、存在于病毒表面的刺突蛋白的受体结合结构域上。因此，不仅在收录于nc_045512(ncbi)的特定的sars-cov-2中，在其他β冠状病毒中，通过导入上述责任突变，也能够合理地预想到能够进行温度敏感性化。即，即使在因世界性的感染症的流行而产生病毒的免疫原性发生变化那样的突变的情况下，通过对该突变病毒进一步导入上述的责任突变，也能够合理地预想到能够对该突变病毒赋予温度敏感性。
[0033]
另外，关于责任突变，上述(b)的突变只要是替换为除了亮氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(e)的突变只要是替换为除了甘氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(f)的突变只要是替换为除了甘氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(h)的突变只要是替换为除了缬氨酸以外的氨基酸残基即可。关于其他突变，上述(a)的突变只要是替换为除了缬氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(c)的突变只要是替换为除了赖氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(d)的突变只要是替换为除了天冬氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(g)的突变只要是替换为除了丙氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(i)的突变只要是替换为除了亮氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(j)的突变只要是替换为除了苏氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(k)的突变只要是替换为除了丙氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(l)的突变只要是替换为除了亮氨酸以外的氨基酸残基即可，上述(m)的突变只要是替换为除了丝氨酸以外的氨基酸残基即可。
[0034]
在本发明的病毒温度敏感性株(低温驯化株)的优选例中，关于责任突变，上述(b)的突变是替换为苯丙氨酸，上述(e)的突变是替换为缬氨酸且上述(f)的突变是替换为丝氨酸，和/或上述(h)的突变是替换为异亮氨酸。在该优选例还具有其他突变的情况下，关于其他突变，上述(a)的突变是替换为丙氨酸，上述(c)的突变是替换为精氨酸，上述(d)的突变是替换为天冬酰胺，上述(g)的突变是替换为缬氨酸，上述(i)的突变是替换为色氨酸，上述(j)的突变是替换为赖氨酸，上述(k)的突变是替换为缬氨酸，上述(l)的突变是替换为脯氨酸，和/或上述(m)的突变是替换为苯丙氨酸。
[0035]
在本发明的病毒温度敏感性株(低温驯化株)的另一例中，上述替换也可以是所谓的保守性替换。可以用结构和/或特性类似的氨基酸替换，例如，作为保守性替换的例子，可举出：如果替换前的氨基酸为非极性氨基酸，则替换为其他的非极性氨基酸，如果替换前的氨基酸为非带电性氨基酸，则替换为其他的非带电性氨基酸，如果替换前的氨基酸为酸性氨基酸，则替换为其他的酸性氨基酸，以及如果替换前的氨基酸为碱性氨基酸，则替换为其他的碱性氨基酸。应予说明，一般而言，“非极性氨基酸”中包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸，“非带电氨基酸”中包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺，“酸性氨基酸”中包含天冬氨酸以及谷氨酸，“碱性氨基酸”中包含赖氨酸、精氨酸以及组氨酸。
[0036]
作为本发明的病毒温度敏感性株(低温驯化株)的更优选的例子，可举出：为收录于nc_045512(ncbi)的sars-cov-2的突变株，上述(b)的突变(即(b’)的突变)为在nsp3中的序列号1所示的氨基酸序列的第445位的亮氨酸替换为苯丙氨酸(l445f)；上述(e)的突变(即(e’)的突变)为在nsp14中的序列号2所示的氨基酸序列的第248位的甘氨酸替换为缬氨酸(g248v)，且上述(f)的突变(即(f’)的突变)为在nsp14中的序列号2所示的氨基酸序列的第416位的甘氨酸替换为丝氨酸(g416s)；和/或上述(h)的突变(即(h’)的突变)为在nsp16中的序列号3所示的氨基酸序列的第67位的缬氨酸替换为异亮氨酸(v67i)。作为该更优选的例子还具有其他突变的情况的例子，进一步可举出所述(a)的突变(即(a’)的突变)为在nsp3中的序列号1所示的氨基酸序列的第404位的缬氨酸替换为丙氨酸(v404a)；所述(c)的突变(即(c’)的突变)为在nsp3中的序列号1所示的氨基酸序列的第1792位的赖氨酸替换为精氨酸(k1792r)；所述(d)的突变(即(d’)的突变)为在nsp3中的序列号1所示的氨基酸序列的第1832位天冬氨酸替换为天冬酰胺(d1832n)；所述(g)的突变(即(g’)的突变)为在nsp14中的序列号2所示的氨基酸序列的第504位的丙氨酸替换为缬氨酸(a504v)；所述(i)的突变(即(i’)的突变)为在刺突中的序列号4所示的氨基酸序列的第54位的亮氨酸替换为色氨酸(l54w)；所述(j)的突变(即(j’)的突变)为在刺突中的序列号4所示的氨基酸序列的第739位的苏氨酸替换为赖氨酸(t739k)；所述(k)的突变(即(k’)的突变)为在刺突中的序列号4所示的氨基酸序列的第879位的丙氨酸替换为缬氨酸(a879v)；所述(l)的突变(即(l’)的突变)为在包膜中的序列号5所示的氨基酸序列的第28位的亮氨酸替换为脯氨酸(l28p)；和/或所述(m)的突变(即(m’)的突变)为在核衣壳中的序列号6所示的氨基酸序列的第2位的丝氨酸替换为苯丙氨酸(s2f)。
[0037]
本发明的β冠状病毒温度敏感性(低温驯化)株还可以缺失序列号7所示的碱基序列所编码的氨基酸序列。序列号7所示的碱基序列是nc_045512(ncbi)的sars-cov-2的开放阅读框架的一部分。
[0038]
作为本发明的病毒温度敏感性株(低温驯化株)的特别优选例，可举出以下的毒株。
·
作为责任突变，具有上述(e)的突变(优选为(e’)的突变和/或g248v)和上述(f)的突变(优选为(f’)的突变和/或g416s)的毒株；或者进一步作为其它突变，具有上述(g)的突变(优选为(g’)的突变和/或a504v)、上述(k)的突变(优选为(k’)的突变和/或a879v)、上述(l)的突变(优选为(l’)的突变和/或l28p)、以及上述(m)的突变(优选为(m’)的突变和/或s2f)的毒株。
·
作为责任突变，具有上述(h)的突变(优选为(h’)的突变和/或v67i)的株；或者进一步作为其它突变，具有上述(a)的突变(优选为(a’)的突变和/或v404a)、上述(d)的突变(优选为(d’)的突变和/或d1832n)、上述(j)的突变(优选为(j’)的突变和/或t739k)的毒株；或者还具有序列号7所示的碱基序列所编码的氨基酸序列的缺失的毒株。
·
作为责任突变，具有上述(b)的突变(优选为(b’)的突变和/或l445f)的毒株；或者进一步作为其它突变，具有上述(c)的突变(优选为(c’)的突变和/或k1792r)的毒株；或者还具有上述(i)的突变(优选为(i’)的突变和/或l54w)的毒株；或者还具有序列号7所示的碱基序列所编码的氨基酸序列的缺失的毒株。
[0039]
2.疫苗2-1.减毒疫苗的有效成分如上所述，“1.β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)”中所述的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)只能在比人的下呼吸道温度低的温度下有效率地增殖，因此至少在生物体深部、其中尤其在包括引起重大损伤的肺在内的下呼吸道中不能有效率地增殖，能够期待病原性显著降低。因此，该病毒温度敏感性株(低温驯化株)作为其自身被减毒化的病毒，能够通过感染生物体而作为减毒活疫苗使用。因此，本发明还提供包含上述β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)作为有效成分的疫苗。关于有效成分的详细情况，如“1.β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)”中所述。
[0040]
2-2.基因疫苗的有效成分如上述“1.β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)”中所述，规定的突变有助于温度敏感性(低温驯化)能力的赋予。因此，本发明还提供一种β冠状病毒基因疫苗，其包含编码具有上述的温度敏感性能的责任突变的非结构蛋白的基因作为有效成分。关于有效成分中所含的温度敏感性能的责任突变的详细内容，如“1.β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)”中所述。
[0041]
2-3.作为目标的病毒能够合理地期待本发明的疫苗不仅是对sars-cov-2病毒的初期nc045512株，还对包含2020年9月在英国检出的、2020年10月在南非检出的突变株和其他公知的突变株以及其他还未检出的未知的突变株在内的大范围的sars-cov-2病毒相关株和β冠状病毒属中所含的除了sars-cov-2以外的病毒也有效。因此，本发明的疫苗以β冠状病毒为目标。
[0042]
2-4.其他成分本发明的疫苗中，除了上述有效成分以外，还可以根据目的和用途等含有佐剂、缓冲剂、等渗剂、止痛剂、防腐剂、抗氧化剂、矫臭剂、光吸收染料、稳定剂、碳水化合物、酪蛋白消化物、各种维生素等其他的成分。
[0043]
作为佐剂，例如可举出动物油(角鲨烯等)或它们的固化油；植物油(棕榈油、蓖麻油等)或它们的固化油；包含脱水甘露糖醇
·
油酸酯、液体石蜡、聚丁烯、辛酸、油酸、高级脂肪酸酯等的油性佐剂；pcpp、皂苷、葡糖酸锰、葡糖酸钙、甘油磷酸锰、可溶性乙酸铝、水杨酸铝、丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、马来酸酐共聚物、烯基衍生物聚合物、水包油型乳液、含有季铵盐的阳离子脂质等水溶性佐剂；氢氧化铝(明矾)、磷酸铝、硫酸铝等铝盐或其组合、氢氧化钠等沉降性佐剂；霍乱毒素、大肠杆菌易热性毒素等源自微生物的毒素成分；其他成分(膨润土、胞壁酰二肽衍生物、白介素等)。
[0044]
作为缓冲剂的例子，可举出磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等的缓冲液等。作为等渗剂的例子，可举出氯化钠、甘油、d-甘露糖醇等。作为止痛剂的例子，可举出苄醇等。作为防腐剂的例子，可举出硫柳汞、对羟基苯甲酸酯类、苯氧基乙醇、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸、抗生素、合成抗菌剂等。作为抗氧化剂的例子，可举出亚硫酸盐、抗坏血酸等。
[0045]
作为光吸收染料的例子，可举出核黄素、腺嘌呤、腺苷等。作为稳定剂的例子，可举出螯合剂、还原剂等。作为碳水化合物的例子，可举出山梨糖醇、乳糖、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖等。
[0046]
进而，本发明的疫苗也可以包含针对引发covid-19等β冠状病毒感染症以外的其他疾病的病毒或细菌的1个或多个其他疫苗。即，本发明的疫苗可以制备为含有其他疫苗的混合疫苗。
[0047]
2-5.剂型本发明的疫苗的剂型没有特别限定，可以根据给药方法和保存条件等适当决定。作为剂型的具体例，可举出液体制剂和固体制剂等，更具体而言，可举出片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液剂、糖浆剂等经口给药剂；注射剂、喷雾剂等非经口给药剂。
[0048]
2-6.给药方法作为本发明的疫苗的给药方法，没有特别限定，可以是肌肉、腹腔内、皮内和皮下等注射给药、来自鼻腔和口腔的吸入给药、以及经口给药等中的任一种，但优选可举出肌肉、皮内和皮下等的注射给药(肌内给药、皮内给药和皮下给药)、来自鼻腔的吸入给药(经鼻给药)，更优选可举出经鼻给药。
[0049]
2-7.适用对象作为本发明的疫苗的适用对象，只要是能够引起β冠状病毒感染所致的各种症状的对象(优选为能够通过sars-cov-2病毒感染引起covid-19症状的对象)，就没有特别限定，例如可举出哺乳类，更具体而言，可以举出人；狗和猫等宠物；鼠、小鼠、仓鼠等实验动物等。
[0050]
2-8.剂量作为本发明的疫苗的剂量，没有特别限定，可以根据有效成分的种类、给药方法、给药对象(年龄、体重、性别、有无基础疾病等条件)适当决定。例如，作为对人的剂量，可举出1
×
10
10
tcid50/kg以下、优选为1
×
108tcid50/kg以下。
[0051]
3.β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)的制造方法作为本发明的β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)的制造方法，没有特别限定，本领域技术人员可以基于上述氨基酸序列信息适当决定。例如，从制造比较廉价且批间差
少的疫苗的观点出发，优选可举出利用细菌人工染色体(bac)或酵母人工染色体(yac)等人工染色体、或使用了β冠状病毒的基因组片段的cper法等的反向遗传学法。
[0052]
在利用反向遗传学法的病毒的重构方法中，首先，克隆β冠状病毒温度敏感性株(低温驯化株)的不具有任一种责任突变的毒株(母株)的基因组。作为此时使用的母株，只要是β冠状病毒即可，具体而言，可以选自收录于上述的nc_045512(ncbi)中的特定的sars-cov-2、上述其他任意的sars-cov-2、以及β冠状病毒属中包含的sars-cov-2以外的病毒。
[0053]
进而，在反向遗传学法中利用人工染色体的情况下，将病毒基因组的全长dna克隆到bac dna或yac dna等中，在病毒的序列的上游插入真核细胞用的转录启动子序列。作为启动子序列，可举出cmv启动子和cag启动子等。在病毒的序列的下游插入核酶序列以及多聚a(polya)序列。作为核酶序列，可举出d型肝炎病毒核酶和锤头型核酶等。作为多聚a序列，可举出猴病毒40(simian virus 40)的多聚a等。
[0054]
另一方面，在反向遗传学法中利用了cper法的情况下，将病毒基因组的全长dna分为多个片段断片进行克隆。作为获得片段断片的方法，可举出核酸的人工合成法、将克隆有上述人工染色体或片段断片的质粒作为模板的pcr法等。
[0055]
为了对通过上述方法克隆的病毒基因组导入上述至少任一种责任突变，可以使用双交换和λ/red重组等同源重组法、重叠pcr法、crispr/cas9法等公知的点突变导入法。
[0056]
接着，将导入了责任突变的人工染色体转染至宿主细胞，使重组病毒重构。在利用cper法的反向遗传学法的情况下，通过使用dna聚合酶的反应将导入了责任突变的片段连接后，转染至宿主细胞，由此使重组病毒重构。作为转染的方法，也没有特别限定，可以使用公知的方法。另外，对于宿主也没有特别限定，可以使用公知的细胞。
[0057]
接着，将重构后的重组病毒添加到培养细胞中，对重组病毒进行传代培养。作为此时使用的培养细胞也没有特别限定，例如可举出：vero细胞、veroe6细胞、补充了tmpress2表达的vero细胞、补充了tmpress2表达的veroe6细胞、calu-3细胞、补充了ace2表达的293t细胞、bhk细胞、104c1细胞、小鼠神经细胞瘤来源的na细胞、vero细胞等。病毒的回收可以通过离心分离和膜过滤等公知的方法进行。另外，进一步将回收的病毒添加到培养细胞中，由此能够大量生产重组病毒。实施例
[0058]
下面举出实施例详细说明本发明，但本发明不限于此。
[0059]
[试验例1][试验例1-1]sars-cov-2的温度敏感性化株(低温驯化株)a50-18株的分离基于图1的方法，向sars-cov-2的临床分离株(以下，b-1株)中添加2种突变诱导剂5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(以下，5-fu)和5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azacytidine)(以下，5-aza)，由此取得在32℃下驯化的a～f50系和a～f500系病毒群。进而，多次进行各个病毒群的传代，从得到的406个候选株中，将能够在32℃下增殖，另一方面，在37℃下增殖性能显著降低的病毒株(a50-18株。以下有时也记作ts株)进行发现、分离、选择(图2)。
[0060]
[试验例1-2]利用二代测序的温度敏感性株(低温驯化株)a50-18株的分析(1-2-1)各个病毒株的突变分析使用二代测序仪，进行以下病毒株的突变分析。通过从感染了sars-cov-2的vero细胞的培养上清液提取rna，进行该分析。作为参照(reference)，使用了nc045512株。
b-1：野生株(临床分离株)a50-18：温度敏感性株(低温驯化株)f50-37：非温度敏感性株c500-1：非温度敏感性株f500-53：非温度敏感性株f500-40：非温度敏感性株f500-2：非温度敏感性株(除了b-1以外，为进行了突变诱导的病毒)
[0061]
(1-2-2)温度敏感性株(低温驯化株)的突变根据(1-2-1)，取得了图3a的分析结果。d614g的点突变在b-1株中也见到，因此在温度敏感性株(低温驯化株)中不是特征性点突变，另一方面，作为温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18)的特征性点突变，发现了nsp14的g248v、g416s、a504v、刺突(spike)的a879v、包膜(envelope)的l28p和核衣壳(nucleocapsid)的s2f。
[0062]
(1-2-3)回复突变株的分析1“回复突变”是指通过在突变了的病毒中加入进一步的突变，回到与突变前的最初病毒相同的表现型。在本说明书中，“回复突变”是指通过在温度敏感性株中加入进一步的突变而失去温度敏感性的特性。进一步的突变包括在温度敏感性化时加入的突变部位的氨基酸返回到突变前的氨基酸。
[0063]
使b-1株或a50-18株以moi＝0.01感染vero细胞，评价32℃、34℃、37℃下的增殖性，结果从a50-18株中发现37℃的增殖能力恢复的样品(以下，称为“回复突变株”)。在回复突变株中，认为在获得了温度敏感性的温度敏感性株(a50-18株)所具有的突变中，一部分的氨基酸残基回复突变(以下，仅称为“回复突变”)到突变前的氨基酸，由此温度敏感性降低，37℃的增殖能力恢复。将表示该情况的cpe像示于图3b。确认所得样品的序列，结果可知nsp14中的g248v的突变回复突变为野生型的g，另一方面，nsp14中的g416s、a504v和包膜中的l28p的突变被维持。由此，暗示了nsp14的g248v突变是有助于温度敏感性的责任突变。
[0064]
(1-2-4)分离株的回复突变的分析2使a50-18株以moi＝1感染vero细胞，评价37℃、38℃下的增殖性。其结果发现37℃和38℃下的增殖性恢复的样品(回复突变株)。将取得的回复突变株在37℃下培养3天后的cpe像示于图3c。确认得到的回复突变株的序列，结果发现了以下《1》和《2》这2种回复模式。《1》nsp14中的g248v的突变回复突变为野生型的g，另一方面，g416s、a504v的突变维持。《2》nsp14中的g416s的突变回复突变为野生型的g，另一方面，g248v、a504v的突变维持。
[0065]
nsp14的g248v和g416s中，如果至少1个回复突变，则失去温度敏感性，因此暗示了nsp14的g248v突变和g416s突变的组合是有助于温度敏感性的责任突变。
[0066]
(1-2-5)对野生型导入了突变的重组病毒的分析对于具有野生型的sars-cov-2全基因组的bac dna，通过同源重组导入源自a50-18株的nsp14、刺突(spike)、核衣壳(nucleocapsid)、包膜(envelope)。通过将得到的重组bac dna转染(transfection)至293t细胞而重构病毒。使重组病毒感染vero细胞，观察37℃
和32℃下的cpe，由此评价温度敏感性。将该结果表示于图3d。通过导入源自a50-18株的nsp14，在37℃培养时得到不显示cpe的温度敏感性株，由此可知nsp14为有助于温度敏感性的责任突变。另一方面，即使导入源自a50-18株的包膜，也不会成为温度敏感性，因此认为包膜的突变没有对温度敏感性作出贡献。
[0067]
(1-2-6)对野生型导入突变的重组病毒的分析2利用cper法，重构导入了nsp14突变的病毒。重构具有以下各nsp14的突变的3种重组病毒。
·
仅g248a
·
仅g416s
·
g248v和g416s(以下，也记为“双重突变株”)。使各自的重组病毒感染vero细胞，观察在37℃或32℃下培养3天后的cpe。由图3-e可知，在仅具有g248v突变的病毒、以及仅具有g416s突变的病毒中，在37℃和32℃下与b-1株同样地观察到了cpe，因此没有被温度敏感性化。另一方面，在具有g248v和g416s的突变的双重突变株的病毒中，在32℃下观察到cpe，但在37℃下，cpe为稍微观察到的程度，与32℃相比cpe明显变弱。根据上述结果可知，通过具有g248v和g416s的突变，在37℃下的病毒增殖变慢且温度敏感性化。由此可知，nsp14的g248v突变和g416s突变的组合是有助于温度敏感性的责任突变。
[0068]
(1-2-6)利用桑格测序(sanger sequence)的温度敏感性株(低温驯化株)的分析使用桑格测序，进行a50-18株的突变分析。从感染了sars-cov-2的vero细胞的培养上清液中提取rna，由此进行该分析。其结果，未发现在后述试验例2-2的(2-2-5)中确认的缺失。
[0069]
(1-2-7)温度敏感性株(低温驯化株)的突变总结在温度敏感性株(低温驯化株)a50-18株中，如下述表2所示，在显示的序列号的氨基酸序列中发现标记对钩的突变，其中，发现标记双对钩的突变作为责任突变。此外，如下述表2所示，发现了仅具有nsp14的责任突变的双重突变株也是温度敏感性株(低温驯化株)。
[0070]
[表2]
[0071]
[试验例1-3]温度敏感性株(低温驯化株)a50-18株的增殖性分析(1-3-1)在32℃和37℃下的分析在moi＝0.01或0.1的条件下，使用6孔板使临床分离株(b-1株)和温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18株)感染vero细胞(n＝3)。在37℃或32℃下培养后，以0～5dpi回收各自的培养上清液。以tcid50/ml，利用vero细胞测定0～5dpi的培养上清液病毒效价。将结果示于图4a。由图4a可知，a50-18株在37℃下的感染后第三天的病毒效价为检测限以下，在37℃下的增殖性显著降低。
[0072]
(1-3-2)32℃、34℃以及37℃下的分析在moi＝0.01的条件下，使用6孔板使临床分离株(b-1株)和温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18株)感染vero细胞(n＝3)。在37℃、34℃或32℃下培养后，以0～5dpi回收各自的培养上清液。以tcid50/ml，利用vero细胞测定0～5dpi的培养上清液病毒效价。将结果示于图4b。由图4b可知，a50-18株在32℃、34℃下与临床分离株相同程度地增殖，另一方面，在37℃下的增殖性显著欠缺。
[0073]
[试验例1-4]温度敏感性株(低温驯化株)a50-18株的病原性分析(1-4-1)sars-cov-2感染仓鼠的体重变动将4周龄雄性叙利亚仓鼠(syrian hamster)(n＝4)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)和温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18株)(1x104或1x10
6 tcid50)以100μl的容量经鼻给药，观察10天的体重变动。以将相同容量的d-mem培养基经鼻给药的组作为非感染对照(mock)。将结果示于图5。暗示了感染a50-18株时没有观察到体重减少，病原性显著低。
[0074]
(1-4-2)sars-cov-2感染仓鼠的肺内或鼻腔内的病毒量
将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝3)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)和温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18株)(1x10
6 tcid50)以100μl的容量经鼻给药。将观察3天的体重变动的结果示于图6。在以3dpi使仓鼠安乐死后，用d-pbs 1ml回收鼻腔清洗液。另外，摘出仓鼠的肺，将右肺进行破碎，利用d-mem 1ml进行悬浮后，通过离心将上清液作为肺破碎液进行回收。将这些鼻腔清洗液以及肺破碎液中的病毒量在vero细胞中用空斑形成试验进行评价，将其结果示于图7。进而，将摘出的左肺用10％福尔马林固定，将拍摄的结果示于图8。
[0075]
由图7可知，在鼻腔清洗液中，b-1株和a50-18株的病毒量没有差别，另一方面，在肺内，a50-18株的病毒显著少。此外，由图8可知，b-1株感染、体重减少的仓鼠在肺中观察到溶胀、黑变，另一方面，a50-18株感染仓鼠在体重变动、肺中没有看到明显变化。根据以上的结果，推定温度敏感性株(低温驯化株)为在上呼吸道中增殖，另一方面，在下呼吸道中不能增殖的弱毒株。
[0076]
(1-4-3)sars-cov-2感染仓鼠的组织学分析从通过在(1-4-2)中实施对仓鼠的感染实验而得到的福尔马林固定肺制作切片，进行he染色，由此分析基于sars-cov-2感染的肺的组织学的病原性。将其结果示于图9。
[0077]
如图9所示，在从感染了临床分离株(b-1株)的仓鼠得到的肺中，观察到红细胞的浸润、肺泡结构的崩解。另一方面，在温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18株)感染仓鼠的肺中，未观察到这些剧烈的病状。由此也强烈暗示了a50-18株在感染时不会在肺中诱发剧烈的炎症，病原性低。
[0078]
(1-4-4)利用免疫化学染色的sars-cov-2感染仓鼠的组织学分析对于(1-4-3)中观察到的组织学上的病原性，为了评价病毒的增殖和病原性的关联性，通过进行免疫化学染色来对病毒蛋白质进行检测。将4周龄雄性叙利亚仓鼠(b-1，a50-18：n＝5，mock：n＝3)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)和温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18株)(1x10
6 tcid50)以100μl的容量经鼻给药。在以3dpi使仓鼠安乐死后，用10％福尔马林固定摘出的左肺，制作连续切片。对得到的连续切片实施he染色以及免疫化学染色(也称为immunohistochemistry(ihc)染色)。在免疫化学染色中使用兔抗刺突多克隆抗体(sinobiological：40589-t62)。he染色图像和免疫化学染色图像如图10所示。与(1-4-3)同样地，在b-1株感染仓鼠中发现红细胞的浸润、肺泡结构的崩解，在免疫化学染色中大范围地检测出刺突蛋白。另一方面，在a50-18株感染仓鼠中，未发现这样的组织损伤，刺突蛋白也仅在局部有限的区域中被检测出。由这些结果也可知，b-1株在肺组织中病毒显著增殖，显示组织损伤性，另一方面，a50-18株在肺组织中病毒不能有效率地增殖，肺组织损伤性低。
[0079]
[试验例1-5]温度敏感性株(低温驯化株)a50-18株的免疫原性分析(1-5-1)对温度敏感性株(低温驯化株)感染仓鼠的野生株攻击试验按照以下的步骤，进行了对温度敏感性株(低温驯化株)感染仓鼠的野生株(临床分离株)攻击试验。将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝4)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)或温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18株)(1x104或1x106tcid50)以100μl的容量经鼻给药。21天后，再次将临床分离株(b-1株)(1x106tcid50)以100μl的容量经鼻给药，观察10天的体重变动。此时，将同周龄的未经感染仓鼠(n＝3)用作空白对照(naive control)。将其结果示于图11。
[0080]
如图11所示，空白仓鼠由于b-1株的感染，观察到体重的减少，另一方面，感染了一次b-1株或a50-18株的仓鼠的体重没有减少。由此可知，不仅是作为野生株的b-1株，即使在病原性低的a50-18株所致的感染中，也能够诱导有助于感染防御的免疫。
[0081]
(1-5-2)温度敏感性株(低温驯化株)感染仓鼠的中和抗体诱导分析将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝5)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)或温度敏感性株(低温驯化株)(a50-18株)(1x10
6 tcid50)以100μl的容量经鼻给药。感染后的体重变动示于图12。与此前的结果相同，由于b-1株的感染而体重减少，另一方面，在a50-18株的感染中没有观察到体重的减少。
[0082]
在感染后21天时采集全血，分离血清后，在56℃下进行30分钟利用热的血清的灭活。将100tcid50的b-1株与进行了阶段稀释的灭活血清混合，在37℃下反应1小时。将反应后的培养液接种于vero细胞，在37℃培养后，通过观察cpe来评价病毒的中和活性。将不产生cpe的最高稀释倍率作为中和抗体效价(neutralizing antibody titer)。将结果示于图13。明确了非感染仓鼠的血清不显示对于b-1株的中和活性，另一方面，b-1株或a50-18株感染仓鼠血清能够诱导中和抗体。
[0083]
[试验例2][试验例2-1]sars-cov-2温度敏感性株(低温驯化株)h50-11株，l50-33株，l50-40株的追加分离以进一步的候选株的分离为目的，利用图14的方法进行温度敏感性株(低温驯化株)的分离。使sars-cov-2的临床分离株(以下，b-1株)感染vero细胞，在添加了突变诱导剂5-fu的状态下，取得在32℃下驯化的g～l50系病毒群。进而，多次进行各病毒群的传代，从所得到的253株中，将在32℃下增殖，另一方面，在37℃下增殖性显著降低的病毒株(h50-11株，l50-33株，l50-40株)进行发现、分离、选择(图15)。
[0084]
[试验例2-2]利用二代测序的温度敏感性(低温驯化)追加分离株h50-11株、l50-33株、l50-40株的分析(2-2-1)追加分离株的突变分析法使用二代测序仪，进行以下病毒株的突变分析。通过从感染了sars-cov-2的vero细胞的培养上清液提取rna，进行该分析。作为参考，使用了nc045512株。h50-11株：温度敏感性株(低温驯化株)l50-33株：温度敏感性株(低温驯化株)l50-40株：温度敏感性株(低温驯化株)
[0085]
(2-2-2)温度敏感性株(低温驯化株)的突变分析结果通过(2-2-1)获取图16a的分析结果。作为h50-11株的特征性点突变，发现了nsp3的v404a和d1832n、nsp16的v67i和刺突的t739k。此外，作为l50-33株的特征性点突变，发现了nsp3的l445f、k1792r，作为l50-40株的特征性点突变，发现了nsp3的l445f、k1792r、刺突的l54w。
[0086]
(2-2-3)追加分离株的回复突变株的分析(h50-11株)使h50-11株以moi＝1感染vero细胞，评价37℃、38℃下的增殖性。其结果发现37℃和38℃下的增殖性恢复的样品(回复突变株)。将所取得的回复突变株在38℃培养3天后的cpe像示于图16b。确认所得样品的序列，结果可知nsp16 v67i的突变回复突变为野生型的
v，另一方面，其他氨基酸突变被维持。由此暗示了nsp16的v67i突变是有助于温度敏感性的责任突变。
[0087]
(2-2-4)追加分离株的回复突变株的分析(l50-33株和l50-40株)将l50-33株和l50-40株以moi＝0.01感染vero细胞，评价32℃、34℃、37℃下的增殖性。其结果，从l50-33株和l50-40株中发现了37℃的增殖性恢复的样品(以下，回复突变株)。将各株在37℃培养3天后的cpe像示于图16c。将l50-33株和l50-40株的回复突变株分别表示为l50-33株rev1、2和l50-40株rev1、2。确认所得样品的序列，结果可知nsp3中的l445f的突变突变为野生型的l或c，另一方面，nsp3中的k1792r的突变被维持。由此暗示了nsp3的l445f突变为有助于温度敏感性的责任突变。
[0088]
(2-2-5)利用桑格测序的温度敏感性株(低温驯化株)的分析使用桑格测序，进行h50-11株、l50-33株和l50-40株的突变分析。从感染了sars-cov-2的vero细胞的培养上清液提取rna，由此进行该分析。
[0089]
其结果，3株中全部发现了如图17所示那样的27549～28251位的碱基序列(序列号7)的缺失。27549-28251位碱基序列的缺失及其所编码的氨基酸序列的缺失的概要图示于图18。另外，在图18中，orf7a为27394～27759位的碱基序列，orf7b为27756～27887位的碱基序列，orf8为27894～28259位的碱基序列。
[0090]
如图18所示，27549～28251位的碱基序列区域相当于orf7a的一部分(第53位至末端的氨基酸序列。以下相同)、orf7b整体、以及orf8的大部分的氨基酸序列。本区域的缺失伴随着移码(frame shift)，因此认为会产生orf7a的第1-52个的氨基酸序列和orf8的3’末端8个碱基以及基因间区域和核衣壳的碱基序列编码的氨基酸序列融合而成的蛋白质。此外，orf7b整体缺失，orf8的本来的序列也整体缺失。
[0091]
(2-2-6)温度敏感性株(低温驯化株)的突变总结在温度敏感性株(低温驯化株)h50-11株、l50-33株和l50-40株中，如下述表3所示，发现在显示的序列号的氨基酸序列中标记对钩的突变，其中，发现标记双对钩的突变作为责任突变。
[0092]
[表3]
[0093]
[试验例3]追加分离株h50-11株、l50-33株、l50-40株的增殖性分析使追加分离株在moi＝0.01的条件下感染vero细胞(n＝3)。在37℃、34℃或32℃下培养后，在0～5d.p.i.中回收各自的培养上清液。以tcid
50
/ml，利用vero细胞测定这些培养上清液病毒效价。其结果示于图19。由此，所得到的追加分离株在32℃、34℃下表现出增殖性，另一方面，在37℃下增殖性出现延迟、减少。
[0094]
[试验例4]各温度敏感性株的病原性分析(4-1)温度敏感性株感染仓鼠的体重变动将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝5)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)或温度敏感性株(a50-18株、l50-33株、l50-40株、h50-11株)(3x105tcid50)以100μl的容量经鼻给药，观察10天的体重变动。以将相同容量的d-mem培养基经鼻给药的组作为非感染对照(mock)。将结果示于图20。对于感染了b-1株的仓鼠，在7天观察到20％左右的体重降低，与此相对，对于感染了温度敏感性株的仓鼠，在所有组中均未观察到显著的体重降低，暗示了病原性显著低。
[0095]
(4-2)温度敏感性株感染仓鼠的肺内或鼻腔内的病毒量将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝5)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)或温度敏感性株(a50-18株、l50-33株、l50-40株、h50-11株)(3x105tcid50)以100μl的容量经鼻给药。在以3dpi使仓鼠安乐死后，利用d-pbs 1ml回收鼻腔清洗液。另外，摘出仓鼠的肺，测定肺重量后，将右肺破碎，利用d-mem 1ml进行悬浮后，通过离心将上清液作为肺破碎液进行回收。将仓鼠的每总体重的肺重量示于图21。另外，将这些鼻腔清洗液以及肺破碎液中的病毒量在vero细胞中用空斑形成试验进行评价，将其结果示于图22。
[0096]
对仓鼠的每总体重量的肺重量进行了比较，结果b-1株感染仓鼠的肺重量增加，强烈暗示了由于炎症等而导致肺溶胀。另一方面，在温度敏感性株感染仓鼠中，未观察到这样
的肺重量的增加。此外，对鼻腔清洗液中病毒量进行了比较，结果在b-1株感染仓鼠和除了h50-11株之外的温度敏感性株感染仓鼠中没有显著的差异，h50-11株感染仓鼠在鼻腔清洗液中的病毒量少。进而可知，温度敏感性株感染仓鼠与b-1株感染仓鼠相比肺内病毒量显著减少。由这些结果可以推测，各温度敏感性株是与试验例1中的a50-18株同样地在下呼吸道中不能增殖的弱毒株。
[0097]
[试验例5]各温度敏感性株的免疫原性分析(5-1)对温度敏感性株感染仓鼠的野生株攻击试验将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝5)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)或温度敏感性株(a50-18株、l50-33株、l50-40株、h50-11株)(3x105tcid50)以100μl的容量经鼻给药。21天后，再次将临床分离株(b-1株)(3x10
5 tcid50)以100μl的容量经鼻给药，观察9天的体重变动。此时，将同周龄的未经感染仓鼠(n＝5)用作空白对照。将其结果示于图23。空白仓鼠由于b-1株的感染而观察到体重的减少，另一方面，感染了一次b-1株和各温度敏感性株的仓鼠的体重没有减少。由此可知，不仅是作为野生株的b-1株，即使在由病原性低的各温度敏感性株所致的感染中，也能够诱导有助于感染防御的免疫。
[0098]
(5-2)温度敏感性株感染仓鼠的中和抗体诱导分析将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝5)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)或温度敏感性株(a50-18株、l50-33株、l50-40株、h50-11株)(3x105tcid50)以100μl的容量经鼻给药。20天后实施部分采血，使用所得血清测定对临床分离株(b-1株)的中和活性。中和活性的测定方法使用与(1-5-2)相同的方法。将测量结果示于图24。明确了不仅是b-1株的感染，而且在各温度敏感性株感染仓鼠中也诱导具有中和活性的抗体。
[0099]
[试验例6]对sars-cov-2突变株的有效性分析(6-1)对温度敏感性株感染仓鼠血清的sars-cov-2突变株的中和活性评价将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝3或5)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)或温度敏感性株(a50-18株)(3x10
5 tcid50)以100μl的容量经鼻给药。从感染后3周的仓鼠实施部分采血，使用所得到的血清测定对于sars-cov-2欧洲型临床分离株(b-1)和巴西型突变株(hcov-19/japan/ty7-503/2021株)的活病毒的中和活性，将其结果示于图25。中和活性的测定方法使用与(1-5-2)相同的方法。可知感染了b-1株、温度敏感性株的仓鼠对巴西型突变株也显示中和活性。因此，认为本减毒活疫苗有可能对于sars-cov-2突变株也是有效的。
[0100]
[试验例7]给药途径、给药量的比较研究实验(7-1)基于给药途径的免疫诱导能力的比较将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝5)饲养一周后，将临床分离株(b-1株)或温度敏感性株(a50-18株)(3x10
5 tcid50)以100μl的容量经鼻或皮下给药。将未处理组设为空白对照(naive)。3周后，使用从仓鼠通过部分采血得到的血清，评价对于sars-cov-2巴西型突变株(hcov-19/japan/ty7-503/2021株)的中和活性。中和活性的测定方法使用与(1-5-2)相同的方法。将中和活性的结果示于图26。i.n表示经鼻给药，s.c表示皮下给药。在b-1株、a50-18株的经鼻给药中，对于活病毒能够诱导中和抗体。关于皮下给药，在试验的剂量下几乎无法诱导中和抗体，但鉴于经鼻给药的结果，认为如果增加剂量，则即使是皮下给药也能够诱导中和抗体。
[0101]
(7-2)基于给药量的免疫诱导能力的比较
将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝5)饲养一周后，将温度敏感性株(a50-18株)经鼻或皮下给药。将给药量示于表4。
[0102]
[表4]从感染后3周的仓鼠实施部分采血，使用所得到的血清，测定对于sars-cov-2巴西型突变株(hcov-19/japan/ty7-503/2021株)的活病毒的中和活性，将其结果示于图27。i.n表示经鼻给药，s.c表示皮下给药。中和活性的测定方法使用与(1-5-2)相同的方法。与(7-1)相同，在经鼻给药中，即使是1x10
2 tcid50/10μl的低剂量给药组，也观察到中和抗体效价的上升。由此，暗示了即使是少量的鼻腔给药，温度敏感性株也能够诱导充分的免疫。关于皮下给药，在试验的剂量下几乎无法诱导中和抗体，但鉴于经鼻给药的结果，认为如果增加剂量，则即使是皮下给药也能够诱导中和抗体。
[0103]
[试验例8]sars-cov-2突变株的有效性分析将4周龄雄性叙利亚仓鼠(n＝4)饲养一周后，将1x10
4 tcid50或1x10
2 tcid50的温度敏感性株(a50-18株)以10μl的容量经鼻给药。从感染后3周的仓鼠实施部分采血，使用所得到的血清，测定对于sars-cov-2欧洲型野生株(b-1株)、印度型突变株(自体分离株)、巴西型突变株(hcov-19/japan/ty7-503/2021株)的活病毒的中和活性，将其结果示于图28。中和活性的测定方法使用与(1-5-2)相同的方法。可知即使是将a50-18株少量经鼻给药的个体，也不仅是作为母株且野生型的b-1株，还能够剂量依赖性地诱导针对印度型突变株和巴西型突变株的中和抗体。
[0104]
此外，将各个体的血清对各株的中和抗体效价进行比较，结果示于图29。可知对于巴西型突变株，虽然在一部分个体中可观察到中和抗体效价的减少，但在所有个体中保有中和抗体。由这些结果暗示了由温度敏感性株的经鼻给药产生的免疫显示交叉防御的可能性。

技术特征：
1.一种β冠状病毒温度敏感性株，其包含非结构蛋白，所述非结构蛋白具有以下的(b)的突变、(e)和(f)的突变的组合、和/或(h)的突变作为温度敏感性能的责任突变：(b)nsp3中相当于序列号1所示的氨基酸序列的第445位的亮氨酸的氨基酸残基的突变、(e)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第248位的甘氨酸的氨基酸残基的突变、(f)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第416位的甘氨酸的氨基酸残基的突变、(h)nsp16中相当于序列号3所示的氨基酸序列的第67位的缬氨酸的氨基酸残基的突变。2.根据权利要求1所述的病毒温度敏感性株，其中，所述β冠状病毒为sars-cov-2病毒。3.根据权利要求1或2所述的病毒温度敏感性株，其中，在人的下呼吸道温度下的增殖能力与包含不具有所述责任突变的非结构蛋白的β冠状病毒的增殖能力相比降低。4.根据权利要求3所述的病毒温度敏感性株，其中，所述人的下呼吸道温度为36～38℃。5.根据权利要求1～4中任一项所述的病毒温度敏感性株，其中，所述(b)的突变是替换为苯丙氨酸，所述(e)的突变是替换为缬氨酸，所述(f)的突变是替换为丝氨酸，所述(h)的突变是替换为异亮氨酸。6.根据权利要求1～5中任一项所述的病毒温度敏感性株，其中，所述病毒温度敏感性株包含：在所述序列号1所示的氨基酸序列中具有所述(b)的突变的所述nsp3，在所述序列号2所示的氨基酸序列中具有所述(e)的突变和所述(f)的突变的所述nsp14，和/或在所述序列号3所示的氨基酸序列中具有所述(h)的突变的nsp16。7.根据权利要求1～6中任一项所述的病毒温度敏感性株，其中，所述病毒温度敏感性株具有所述(e)的突变和所述(f)的突变。8.根据权利要求1～6中任一项所述的病毒温度敏感性株，其中，所述病毒温度敏感性株具有所述(h)的突变。9.根据权利要求1～6中任一项所述的病毒温度敏感性株，其中，所述病毒温度敏感性株具有所述(b)的突变。10.一种减毒活疫苗，其包含权利要求1～9中任一项所述的病毒温度敏感性株。11.根据权利要求10所述的减毒活疫苗，其中，所述减毒活疫苗能够经鼻给药。12.根据权利要求10所述的减毒活疫苗，其中，所述减毒活疫苗能够肌内给药、皮下给药或皮内给药。13.一种β冠状病毒基因疫苗，其包含编码非结构蛋白的基因，所述非结构蛋白具有以下的(b)的突变、(e)和(f)的突变的组合、和/或(h)的突变作为温度敏感性能的责任突变：(b)nsp3中相当于序列号1所示的氨基酸序列的第445位的亮氨酸的氨基酸残基的突变、(e)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第248位的甘氨酸的氨基酸残基的突
变、(f)nsp14中相当于序列号2所示的氨基酸序列的第416位的甘氨酸的氨基酸残基的突变、(h)nsp16中相当于序列号3所示的氨基酸序列的第67位的缬氨酸的氨基酸残基的突变。14.根据权利要求13所述的基因疫苗，其中，所述基因疫苗能够经鼻给药、肌内给药、皮下给药或皮内给药。

技术总结
本发明提供了一种有效的毒株，作为针对β冠状病毒的疫苗的有效成分。SARS-CoV-2病毒包含具有以下的责任突变的非结构蛋白：NSP3中相当于序列号1的第445位的L的氨基酸残基的突变；NSP14中相当于序列号2的第248位的G和第416位的G的氨基酸残基的突变、和/或NSP16中相当于序列号3的第67位的V的氨基酸残基的突变。当于序列号3的第67位的V的氨基酸残基的突变。当于序列号3的第67位的V的氨基酸残基的突变。


技术研发人员：冈村真弥 柏原秋穗 虾名博贵
受保护的技术使用者：一般财团法人阪大微生物病研究会
技术研发日：2021.10.13
技术公布日：2023/8/13