一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法

1.本发明涉及均相免疫分析领域，特别涉及一种均相催化化学发光免疫检测试剂盒，还涉及其制备方法和使用方法。


背景技术：

2.均相免疫分析是抗原和抗体在同一介质中进行免疫反应的分析方法，而非均相免疫分析则将抗体或抗原固定在固相载体表面，通过特异性免疫反应，将所需的抗原或抗体结合在固相表面形成抗原－抗体免疫复合物的分析方法。目前免疫分析技术主要是基于微孔板的非均相反应模式。这一类技术方法不仅需要抗体或抗原的包埋，而且免疫反应过程缓慢，需要多次洗涤不利于自动化。而均相免疫分析技术无需抗体或抗原的包埋、反应迅速、无需洗涤、易于实现高通量和自动化，因此目前越来越受到大家的关注和推崇。
3.光激化学发光免疫分析（amplified luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbent assay，alphalisa）技术是一新型的均相免疫分析技术，其是化学和生物两个学科的有机结合：在化学方面，该技术采用了含有感光材料（如酞菁类物质）的供体纳米材料和含有发光物质（如红荧烯、铕螯合物等）的受体纳米材料。在 680 nm 的激发光照射下，供体纳米材料中的感光材料激发周围的氧分子转化为高能态的1o2。1o2的半衰期约为4
ꢀµ
s，这决定了它的扩散直径约为200 nm，如果超过了这一范围1o2就会回落到基态。产生的1o2向外扩散，免疫夹心复合物中的受体纳米材料则能接收到1o2，与内部的1o2触发光试剂发生反应产生能量，这一能量迅速转移至受体纳米材料中的发光试剂，发光试剂接收到能量后继而产生发射光，供仪器检测，因此光激化学发光免疫分析技术本底很低，显著提高了信噪比。
4.但alphalisa模式下，供体材料仍需要外部光源激发和精密的光源控制系统，这对仪器设备等硬件有很高的要求，也提升了检测成本；另一方面光源的穿透能力有限，产生1o2的效率不高。因此，提供一种不用外界光激发，利用化学催化反应原位产生 1o2 来激发受体体材料发光，实现高效、灵敏的均相检测是非常有必要的。


技术实现要素：

5.本发明针对非均相检测以及alphalisa技术的不足，提供了一种均相催化化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法，所述方法利用催化触发发光原理，使得所述方法同时具有无需外界光激发、无需洗涤步骤、仪器要求低、灵敏度高等优势。
6.为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明第一方面提供一种均相催化化学发光试剂盒，其包括：供体探针、受体探针和过氧化氢（h2o2）；所述供体探针包括相连的供体材料和第一识别分子，所述受体探针包括相连的受体材料和第二识别分子；其中，所述供体材料用于催化过氧化氢产生单线态氧（1o2）；所述第一识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、dna或rna中的一种或多种；所述受体材料具有单线态氧触发循环发光特性；所述受体材料包括单线态氧触发发光
的试剂；所述单线态氧触发发光的试剂包括作为化学发光物质的n,n-二甲基-4-(6-苯基-2,3-二氢-1,4-氧硫杂环丁-5-基)苯胺，以及作为发光增强剂的2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基) 丙二腈；所述第二识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、dna或rna中的一种或多种；所述第一识别分子和第二识别分子用于特异性结合目标分子。
8.进一步的，其还包括：所述目标分子的标准品；所述目标分子是抗原、肽、抗体、氨基酸、dna、rna、病毒、激素、药物或代谢物。
9.进一步的，所述供体材料为钼酸钠、次氯酸钠、硬脂酸钼、硫化钼、磷酸钼、氧化锰基材料及其衍生物中的一种；所述供体材料的表面还连接有化学基团，所述化学基团为环氧基、氯甲基、巯基、氨基、羟基、马来胺基、磺酸基、羧基和醛基中的至少一种。
10.进一步的，所述受体材料还包括球状载体，所述单线态氧触发发光的试剂包埋于所述球状载体内；其中，所述球状载体为介孔二氧化硅、树状大分子聚合物、聚苯乙烯微球、金属有机框架、共价有机框架或脂质体；所述受体材料的表面还连接有化学基团，所述化学基团为环氧基、氯甲基、巯基、氨基、羟基、马来胺基、磺酸基、羧基和醛基中的至少一种。
11.进一步的，所述供体材料的平均粒径为5 nm~1000 nm，即所述供体材料的平均粒径可为5 nm、10 nm、50 nm、100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nm或1000 nm。所述受体材料的平均粒径为5 nm~1000 nm，即所述受体材料的平均粒径可为5 nm、10 nm、50 nm、100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nm或1000 nm。
12.本发明第二方面提供上述的均相催化化学发光试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：采用化学偶联方法将第一识别分子连接至供体材料表面，制得供体探针；采用化学偶联方法将第二识别分子连接至受体材料表面，制得受体探针；将过氧化氢以5 μm~5 m的浓度溶解于超纯水中，用于催化反应，得到所述均相催化化学发光试剂盒。
13.进一步的，所述化学偶联方法包括重氮法，戊二醛法，戊二酸酐法或碳化二亚胺法；所述第一识别分子与供体材料的摩尔比例为（10~1000）：1；所述第二识别分子与受体材料的摩尔比例为（10~1000）：1。
14.本发明第三方面提供上述的均相催化化学发光试剂盒的使用方法，其特征在于：该使用方法包括如下步骤：（1）将所述供体探针和受体探针分别加入到待测样品溶液中，形成待测混合物；当待测样品中含有目标分子，将形成供体探针-目标分子-受体探针免疫复合物；当待测样品中不含有目标分子，则供体探针和受体探针将处于分离状态，不会形成免疫复合物；（2）向所述待测混合物中加入过氧化氢，供体材料将过氧化氢分解为单线态氧和h2o；当形成免疫复合物，则单线态氧扩散至受体探针，产生化学发光；当待测混合物中没有免疫复合物存在，则不会产生化学发光；（3）使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号，即可实现对待测样品中目标分子浓度的定量检测。
15.进一步的，所述步骤（1）中的反应温度为20℃~50℃，时间为3~30分钟；所述步骤（3）中使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号的时间为1~5分钟；所述步骤（3）中化学发光的发射波长为400 nm~2000 nm。
16.本发明的有益效果是：
17.本发明提供一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法。试剂盒包括
连接第一识别分子的供体材料形成供体探针，连接第二识别分子的受体材料形成受体探针，以及催化底物过氧化氢，供体材料可以催化h2o2产生单线态氧；受体材料具有1o2触发发光特性。本发明的试剂盒采用均相免疫技术，可配合现有发光检测仪使用，用于测定待测样本中目标分子含量。与光激化学发光技术相比，无需光激发、无需特殊检测仪器、灵敏度高；与酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，elisa）技术等非均相免疫分析相比，无洗涤步骤、操作简单、检测线性范围宽、检测流程所需时间短、灵敏度高、准确度高。
附图说明
18.一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
19.图1为一种均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的原理图；
20.图2为循环增强化学发光的原理图；
21.图3为用于检测人血清中甲胎蛋白（afp）的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线；
22.图4为用于检测人血清中氨基末端脑钠肽前体（nt-probnp）的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线；
23.图5为用于检测人鼻/咽拭子中sars-cov-2核衣壳蛋白（sars-cov-2 np）的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线；
24.图6为用于检测牛奶样本中乳铁蛋白（lf）的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线；
25.图7为用于检测人血清中肺腺癌患者突变dna的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线；
26.图8为本发明实施例1的发光时间曲线图。
具体实施方式
27.本发明第一方面提供一种均相催化化学发光试剂盒，如图1所示，所述试剂盒包括：供体探针、受体探针和过氧化氢（h2o2）；所述供体探针包括相连的供体材料和第一识别分子，所述受体探针包括相连的受体材料和第二识别分子；其中，所述供体材料用于催化过氧化氢产生单线态氧（1o2）；所述第一识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、dna或rna中的一种或多种；所述受体材料具有单线态氧触发发光特性；所述第二识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、dna或rna中的一种或多种。需要说明的是，第一识别分子和第二识别分子为同类别中的不同物质。例如：第一识别分子和第二识别分子均为抗体，但是却为不同的抗体。另外，过氧化氢在此处为催化底物。
28.本发明第二方面提供上述的均相催化化学发光试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
29.采用化学偶联方法将第一识别分子连接至供体材料表面，制得供体探针；
30.采用化学偶联方法将第二识别分子连接至受体材料表面，制得受体探针；
31.将过氧化氢以5 μm~5 m的浓度溶解于超纯水中，用于催化反应，得到所述均相催化化学发光试剂盒。即在实际使用的过程中，本发明的试剂盒包括供体探针溶液、受体探针
溶液以及过氧化氢溶液，共三种单独存放的溶液。
32.本发明第三方面提供上述的均相催化化学发光试剂盒的使用方法，其特征在于：该使用方法包括如下步骤：
33.（1）将所述供体探针和受体探针分别加入到待测样品溶液中，形成待测混合物；
34.如果待测样品中含有目标分子，将形成供体探针-目标分子-受体探针免疫复合物；若待测样品中不含有目标分子，则供体探针和受体探针将处于分离状态，不会形成免疫复合物；
35.（2）向所述待测混合物中加入过氧化氢，供体材料将过氧化氢分解为单线态氧和h2o；
36.如果形成免疫复合物，则单线态氧扩散至受体探针，产生化学发光；如果待测混合物中没有免疫复合物存在，则不会产生化学发光；
37.（3）使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号，即可实现对待测样品中目标分子浓度的定量检测。
38.为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
39.需要说明的是，本发明所述用语“待测样品”是指待测的含有或疑似含有目标分子的一种混合物。可以被用在本发明的待测样品包括体液，如血液(可以是在收集的血液样品中通常看到的抗凝血)、血浆、血清、尿、精液、唾液、汗液、细胞培养物、组织提取物等。其他类型的待测样品包括溶剂、海水、工业水样、食品样品、环境样本诸如土或水、植物材料、真核细胞、细菌、质粒、病毒、真菌、及来自于原核的细胞。待测样品可以在使用前根据需要利用稀释液进行稀释。例如，为了避免hook效应，可以在上机检测前使用稀释液对待测样品进行稀释后再在检测仪器上进行检测。
40.本发明所述用语“目标分子”是指检测时待测样本中的物质。与目标分子具有特异性结合亲合力的识别分子会被用于检测该目标分子。目标分子可以是抗原、肽、抗体、氨基酸、dna、rna、病毒、激素、药物、代谢物等。
41.实施例1
42.供体材料为钼硫化合物—蛋白质纳米复合物，蛋白质为卵清蛋白（ovalbumin，ova），平均粒径为5 nm；受体材料为聚苯乙烯微球包埋可1o2触发发光的试剂，聚苯乙烯微球表面连接有羧基，平均粒径为200 nm；可1o2触发发光的试剂由化学发光物质 n,n-二甲基-4-(6-苯基-2,3-二氢-1,4-氧硫杂环丁-5-基)苯胺（so）和发光增强剂 2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基) 丙二腈（ttmn）组成；检测原理为：1o2可以攻击so，形成so的不稳定中间体，该中间体从激发态回到基态会释放波长为470 nm的光，此发光可以作为光源，该波段的光再激发邻近的发光增强剂ttmn，使ttmn发出650 nm的发光，并进一步产生1o2，攻击so，由此形成循环增强的化学发光，该发射光可作为光学信号被发光检测仪探测和采集，用于目标分子定量检测，见图2；目标分子为甲胎蛋白（alpha fetoprotein，afp）；第一识别分子为抗afp抗体1；第二识别分子为抗afp抗体2；待测样本为人血清。
43.使用经典的单线态氧产生方法即钼酸钠+过氧化氢使溶液中产生大量的单线态氧，进而使聚苯乙烯微球包埋so和ttmn (stps)产生循环增强化学发光，可以看到发光可持续1200秒（20分钟），如图8所示。
44.具体实施步骤：
45.1. 钼硫化合物—ova纳米复合物（moo）的制备
46.称取ova 60 mg 于 30 ml 加入到超纯水中，磁力搅拌溶解成澄清透明水溶液，然后加入 na2moo4•
2h2o（66.9 mg）和na2s
•
9h2o（66.6 mg）进行搅拌混合，得到混合液。该条件下 mo 与 s 的摩尔比为 1：1。随后，加入 naoh（1 m）的水溶液调节混合液 ph 至 11（约消耗 naoh 400 μl），磁力搅拌下缓慢滴加盐酸水溶液（1 m）调节 ph 至 6.5（约消耗 800 μl），滴加过程中可观察到溶液颜色缓慢变黄。调节ph 后避光反应 1 h，将反应液转移至透析袋（截留分子量 3200）中透析 15 h，以除去反应产生的盐小分子杂质。透析液冻干得到淡黄色固体粉末，-20℃储存备用。
47.2. 抗afp抗体1连接moo制备供体探针
48.（1）称取 10 mg moo溶解 1 ml 超纯水中，加入 0.2 ml 新配的 0.1 m naio4溶液，室温下避光反应 20 分钟。
49.（2）将上述溶液装入透析袋中，用 1 mm、ph 4.4 的醋酸钠缓冲液透析，4 ℃过夜。
50.（3）加20 μl、0.2 m、ph 9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化过桯的ph升高到9.0～9.5，然后立即加 5 mg 抗afp抗体1 在 1ml 0.01m 碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌 2小时。
51.（4）加 0.1 ml 新配的 4 mg/ml nabh4溶液，充分混匀，在 4 ℃下避光放置两小时，于 0.15 m（ph 7.4）pbs 中 4℃透析过夜。
52.（5）透析完成后，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4 ℃条件下放置 2 小时，3000 r/min 离心30 min，取沉淀，用半饱和硫酸铵溶液再次洗涤 2 次后，将沉淀溶于 0.15 m（ph 7.4）的 pbs 中。
53.（6）透析除盐，保存于4 ℃备用。
54.3. 聚苯乙烯微球包埋so和ttmn (stps)的制备
55.通过溶胀法合成stps。首先将5 mg ttmn和3 mg so溶解在3 ml 丙二醇甲醚溶液中，并预热至70 ℃。随后，加入1 ml 羧基化聚苯乙烯微球（200 nm，100mg/ml），反应30分钟。然后立即停止加热，并将溶液冷却到室温，制得stps。将合成的stps用去离子水洗涤三次，在13500 rpm下离心15分钟，并将残余物重新分散在4 ml去离子水中。准备好的stps溶液在4 ℃的黑暗环境中保存，以备将来使用。
56.4. 抗afp抗体2连接stps制备受体探针
57.采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（edc）一步法在stps表面连接afp抗体2。
58.（1）移取10 μl的stps溶于1 ml 磷酸盐缓冲液（pbs缓冲液）（0.01 m，ph =7.4），加入10 μg 抗afp抗体2，静电吸附30 min，随后加入5 μg edc搅拌反应30 min，重复3次，观察有/无stps的聚集现象；
59.（2）随后加入100 μl mg 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)（10 mg/ml），静电吸附30 min后加入5 μg edc反应30 min；
60.（3）再次加入5 μg edc反应30 min，离心，沉淀复溶至100 μl复溶液中。
61.复溶液成分：0.01 m pbs缓冲液(ph =7.4)中含25% 蔗糖与0.1% 叠氮钠，1% bsa，1% 吐温20。
min；
77.（4）再次加入5 μg edc反应30 min，13500 rpm离心15 min，沉淀复溶至100 μl复溶液中。
78.复溶液成分：0.01m pbs缓冲液(ph =7.4)中含25%蔗糖与0.1% 叠氮钠，1% bsa，1%吐温20。
79.3. 聚苯乙烯微球包埋so和eu
ⅲꢀ
(seups)的制备
80.通过溶胀法合成seups。首先将5 mg euⅲ和3 mg so溶解在3 ml 丙二醇甲醚溶液中，并预热至70 ℃。随后，加入1 ml 羧基化聚苯乙烯微球（100 nm，100mg/ml），反应30分钟。然后立即停止加热，并将溶液冷却到室温。将合成的seups用去离子水洗涤三次，在13500 rpm下离心15分钟，并将残余物重新分散在4 ml去离子水中。准备好的seups溶液在4 ℃的黑暗环境中保存，以备将来使用。
81.4. nt-probnp适配体2连接seups制备受体探针
82.采用edc一步法在seups表面连接nt-probnp适配体2。
83.（1）移取10 μl的seups溶于1 ml pbs缓冲液（0.01 m，ph =7.4），加入10 μm nt-probnp适配体2，静电吸附30 min，随后加入5 μg edc搅拌反应30 min，重复3次，观察有/无\ seups的聚集现象；
84.（2）随后加入100 μl mg bsa（10 mg/ml），静电吸附30 min后加入5 μg edc反应30 min；
85.（3）再次加入5 μg edc反应30 min，离心，沉淀复溶至100 μl复溶液中。
86.复溶液成分：0.01mpbs缓冲液(ph =7.4)中含25%蔗糖与0.1%叠氮钠，1% bsa，1%吐温20。
87.5. 用于检测nt-probnp抗原的标准曲线的绘制
88.将nt-probnp标准品用pbs（0.01m，ph 7.4）缓冲液分别稀释至不同的浓度梯度，具体为：10000、5000、2500、1250、625、313、156、78、39、19.5、9.8和0 fg/ml。分别取200 μl上述不同浓度的nt-probnp标准品，同时加入6 μl包被抗体1的供体纳米材料和6 μl包被抗体2的受体纳米材料，37℃反应10 min后，加入10μl 0.1m的h2o2，2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。以所得到的光强度为纵坐标，以nt-probnp浓度 (pg/ ml)为横坐标绘制标准曲线，计算出线性方程。具体实验结果如下：线性标准曲线为y = 5.6953ln(x)
ꢀ‑
17.131，r
²ꢀ
= 0.9849，见图4。该方法的最低检测限被定义检测20个nt-probnp浓度为0时所得到结果的平均发光强度+3倍标准偏差，通过该标准曲线计算得最低检测线为10 fg/ml。
89.6. 检测血清样本中nt-probnp的含量
90.本发明催化均相化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法用于检测血清样本中nt-probnp含量时，通过以下步骤实施：
91.首先将血清样本稀释10倍，随后同时将6 μl供体探针和6 μl受体探针加入到稀释后的样本中，37 ℃反应10 min后，加入10 μl 0.1m的h2o2，h2o2和mnox反应原位产生1o2，产生的1o2可以攻击受体材料，使其发出615 nm化学发光。2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。将结果发光强度代入实施例2中5的标准曲线中，计算出所对应样本的浓度，即为血清样本中nt-probnp的实际浓度。
92.实施例3
min，重复3次，观察有/无ps的聚集现象；
124.（3）随后加入100 μl mg mob（10 mg/ml），静电吸附30 min后加入5 μg edc反应30 min；
125.（4）再次加入5 μg edc反应30 min，离心，沉淀复溶至100 μl复溶液中。
126.复溶液成分：0.01mpbs缓冲液(ph =7.4)中含25%蔗糖与0.1%叠氮钠，1% bsa，1%吐温20。
127.2. 脂质体（lpo）包埋so和cds (lsc)的制备
128.首先将5 mg cds和3 mg so溶解在3 ml 丙二醇甲醚溶液中。随后，加入1 ml 羧基lpo（1000 nm，100 mg/ml），反应30分钟。然后立即停止加热，并将溶液冷却到室温。将合成的lsc用去离子水洗涤三次，在13500 rpm下离心15分钟，并将残余物重新分散在4 ml去离子水中。准备好的lsc溶液在4 ℃的黑暗环境中保存，以备将来使用。
129.3. 抗lf抗体2连接lsc制备受体探针
130.（1）移取10 μl的lsc溶于1 ml pbs缓冲液（0.01 m，ph =7.4），加入10 μg 抗lf抗体2，静电吸附30 min，随后加入5 μg edc搅拌反应30 min，重复3次，观察有/无lsc的聚集现象；
131.（2）随后加入100 μl mg bsa（10 mg/ml），静电吸附30 min后加入5 μg edc反应30 min；
132.（3）再次加入5 μg edc反应30 min，离心，沉淀复溶至100 μl复溶液中。
133.复溶液成分：0.01mpbs缓冲液(ph =7.4)中含25%蔗糖与0.1%叠氮钠，1% bsa，1%吐温20。
134.4. 用于检测lf的标准曲线的绘制
135.将lf标准品用pbs（0.01m，ph 7.4）缓冲液分别稀释至不同的浓度梯度，具体为：1000 ng/ml、500 ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、62.5 ng/ml、31.3 ng/ml、15.6 ng/ml、7.8 ng/ml、3.9 ng/ml、1.95 ng/ml、0.98 ng/ml和0 ng/ml。分别取200 μl上述不同浓度的lf标准品，同时加入6 μl供体探针和6 μl受体探针，37 ℃反应10 min后，加入10 μl、0.1 m的h2o2，2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。以所得到的发光强度为纵坐标，以lf浓度 (ng/ml)为横坐标绘制标准曲线，计算出线性方程。具体实验结果如下：线性标准曲线为y = 0.0793x + 4.2983，r
²ꢀ
= 0.9956，见图6。该方法的最低检测限被定义检测20个lf浓度为0时所得到结果的平均发光强度+3倍标准偏差，通过该标准曲线计算得最低检测线为3.9 ng/ml。
136.5. 检测牛奶样本中lf的含量
137.本发明均相催化化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法用于检测牛奶样本中lf含量时，通过以下步骤实施：
138.首先将牛奶样本稀释10倍，随后同时将6 μl供体探针和6 μl受体探针加入到稀释后的样本中，37 ℃反应10 min后，加入10 μl 0.1 m的h2o2，h2o2和moo反应，原位产生1o2，产生的1o2可以攻击受体探针，使其内部cds分子被氧化发出980 nm的光。2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。将结果发光强度代入实施例4中4的标准曲线中，计算出所对应样本的浓度，即为牛奶样本中lf的实际浓度。
139.实施例5
140.供体材料为氧化钼纳米粒子（moo3），平均粒径为50 nm；受体材料为金属有机框架（mof）包埋可1o2触发发光的试剂；mof表面连接有羧基，平均粒径为50 nm；可1o2触发发光的试剂由化学发光物质ampa和发光增强剂异硫氰酸荧光素（fitc）组成；fitc的发射波长为520 nm；目标分子肺腺癌患者突变dna；第一识别分子为与突变dna配对的dna1；第二识别分子为与突变dna配对的dna2；待测样本为人血清。
141.具体实施步骤：
142.1. 氧化钼纳米粒子（moo3）的制备
143.取 2.5 g 二水钼酸钠于三口烧瓶中，加入 50 ml蒸馏水并搅拌使之溶化，并超声 30 min 后，在超声中逐滴加入硼氢化钾溶液，待反应 30 min 后过滤，经冷冻干燥，得到氧化钼纳米粒子。
144.2. 突变dna序列
145.gttggagctagtggcgtag
146.3. dna1序列
147.agctccaac-cooh
148.3. dna2序列
149.aaaaaaaaaaaaaaaaaaaatttt ctacgccact-nh2150.4. dna1连接moo3制备供体探针
151.（1）称取 10 mg sh-peg2000-nh2溶解 1ml moo
3 (1 mg/ml)中，室温下反应过夜。10000 rpm离心15 min，沉淀复溶于1 ml pbs缓冲液（0.01 m，ph =7.4），
152.（2）将dna1溶解在0.5 ml超纯水中，随后取35 μm dna1加入到含有1 ml pbs（ph 7.4）溶液中。
153.（2）加入0.1 mm的edc和0.4 mm的n-羟基丁二酰亚胺（n-hydroxy succinimide，nhs）反应4 h。
154.（3）继续加入20 mg moo，反应4 h，于 0.15 m（ph 7.4）pbs 中 4℃透析过夜。
155.（5）透析完成后，保存于4 ℃备用。
156.5. 金属有机框架（mof）包埋ampa和fitc （maf）的制备
157.首先将5 mg fitc和3 mg ampa溶解在3 ml 丙二醇甲醚溶液中。随后，加入1 ml 羧基化mof（50 nm，100 mg/ml），反应30分钟。然后立即停止加热，并将溶液冷却到室温。将合成的maf用去离子水洗涤三次，在13500 rpm下离心15分钟，并将残余物重新分散在4 ml去离子水中。准备好的maf溶液在4 ℃的黑暗环境中保存，以备将来使用。
158.6. dna2连接maf制备受体探针
159.（1）移取10 μl的maf溶于1 ml pbs缓冲液（0.01 m，ph =7.4），加入35 μm dna2，静电吸附30 min，随后加入5 μg edc搅拌反应30 min，重复3次，观察有/无maf的聚集现象；
160.（2）随后加入100 μl mg 氨基葡萄糖（10 mg/ml），静电吸附30 min后加入5 μg edc反应30 min；
161.（3）再次加入5 μg edc反应30 min，离心，沉淀复溶至100 μl复溶液中。
162.复溶液成分：0.01mpbs缓冲液(ph =7.4)中含25%蔗糖与0.1%叠氮钠，1% bsa，1%吐温20。
163.7. 用于检测肺腺癌患者突变dna的标准曲线的绘制
164.将突变dna标准品用pbs（0.01m, ph 7.4）缓冲液分别稀释至不同的浓度梯度，具体为：25000 pg/ml、5000 pg/ml、1000 pg/ml、200 pg/ml、40 pg/ml、8 pg/ml、1.6 pg/ml、0.32 pg/ml、0.064 pg/ml、0 pg/ml。分别取200 μl上述不同浓度的突变dna标准品，同时加入6 μl供体探针和6 μl受体探针，37 ℃反应10 min后，加入10 μl 0.1 m的h2o2，2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。以所得到的发光强度为纵坐标，以突变dna浓度 (pg/ml)为横坐标绘制标准曲线，计算出线性方程。具体实验结果如下：线性标准曲线为y = 4.3221ln(x) + 4.1995，r
²ꢀ
= 0.9929，见图7。该方法的最低检测限被定义检测20个突变dna浓度为0时所得到结果的平均发光强度+3倍标准偏差，通过该标准曲线计算得最低检测线为0.16 pg/ml。
165.8. 检测人血清样本中肺腺癌患者突变dna的含量
166.本发明均相催化化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法用于检测人血清样本中肺腺癌患者突变dna含量时，通过以下步骤实施：
167.首先将人血清样本稀释10倍，随后同时将6 μl供体探针和6 μl受体探针加入到稀释后的样本中，37 ℃反应10 min后，加入10 μl、0.1 m的h2o2，h2o2和moo反应，原位产生1o2，产生的1o2可以攻击受体探针，使其内部fitc分子发出520 nm的光。 2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。将结果发光强度代入按照实施例5中7的标准曲线中，计算出所对应样本的浓度，即为人血清样本中肺腺癌患者突变dna的实际浓度。
168.本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本技术的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本技术的精神和范围。任何本领域技术人员，在不脱离本技术的精神和范围内，均可作各自更动与修改，因此本技术的保护范围应当以权利要求限定的范围为准。

技术特征：
1.一种均相催化化学发光试剂盒，其特征在于，其包括：供体探针、受体探针和过氧化氢；所述供体探针包括相连的供体材料和第一识别分子，所述受体探针包括相连的受体材料和第二识别分子；其中，所述供体材料用于催化过氧化氢产生单线态氧；所述第一识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、dna或rna中的一种或多种；所述受体材料具有单线态氧触发循环发光特性；所述受体材料包括单线态氧触发发光的试剂；所述单线态氧触发发光的试剂包括作为化学发光物质的n,n-二甲基-4-(6-苯基-2,3-二氢-1,4-氧硫杂环丁-5-基)苯胺，以及作为发光增强剂的2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基) 丙二腈；所述第二识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、dna或rna中的一种或多种；所述第一识别分子和第二识别分子用于特异性结合目标分子。2.根据权利要求1所述的均相催化化学发光试剂盒，其特征在于，其还包括：所述目标分子的标准品；所述目标分子是抗原、肽、抗体、氨基酸、dna、rna、病毒、激素、药物或代谢物。3.根据权利要求1所述的均相催化化学发光试剂盒，其特征在于，所述供体材料为钼酸钠、次氯酸钠、硬脂酸钼、硫化钼、磷酸钼、氧化锰基材料及其衍生物中的一种；所述供体材料的表面还连接有化学基团，所述化学基团为环氧基、氯甲基、巯基、氨基、羟基、马来胺基、磺酸基、羧基和醛基中的至少一种。4.根据权利要求1所述的均相催化化学发光试剂盒，其特征在于，所述受体材料还包括球状载体，所述单线态氧触发发光的试剂包埋于所述球状载体内；其中，所述球状载体为介孔二氧化硅、树状大分子聚合物、聚苯乙烯微球、金属有机框架、共价有机框架或脂质体；所述受体材料的表面还连接有化学基团，所述化学基团为环氧基、氯甲基、巯基、氨基、羟基、马来胺基、磺酸基、羧基和醛基中的至少一种。5.根据权利要求1所述的均相催化化学发光试剂盒，其特征在于，所述供体材料的平均粒径为5 nm~1000 nm；所述受体材料的平均粒径为5 nm~1000 nm。6.根据权利要求1至5中任一项所述的均相催化化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：采用化学偶联方法将第一识别分子连接至供体材料表面，制得供体探针；采用化学偶联方法将第二识别分子连接至受体材料表面，制得受体探针；将过氧化氢以5 μm~5 m的浓度溶解于超纯水中，用于催化反应，得到所述均相催化化学发光试剂盒。7.根据权利要求6所述的均相催化化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于，所述化学偶联方法包括重氮法，戊二醛法，戊二酸酐法或碳化二亚胺法；所述第一识别分子与供体材料的摩尔比例为（10~1000）：1；所述第二识别分子与受体材料的摩尔比例为（10~1000）：1。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的均相催化化学发光试剂盒的使用方法，其特征在于，该使用方法包括如下步骤：（1）将所述供体探针和受体探针分别加入到待测样品溶液中，形成待测混合物；当待测样品中含有目标分子，将形成供体探针-目标分子-受体探针免疫复合物；当待测样品中不含有目标分子，则供体探针和受体探针将处于分离状态，不会形成免疫复合物；（2）向所述待测混合物中加入过氧化氢，供体材料将过氧化氢分解为单线态氧和h2o；当形成免疫复合物，则单线态氧扩散至受体探针，产生化学循环发光；当待测混合物中没有免疫复合物存在，则不会产生化学发光；（3）使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号，即可实现对待测样品中目标分子浓度的定量检测。9.根据权利要求8所述的均相催化化学发光试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤（1）中的反应温度为20℃~50℃，时间为3~30分钟；所述步骤（3）中使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号的时间为1~5分钟；所述步骤（3）中化学发光的发射波长为400 nm~2000 nm。

技术总结
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法。所述试剂盒包括连接第一识别分子的供体材料、连接第二识别分子的受体材料和催化底物过氧化氢（H2O2），所述供体材料可以催化H2O2产生单线态氧（1O2）；所述受体材料具有1O2触发发光特性。本发明的试剂盒采用均相免疫技术，可配合现有发光检测仪使用，用于测定待测样本中目标分子含量，与光激化学发光（AlphaLISA）技术相比，无需光激发、无需特殊检测仪器、灵敏度高，与酶联免疫吸附（ELISA）技术等非均相免疫分析相比，无洗涤步骤、操作简单、检测线性范围宽、检测流程所需时间短、灵敏度高、准确度高。高。高。


技术研发人员：张兵波 郝良文 杨维涛
受保护的技术使用者：同济大学
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/8/13