盐酸度洛西汀在制备抗新型冠状病毒药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及盐酸度洛西汀在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。


背景技术：

2.由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)引发的covid-19在全球迅速蔓延，对公众健康已经构成了巨大的威胁。特别是sars-cov-2仍然在不断地变异，已经出现了二次甚至多次感染，严重影响公众的健康和经济的发展，疫苗和治疗药物的研发仍不可或缺。
3.针对sars-cov-2研发的疫苗有灭活疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗、病毒样颗粒疫苗(胡亮,王春花,李光军等.新型冠状病毒疫苗及治疗药物研究进展[j].中国病毒病杂志,2023,13(02):136-142.doi:10.16505/j.2095-0136.2023.2010.)，在前期均达到了较好的预防效果。但是病毒在不断地变异，疫苗的预防效果也在逐渐降低，即使接种了疫苗也有大部分人仍感染上了sars-cov-2，呈现了不同程度的病毒感染症状。因此，除了疫苗的预防，治疗药物的研发也至关重要。随着对新型冠状病毒认识的不断加深和治疗经验的积累，新型冠状肺炎的诊疗方案也在不断更新，如小分子抗病毒药物利巴韦林、干扰素、磷酸氯喹、阿比多尔、奈玛特韦片/利托那韦片等；大分子生物抗病毒药物托珠单抗、covid-19人免疫球蛋白、康复者恢复期血浆、安巴韦单抗注射液(brii-196)/罗米司韦单抗注射液(brii-198)；以及中药连花清瘟胶囊、疏风解毒胶囊、清肺排毒汤等药物疗法。但是其中不少药物存在部分患者疗效不明显，多数药物都伴有副作用等问题(柴华锋,王珂,宋淑亮.抗新型冠状病毒的药物治疗[j].中国比较医学杂志,2022,32(10):136-141.)。因此，仍迫切需要提供更多抗新型冠状病毒的药物，以供临床治疗选择。


技术实现要素：

[0004]
本发明要解决的技术问题是克服现有治疗药物伴有副作用，药物可选择范围较少的缺陷和不足，提供一种盐酸度洛西汀在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
[0005]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0006]
度洛西汀(duloxetine)是一种新型口服选择性5-羟色胺(5-ht)和去甲肾上腺素(ne)双重再摄取抑制剂(snri)。其中，5-ht和ne均属于中枢神经递质，度洛西汀通过抑制神经元突触对这两种神经递质的再摄取，使大脑及脊髓中5-ht和ne的浓度升高，提高机体的耐受力，从而改善抑郁症患者的情绪不适及疼痛性症状等。2004年8月，度洛西汀首次获美国批准用于治疗成人严重抑郁症，随后在欧美等国家获批用于其他疾病，包括广泛性焦虑症、妇女应激性尿失禁症的治疗，以及糖尿病外周神经病性疼痛和纤维肌痛的缓解等。在临床上，为了提高药物稳定性等性能，度洛西汀一般以其盐酸盐即盐酸度洛西汀形式给药。
[0007]
本发明提供了盐酸度洛西汀在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
[0008]
发明人在研发抗新型冠状病毒药物过程中发现，盐酸度洛西汀可以抑制新型冠状病毒复制子在hek293t细胞中的复制；测定盐酸度洛西汀在vero-e6和a549-hace2细胞中对新型冠状病毒活病毒的抑制作用，所得盐酸度洛西汀对新型冠状病毒活病毒的半数有效浓度较低；并且，实验结果表明盐酸度洛西汀对细胞毒性的cc
50
较高，该药还通过了药物临床安全性验证，安全性较好，计算得到的治疗指数si大于40，具有较好的治疗新型冠状病毒效果。
[0009]
进一步地，所述盐酸度洛西汀抑制新型冠状病毒的复制。
[0010]
更近一步地，所述新型冠状病毒为sars-cov-2突变株d614g。
[0011]
进一步地，所述盐酸度洛西汀对新型冠状病毒的半数有效浓度ec
50
为0.4～10μm。具体的，本发明中所述盐酸度洛西汀在a549-hace2细胞中对新型冠状病毒的半数有效浓度ec
50
为0.48μm；在vero e6细胞中对新型冠状病毒的半数有效浓度ec
50
为9.45μm。
[0012]
更近一步地，结合所测得的ec
50
和cc
50
去计算治疗指数，所述盐酸度洛西汀对新型冠状病毒在a549-hace2细胞上的治疗指数为si》40。
[0013]
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
[0014]
优选地，所述辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。所述辅料根据要制备的剂型进行选择。
[0015]
更优选地，可作为药学上可接受辅料的物质包括，但并不限于，离子交换剂，铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸脂，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-阻断聚合体，羊毛脂，糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素和它的衍生物如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；树胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；辅料如可可豆脂和栓剂蜡状物；油如花生油，棉子油，红花油，麻油，橄榄油，玉米油和豆油；二醇类化合物，如丙二醇和聚乙二醇；酯类如乙基油酸酯和乙基月桂酸酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐；林格(氏)溶液；乙醇，磷酸缓冲溶液，和其他无毒的合适的润滑剂如月桂硫酸钠和硬脂酸镁，着色剂，释放剂，包衣衣料，甜味剂，调味剂和香料，防腐剂和抗氧化剂。
[0016]
更近一步地，所述药物为口服剂、注射剂或吸入剂。
[0017]
优选地，所述口服剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液等剂型。
[0018]
进一步地，所述盐酸度洛西汀还可以为盐酸度洛西汀的衍生物、结构类似物、立体异构体、水合物、溶剂化物或药学上可接受的盐或前药。
[0019]
本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙酸和氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。
[0020]
本发明所述盐酸度洛西汀存在自由形态，或合适的、作为药学上可接受的衍生物。根据本发明，药学上可接受的衍生物包括，但并不限于，药学上可接受的前药、盐、酯、酯类
的盐，或能直接或间接地根据患者的需要给药的其他任何加合物或衍生物，本发明其他方面所描述的化合物，其代谢产物或他的残留物。
[0021]
更近一步地，所述抗新型冠状病毒药物还含有病毒抑制剂。
[0022]
进一步地，所述病毒抑制剂选自病毒进入抑制剂、病毒脱壳抑制剂、病毒逆转录酶抑制剂、病毒蛋白合成抑制剂、病毒蛋白酶抑制剂、病毒聚合酶抑制剂、病毒整合酶抑制剂、干扰素中的一种或多种。
[0023]
本发明要求保护的化合物应用于制备抗新型冠状病毒药物，但不限于，使用本发明的化合物的有效量对患者给药来制备用于预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病，减轻新型冠状病毒引发的疾病症状或者延缓新型冠状病毒引发的疾病的发展或发作的药品的用途。
[0024]
本发明要求保护的药物新应用除了对人类治疗有益以外，还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物，包括哺乳动物，啮齿类，禽类动物等等。另外一些动物的实例包括马、狗、猫、猪等。
[0025]
本发明具有以下有益效果：
[0026]
本发明提供了盐酸度洛西汀在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述盐酸度洛西汀在细胞中可以显著抑制新型冠状病毒的复制，并且在vero-e6和a549-hace2细胞中显著地抑制新型冠状病毒活病毒的复制，具有显著的新型冠状病毒抑制作用；另外的，本发明化合物盐酸度洛西汀已通过了药物临床安全性验证，对细胞的毒性较小，治疗指数较高，非常适于应用于抗新型冠状病毒的治疗中。
附图说明
[0027]
图1为本发明实施例1中不同浓度盐酸度洛西汀在hek293t细胞中对新冠病毒复制子的抑制曲线图。
[0028]
图2为本发明实施例2中不同浓度盐酸度洛西汀在vero-e6细胞中对新冠病毒的抑制曲线图。
[0029]
图3为本发明实施例3中不同浓度盐酸度洛西汀在a549-hace2细胞中对新冠病毒的抑制曲线图。
[0030]
图4为本发明实施例4中不同浓度盐酸度洛西汀对a549-hace2细胞活性影响的数据统计图。
具体实施方式
[0031]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0032]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0033]
实施例1盐酸度洛西汀在新型冠状病毒复制子系统上对病毒复制的抑制作用
[0034]
(1)实验过程：
[0035]
将hek293t细胞按照4
×
104个细胞每孔的密度接种到48孔细胞培养板中，并于5％ co2、37℃培养箱中培养过夜(约12h)。待细胞完全贴壁后采用
invitrogen
tm
lipofectamine
tm
2000试剂进行细胞转染，每孔转染250ng新型冠状病毒复制子质粒和15ng tk质粒。转染6h后更换新的培养基250μl/孔，设置细胞对照(无化合物处理)和实验组(化合物药物盐酸度洛西汀处理)，药物按照20μm、10μm、5μm、2μm、1μm、0.5μm、0.1μm浓度加入到细胞中。加药48h之后，通过检测双荧光值来反应病毒复制情况。
[0036]
(2)结果分析：
[0037]
实验结果参见图1，由图可见，盐酸度洛西汀在一定浓度条件下对新型冠状病毒复制子有显著的抑制作用，其半数有效浓度ec
50
为2.14μm。
[0038]
实施例2盐酸度洛西汀在vero-e6细胞中对新型冠状病毒活性的影响
[0039]
(1)实验过程：
[0040]
将vero e6细胞按照2
×
104个细胞每孔的密度接种到48孔细胞培养板中，并于5％ co2、37℃培养箱中培养。等待细胞完全贴壁后，分别以moi＝0.05接种新型冠状病毒d614g株到细胞内，感染1小时后更换培养基，设置细胞对照(无化合物处理，病毒感染和不感染)和实验组(化合物药物盐酸度洛西汀处理)。将培养液稀释的化合物加入细胞培养板。48h之后，收集细胞上清液体，提取rna，通过qpcr检测病毒拷贝数。
[0041]
(2)结果分析：
[0042]
实验结果参见图2，由图可见，盐酸度洛西汀在vero-e6细胞中和一定浓度条件下可以显著地抑制新型冠状病毒d614g株的复制，半数有效浓度ec
50
为9.45μm。
[0043]
实施例3盐酸度洛西汀在a549-hace2细胞中对新型冠状病毒活性的影响
[0044]
(1)实验过程：
[0045]
将a549-hace2细胞以2
×
104个细胞每孔的密度接种到48孔细胞培养板中，并于5％ co2、37℃培养箱中培养。等待细胞完全贴壁后，分别以moi＝0.05接种新型冠状病毒d614g株到细胞内，感染1小时后更换培养基，设置细胞对照(无化合物处理，病毒感染和不感染)和实验组(化合物药物盐酸度洛西汀处理)。将培养液稀释的化合物加入细胞培养板。48h之后，收集细胞上清液体，提取rna，通过qpcr检测病毒拷贝数。
[0046]
(2)结果分析：
[0047]
实验结果参见图3，由图可见，盐酸度洛西汀在a549-hace2细胞中和一定浓度条件下可以显著地抑制新型冠状病毒d614g株的复制，半数有效浓度ec
50
仅为0.48μm，抑制效果较强。
[0048]
实施例4盐酸度洛西汀对a549-hace2细胞的细胞毒性
[0049]
(1)实验过程：
[0050]
将a549-hace2细胞按照1
×
104个细胞每孔的密度接种到96孔细胞培养板中，并于5％ co2、37℃培养箱中培养。等待细胞完全贴壁后，设置细胞对照(dmso组，无细胞组)和实验组(化合物药物盐酸度洛西汀处理)。将培养液稀释的化合物按照0μm、0.0625μm、0.125μm、0.25μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、20μm浓度加入细胞。待加药48h之后，使用细胞活性检测试剂bimake cell counting kit-8(cck-8)检测每孔细胞活力。
[0051]
(2)结果分析：
[0052]
实验结果参见图4，由图可见，盐酸度洛西汀在a549-hace2细胞中表现出较低的毒性，cc
50
》20μm，根据实施例3盐酸度洛西汀在a549-hace2细胞中对新型冠状病毒半数有效浓度ec
50
为0.48μm，计算出盐酸度洛西汀在a549-hace2上，对新型冠状病毒的治疗指数si》
41.67，说明盐酸度洛西汀非常适合用于治疗新冠病毒感染的疾病中，具有较高的安全性。
[0053]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.盐酸度洛西汀在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述盐酸度洛西汀抑制新型冠状病毒的复制。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述新型冠状病毒为sars-cov-2突变株d614g。4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述盐酸度洛西汀对新型冠状病毒的半数有效浓度ec
50
为0.4～10μm。5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述盐酸度洛西汀对新型冠状病毒在a549-hace2细胞上的治疗指数为si>40。6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。7.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为口服剂、注射剂或吸入剂。8.根据权利要求1～7任一所述应用，其特征在于，所述盐酸度洛西汀还可以为盐酸度洛西汀的衍生物、结构类似物、立体异构体、水合物、溶剂化物或药学上可接受的盐或前药。9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述抗新型冠状病毒药物还含有病毒抑制剂。10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述病毒抑制剂选自病毒进入抑制剂、病毒脱壳抑制剂、病毒逆转录酶抑制剂、病毒蛋白合成抑制剂、病毒蛋白酶抑制剂、病毒聚合酶抑制剂、病毒整合酶抑制剂、干扰素中的一种或多种。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及盐酸度洛西汀在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。所述盐酸度洛西汀在Vero-E6和A549-hACE2细胞中显著地抑制新型冠状病毒活病毒的复制，具有显著的新型冠状病毒抑制作用；另外，本发明化合物盐酸度洛西汀已通过了药物临床安全性验证，对细胞的毒性较小，治疗指数较高，非常适合应用于抗新型冠状病毒的治疗中。适合应用于抗新型冠状病毒的治疗中。适合应用于抗新型冠状病毒的治疗中。


技术研发人员：郭德银 曹流 黄思瑶 徐铁凤 杨斯迪 冀彦锡
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/13