蟾毒灵在制备抗伪狂犬病毒药物中的用途

1.本发明属于抗病毒药物领域，具体涉及蟾毒灵在制备抗伪狂犬病毒药物中的用途。


背景技术：

2.伪狂犬病是由伪狂犬病毒(peudorabies virus,prv)引起的一种病毒性传染病。prv属于疱疹病毒科、疱疹病毒亚科、水痘疱疹病毒属。通过遗传进化分析，发现伪狂犬病毒与牛疱疹病毒ⅰ型、马疱疹病毒ⅰ型以及水痘带状疱疹病毒具有很高的同源性。猪是prv的唯一天然宿主，除猪以外，prv还可以感染多种哺乳动物，包括绵羊、犬、牛、狐狸、狼、老虎等，而且也出现过人类感染伪狂犬病毒的事件，这说明prv对公共卫生存在潜在威胁。
3.prv病毒粒子呈正二十面体结构，由内而外依次为核心dna、核衣壳、被膜及囊膜，同时在囊膜上还有许多8-10nm且呈放射状排列的刺突蛋白。
4.prv的传播方式有水平和垂直两种，呼吸道、消化道、交配、精液和胎盘等均可进行病毒传播。prv可感染各年龄段的猪，危害较大，常使仔猪整窝发病，出现高热、精神沉郁、呼吸困难并震颤流涎等神经症状；育肥猪感染prv后出现生长缓慢、咳嗽及发烧等症状；但prv侵袭成年猪后一般为隐性经过，死亡率较低；prv侵袭母猪后会导致配种障碍；妊娠母猪感染prv后流产、产死胎或木乃伊胎；pr可使公猪睾丸肿胀、萎缩、精液质量下降、性功能降低甚至丧失生殖能力。
5.目前灭活疫苗和减毒活疫苗都被广泛用于预防和控制pr。我国在20世纪50年代报告了第一例伪狂犬病毒，bartha-k61疫苗在20世纪70年代引入我国。随着prv变异毒株的出现，原有疫苗的免疫保护效果可能会出现一定程度下降。当前，并没有研发出有效治疗prv感染的药物，因此prv的抗病毒药物研究具有不错的前景。
6.蟾毒灵是从中药蟾酥中分离出来的，具有抗癌活性，是类地高辛免疫反应的主要成分蟾毒灵可与na
+
/k
+-atpase的亚基α1、α2和α3结合，是类固醇受体共激活剂src-3、src-1和na
+
/k
+-atpase的有效抑制剂。蟾酥味辛，性温，有毒，归心经。辛散温通，香开辟秽，毒大力强，专入心经。外用解毒消肿、止痛；内服除止痛外，又辟秽开窍而醒神。目前还没有关于蟾毒灵抑制伪狂犬病毒的研究报道。
7.

技术实现要素：

8.目前还没有关于蟾毒灵抑制抗伪狂犬病毒的研究报道，本发明的目的在于提供一种蟾毒灵在制备抗伪狂犬病毒药物中的用途。
9.本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
10.本发明的第一方面提供蟾毒灵在制备抗伪狂犬病毒药物中的用途。
11.进一步的，所述蟾毒灵用于抑制动物伪狂犬病毒的感染。
12.进一步的，所述蟾毒灵浓度大于0.12μm。
13.进一步的，所述蟾毒灵用于降低伪狂犬病毒感染后动物的死亡率。
14.进一步的，所述蟾毒灵的剂量为0.5mg/kg。
15.进一步的，所述蟾毒灵用于抑制伪狂犬病毒的入胞阶段。
16.进一步的，所述蟾毒灵用于降低伪狂犬病毒感染后动物的脏器出血。
17.进一步的，所述脏器包括肺和脑。
18.本发明的第二方面，提供一种抗伪狂犬病毒药物，包括蟾毒灵，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
19.在一些优选的实施方式中，所述抗伪狂犬病毒药物可以为片剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。
20.本组合物可通过本领域已知药物注射方式施用，包括但不限于经皮下、肌肉、静脉注射施用。
21.有益效果
22.蟾毒灵用于抗伪狂犬病毒效果非常显著；实验证明蟾毒灵在细胞实验中展现出明显的抗病毒活性，在0.12μm的浓度下即可展现出极强的抗伪狂犬病毒(moi＝0.15)感染作用。
23.蟾毒灵用于抗伪狂犬病毒安全、毒副作用少；蟾毒灵为中草药中提取成分，不同于激素、抗生素、化学合成药物等，对机体无明显毒副作用。
24.蟾毒灵用于抗伪狂犬病毒药物残留低、无污染；蟾毒灵属于有机分子化合物，容易被动物机体吸收，生物代谢率高，且排泄无污染。
附图说明
25.图1为cck-8方法检测蟾毒灵对pk15细胞的毒性的结果。分别用10、40、60、80μm蟾毒灵处理pk15细胞24小时后，然后加入cck-8溶液显色4小时，并在450nm读取细胞吸光度检测细胞活性；
26.图2为cell-based elisa方法测定蟾毒灵在pk15细胞上对伪狂犬病毒的抑制效果。分别用0.002-2μm mm蟾毒灵预处理pk15细胞2小时，然后后在药物浓度不变的情况下感染prv(0.15moi)，24小时后对细胞进行固定，孵育抗prv-ul42蛋白一抗和hrp标记的兔抗鼠二抗，显色后在吸光度450nm处读取数值，计算伪狂犬病毒感染率。对数据进行分析，获得蟾毒灵抑制50％的病毒所需要的浓度(ic50)。
27.图3为western blot测定蟾毒灵在pk15细胞上抑制伪狂犬病毒感染的活性。0.015-0.12μm蟾毒灵预处理pk15细胞2小时后感染伪狂犬病毒，之后蟾毒灵一直存在，24小时后收取细胞进行western blot测定细胞中伪狂犬病毒蛋白含量；
28.图4为间接免疫荧光测定蟾毒灵在pk15细胞上抑制prv感染；分别以不同浓度的蟾毒灵预处理pk15细胞2小时后感染伪狂犬病毒，之后蟾毒灵一直存在，18小时后固定细胞，用3％bsa封闭，孵育抗prv ul42蛋白的一抗和fitc结合的抗小鼠igg二抗；用dapi(含防荧光淬灭剂)在室温下避光染色。最后，用光导耦合照明荧光光源u-hglgps对细胞进行观察。
29.图5为噬斑形成实验测定蟾毒灵在pk15细胞上对伪狂犬病毒入胞阶段抑制结果。用5μm蟾毒灵预处理pk15细胞2小时，感染伪狂犬病毒(5moi)并置于4℃感作1小时，而后将细胞置于37℃条件下静置1小时，这期间蟾毒灵一直存在，收取细胞沉淀用噬斑形成试验测定病毒滴度。
30.图6为蟾毒灵在小鼠模型中对伪狂犬病毒引起的解剖病变的影响。实验选取4周龄雌性balb/c小鼠，通过腹腔注射的方式，以3000pfu/只的接毒剂量使小鼠感染prv jsy13毒株。并按照0.5mg/kg量对小鼠进行腹腔注射给药，每36小时给药一次，接毒后48小时后将小鼠放血处死，采集脑、肺脏、脾脏、肝脏等各脏器，观察病变情况。
31.图7为蟾毒灵对伪狂犬病毒攻毒小鼠死亡情况的影响。选取4周龄雌性balb/c小鼠，通过腹腔注射的方式，以3000pfu/只的接毒剂量使小鼠感染prv jsy13毒株。同时，按照0.5mg/kg量对小鼠进行腹腔注射给药，此后每36小时注射一次药物，同时设置阴性对照组(不接毒不加药)以及接毒不加药组。记录各组小鼠死亡情况，绘制死亡曲线。
具体实施方式
32.下面结合附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
33.缩写
34.伪狂犬病毒prv
35.试验材料
36.伪狂犬病毒jsy13毒株为发明人实验室所有；
37.pk15(猪肾细胞)和vero细胞(非洲绿猴肾细胞)保存于发明人实验室；
38.cck-8检测试剂盒购自美国apexbio公司；
39.实时定量pcr(real time pcr)aceqgreen master mix试剂盒购自诺唯赞公司；
40.引物订自金斯瑞公司；
41.蟾毒灵(bufalin)购于selleck公司。
42.实施例1
43.蟾毒灵在pk15细胞上细胞毒性的测定。
44.将pk15细胞铺在96孔板中(2
×
104个细胞/孔)，细胞过夜贴壁后，弃去细胞培养液，用含10％fbs的dmem稀释浓度为10、40、60、80μm的药物或dmso(dmso孔作为对照)，100μl/孔加入pk15细胞中，同一浓度做3个重复，在37℃和5％co2条件下，将孔板培养24小时；然后每孔加入10μlcck-8溶液(含有wst-8，它可以被线粒体中的一些脱氢酶还原形成橙色的formazan)，继续孵育4小时，在450nm处测量吸光度。根据cck-8试剂盒说明书对数据进行分析，最终得到蟾毒灵的细胞活性。结果如附图1所示，当蟾毒灵浓度为60μm时，细胞活性仍超过90％，说明当浓度低于60μm时，蟾毒灵在pk15细胞上不具有明显细胞毒性。
45.实施例2
46.利用cell-based elisa方法测定蟾毒灵对伪狂犬病毒的抑制效果。
47.将pk-15细胞以2
×
10 4
/孔的密度铺入96孔板中，在37℃、5％co2细胞培养箱中培养过夜，弃去培养液，用4％fbs dmem将药物稀释至0.002、0.008、0.016、0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1、2μm，100μl/孔加入孔板中，每个浓度设置3个重复孔，在37℃、5％co2条件下预处理细胞2小时；同时设置不加药阴性对照孔；用无血清dmem将prv jsy13稀释至0.15moi，100μl/孔加入孔板中，同时设置不接毒阳性对照孔，37℃、5％co2条件下感染24小时；蟾毒灵一直以相同浓度存在于相应孔中；弃去培养液，pbs轻柔润洗一遍，100μl/孔固定液(含4％多聚甲醛和0.1％triton x-100的pbs)，37℃固定30分钟，弃去固定液，200μl/孔glycine-pbs(含20mm glycine的pbs)润洗一遍，37℃条件下将细胞用3％脱脂奶封闭2小时；稀释抗prv-ul42蛋白的一抗，100μl/孔在37℃下孵育2小时，pbst润洗5次；稀释hrp标记的兔抗小鼠二抗，100μl/孔在37℃下孵育1小时，pbst润洗5次；使用tmb双组份显色液1：1混合后100μl/孔避光显色15分钟，以50μl/孔的量加入2m硫酸终止液终止显色，将孔板置于酶标仪上读取吸光度450nm的吸光值。将得到的od
450
进行分析，最终得到能够抑制50％的病毒所需要的浓度(ic
50
)。结果如图2所示，蟾毒灵的ic
50
为0.033μm，即0.033μm的蟾毒灵可抑制50％的伪狂犬病毒。
48.实施例3
49.western blot方法测定蟾毒灵在pk15细胞上抑制伪狂犬病毒感染的效果。
50.pk15细胞以-60％密度铺于6孔板，37℃、5％co2条件下培养至贴壁，弃去培养液，用含4％fbs的dmem将蟾毒灵分别稀释成0.015μm、0.03μm、0.06μm、0.12μm，1ml/孔预处理细胞2小时；用dmem将jsy13稀释至0.15moi，分别1ml/孔加入经过蟾毒灵预处理的细胞中，同时设置不加药也不接毒的阴性对照(mock)和不加药只接毒的阳性对照；24小时后弃去培养液，用pbs清洗一遍，根据病变情况，每孔细胞用不同体积的2
×
sds sample buffer，收取细胞作为蛋白质免疫印迹(western blot)的样品；样品煮沸10分钟后，吸取处理好的样品进行sds-page，并转移到pvdf膜上；在室温下用3％脱脂奶将膜封闭2小时，然后分别将膜用1:8000稀释的抗prv-ul42抗体和抗肌动蛋白(actin)的抗体在4℃下孵育一夜，tbst洗涤膜3次；分别加入对应的二抗4℃孵育4小时，tbst洗涤膜3次；使用高敏ecl化学发光试剂盒通过tanon5200系统对信号进行可视化。结果如附图3所示，显示当蟾毒灵浓度为0.12μm时能够显著抑制伪狂犬病毒的感染，并具有明显的剂量依赖性。
51.实施例4
52.间接免疫荧光测定蟾毒灵在pk15细胞上抑制prv感染的效果。
53.将无菌盖玻片放置于六孔板中，pk15细胞以50％-60％密度铺于盖玻片上，在37℃5％co2条件下培养至贴在盖玻片上。用4％fbs的dmem将蟾毒灵分别稀释成0.015、0.03、0.06、0.12μm，1ml/孔预处理细胞2小时。用dmem将jsy13稀释至0.15moi，分别1ml/孔加入经过蟾毒灵预处理的细胞中，同时设置不加药也不接毒的阴性对照(mock)和不加药只接毒的阳性对照。18小时后弃去培养液，用pbs轻柔清洗细胞一次，用固定液(含4％多聚甲醛和0.1％triton x-100的pbs)1ml/孔37℃固定30分钟。用glycine-pbs(含20mm glycine的pbs)润洗两遍，再用pbs润洗3遍；用3％bsa 1ml/孔37℃封闭30分钟，pbs润洗一遍，吸干净玻片周围的液体。1:500稀释抗prv-ul42蛋白一抗，100μl/孔，37℃孵育细胞1小时，回收一抗，pbs洗涤细胞三遍。1:500稀释fitc结合的抗小鼠igg二抗，100μl/孔，在37℃下孵育
30min，pbs洗涤细胞3遍。细胞核用dapi(含防荧光淬灭剂)在室温下避光染色。最后，用光导耦合照明荧光光源u-hglgps对细胞进行观察。结果如附图4所示，显示蟾毒灵浓度为0.12μm时能够显著抑制伪狂犬病毒的感染，并具有明显的剂量依赖性。
54.实施例5
55.噬斑形成试验测定蟾毒灵对伪狂犬病毒入胞阶段的抑制效果。
56.将pk15细胞按照每孔6x105个/孔铺于6孔板中，用pbs洗3遍，然后用无血清dmem将prv稀释至5moi，1ml/孔，置于4℃条件下作用1小时；pbs洗3遍细胞，用2％fbs的dmem将蟾毒灵稀释成5mm，1ml/孔加入到细胞中，设置不加药对照组(mock)，置于37℃培养箱培养1小时；细胞用ph＝3的柠檬酸钠洗3遍，再用pbs洗3次，然后加入1ml dmem收取细胞样品以病毒噬斑试验测定病毒滴度。结果如附图5所示，显示蟾毒灵可明显抑制伪狂犬病毒的入胞阶段。
57.实施例6
58.蟾毒灵在小鼠模型中对伪狂犬病毒引起的解剖病变的影响。
59.实验选取4周龄雌性balb/c小鼠，实验共分为3组，每组3只。通过腹腔注射的方式，以3000pfu/只的接毒剂量使小鼠感染prv jsy13毒株。随后，按照0.5mg/kg量对4周龄小鼠进行蟾毒灵腹腔注射给药，此后每36小时注射一次药物，同时设置阴性对照组(不接毒不加药)以及接毒不加药组。接毒后48小时后将小鼠放血处死，采集脑、肺脏、脾脏、肝脏等各脏器，拍照观察病变，其余小鼠继续观察。结果如图6，显示蟾毒灵处理组肺、脑等组织出血症状较攻毒组轻。
60.实施例7
61.蟾毒灵对伪狂犬病毒攻毒小鼠死亡情况的影响。
62.实验选取4周龄雌性balb/c小鼠，实验共分为3组，每组10只。通过腹腔注射的方式，以3000pfu/只的接毒剂量使小鼠感染prv jsy13毒株。随后，按照0.5mg/kg量对4周龄小鼠进行蟾毒灵腹腔注射给药，此后每36小时注射一次药物，同时设置阴性对照组(不接毒不加药)以及接毒不加药组。记录各组小鼠死亡情况，绘制死亡曲线。如图7生存曲线所示，攻毒组第3天的死亡率为10％，第4天的死亡率为80％，第6天全部死亡；蟾毒灵给药组第3天无小鼠死亡，第4天的死亡率为60％，第5天小鼠的死亡率为80％。实验结束时，蟾毒灵组有2只小鼠存活。上述结果表明，蟾毒灵在一定程度上可以提高伪狂犬病毒攻毒小鼠的生存率。
63.以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

技术特征：
1.蟾毒灵在制备抗伪狂犬病毒药物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蟾毒灵用于抑制动物伪狂犬病毒的感染。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述蟾毒灵浓度大于0.12μm。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蟾毒灵用于降低伪狂犬病毒感染后动物的死亡率。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述蟾毒灵的剂量为5mg/kg。6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蟾毒灵用于抑制伪狂犬病毒的入胞阶段。7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蟾毒灵用于降低伪狂犬病毒感染后动物的脏器出血。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述脏器包括肺和脑。9.一种抗伪狂犬病毒药物，包括蟾毒灵，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。10.根据权利要求9所述的抗伪狂犬病毒药物，其特征在于，所述抗伪狂犬病毒药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。

技术总结
本发明属于抗病毒药物制备领域，提供蟾毒灵在制备抗伪狂犬病毒药物中的用途；当蟾毒灵应用浓度为0.12μM时，可显著抑制伪狂犬病毒在PK15细胞上的增殖；当按照5mg/kg剂量注射BALB/c小鼠时，可提高伪狂犬病毒感染小鼠的存活率。蟾毒灵是从传统中药蟾酥中提取的中药单体，具有安全、毒副作用少、药物残留低且无污染等优势。等优势。等优势。


技术研发人员：薄宗义 曹永忠 朱进进 郭梦娇 张成成 张小荣 吴艳涛
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/13