黑番茄提取物在制备预防和治疗糖尿病脑病药物中的应用

1.本发明涉及新的药物用途领域，尤其涉及黑番茄提取物在制备预防和治疗糖尿病脑病药物中的应用。


背景技术：

2.糖尿病脑病是一种与糖尿病相关的中枢神经系统并发症，以认知行为缺陷为特点，临床上主要表现为认知功能障碍、决策障碍及情绪障碍等；病理上表现为颅内组织结构及功能的改变。血糖控制不佳、高血压、血脂异常、肥胖、吸烟等是认知功能障碍的危险因素。而一般情况下，糖尿病患者可同时合并血脂异常、高血压、肥胖等疾患。大脑灰质、白质和海马体的萎缩、突触可塑性的受损、神经胶质细胞功能障碍、脑血管结构及功能的变化是糖尿病脑病的病理特征主要表现。
3.黑番茄属于被子植物门双子叶植物纲茄目茄科番茄属，黑番茄中含有大量的多酚类物质(如黄酮类物质、花青素、没食子酸、绿原酸、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素、木犀草素和山柰酚等)、番茄红素、维生素c和维生素e等。
4.黑番茄提取物本身含有大量的抗氧化成分，但是目前尚未见到黑番茄提取物对糖尿病脑病有预防和改善作用的报道。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于建立小鼠糖尿病脑病模型，测量血糖值，并进行糖耐量试验和行为学试验(morris水迷宫测试、y迷宫测试、避暗试验)，检测黑番茄提取物是否可以预防和治疗糖尿病脑病，从而将其应用于治疗药物中。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.黑番茄提取物在制备预防和治疗糖尿病脑病药物中的应用。
8.进一步改进在于，所述黑番茄提取物具体为黑番茄冻干粉，制备过程包括以下步骤：
9.(1)将新鲜的黑番茄冷冻干燥以去除水分，然后经过粉碎、真空冷冻、脱水研磨，得到冻干粗品粉末；
10.(2)将所述冻干粗品粉末以及纤维素酶、盐酸-乙醇溶液和双蒸水混合、加热、超声处理、离心，上层滤液吸出，抽滤，收集粗滤液；粗滤液用ab-8大孔吸附树脂纯化、乙醇洗脱，得到纯化后的黑番茄提取液；后将其置入真空冷冻干燥机，获得黑番茄冻干粉。
11.进一步改进在于，所述预防和治疗糖尿病脑病具体体现在降低血糖值含量、降低口服葡萄糖耐量和改善学习和记忆能力。
12.进一步改进在于，将黑番茄提取物加入药学上可接受的辅料制成临床可用的药物剂型。
13.进一步改进在于，所述药物剂型为片剂、胶囊剂、锭剂、注射剂、混悬剂、栓型、软膏剂中的一种或多种。
14.进一步改进在于，所述辅料为载体或赋形剂。
15.进一步改进在于，所述赋形剂为碳微晶纤维素、淀粉、乳糖、交联聚维酮、羟丙基纤维素中的一种或多种。
16.进一步改进在于，所述载体为稀释剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
17.本发明的有益效果：
18.口服葡萄糖耐量和空腹血糖值本身是糖尿病脑病的判断标准；利用morris水迷宫设备，进行定位航行实验和空间探索实验，从而检测小鼠的学习记忆能力和空间学习能力；y迷宫试验可以测定小鼠的记忆保持能力；避暗反应试验可以应用于动物学习和记忆能力的测试。本发明通过口服葡萄糖耐量、小鼠血糖值的测定和一系列的小鼠行为实验，验证了黑番茄提取物有预防和治疗糖尿病脑病的作用，从而可以应用到相应的药物制备中。
附图说明
19.图1为小鼠空腹血糖含量各组数据柱形图；
20.图2为口服葡萄糖耐量试验各组数据折线图和柱形图；
21.图3为morris水迷宫试验定位数据柱形图；
22.图4为y迷宫试验数据柱形图；
23.图5为避暗试验数据柱形图。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行下一步的详细说明，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.1、材料
26.本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料如无特别说明均为市售购买产品。
27.本实施例所用黑番茄提取物具体为冻干粉，制备过程如下：
28.1、使用冷冻干燥技术，新鲜的黑番茄去除水分；随后，将其放入粉碎机，待充分粉碎后，再次放入真空冷冻干燥机，脱水研磨，得到冻干粗品粉末。
29.2、冻干粗品粉末按照800mg/g加入纤维素酶，并按照体积比1:1加入0.1m ol/l的盐酸-乙醇溶液，用双蒸水按照料液比1:12稀释，放入40℃水浴锅加热110min，超声处理15min，以4000r/min离心30min，将上层滤液吸出，置于抽滤机抽滤，收集粗滤液；采用ab-8大孔吸附树脂纯化，以50％乙醇洗脱，得到纯化后的黑番茄提取液；最后，将其置入真空冷冻干燥机，获得黑番茄冻干粉。
30.在作为药物使用时，可以将其制成所需要的药物剂型，比如，将黑番茄提取物-黑番茄冻干粉制备成片剂、胶囊剂、锭剂、注射剂、混悬剂、栓型、软膏剂等剂型的方法均为常规方法，所用的载体或赋形剂等材料，其中赋形剂为碳微晶纤维素、淀粉、乳糖、交联聚维酮、羟丙基纤维素；载体为稀释剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂，如无特别说明，均为市售购买产品。
31.2、方法
32.2.1建立糖尿病脑病小鼠模型
33.将雄性c57bl/6小鼠设置为空白组10只，造模组80只，造模组大鼠给予高糖高脂饲料(45％脂肪供能高脂饲料(对标d12451))喂养4周，造模前禁食12h，造模组腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph＝4.4)配制的链脲佐菌素(stz)50mg/kg，3d后，禁食不禁水12h，测血糖值，以空腹血糖值》11.1mmol/l作为糖尿病造模成功的标准。
34.将上述造模成功的小鼠按照血糖水平随机分为模型组(h2o，灌胃)、阳性药组(4mg/kg罗格列酮，灌胃)、黑番茄提取物低剂量组(150mg/kg，灌胃)、黑番茄提取物高剂量组(300mg/kg，灌胃)，每组10只小鼠，试验期间除空白组外，其余各组仍以高糖高脂饲料喂养。
35.2.2血糖测定
36.收集步骤2.1中各分组小鼠的血清，设置空白孔(加蒸馏水2.5μl)、标准孔(加标准品2.5μl)、样本孔(加样本2.5μl)，再于各孔中加入250μl工作液，轻轻振荡孔板，37℃孵育10min，波长505nm，酶标仪读数，最后，按照如下公式计算葡萄糖含量：
[0037][0038]
由附图1可知，对照组(附图中标记为control组，仅灌胃双蒸水)的小鼠空腹血糖值数值最低，约为6mmol/l；而其余各组通过向小鼠腹腔注射stz(一种诱发糖尿病的化学物质)，血糖值含量相较于对照组均不同程度上升；尤其是d m组，血糖值含量最高，为20mmol/l；而dm+rosi组通过灌胃一定剂量的罗格列酮(一种具有降血糖作用的药物)，使得血糖值含量下降，为7mmol/l。其余两组通过向小鼠灌胃一定剂量的黑番茄提取物，均获得了降低血糖的效果，且随着黑番茄提取物摄入量的增加，降低血糖的数值更多。dm+bte150组(灌胃150mg/kg黑番茄提取物)空腹血糖值约为14.5mmol/l、dm+bte300组(灌胃300mg/kg黑番茄提取物)空腹血糖值约为9.5mmol/l。
[0039]
2.3口服葡萄糖耐量试验
[0040]
步骤2.1中各分组小鼠禁食过夜，记录0min时的血糖，次日对小鼠灌胃2g/kg葡萄糖溶液，灌胃后第15、30、60、90和120min测定血糖值。
[0041]
根据附图2，在给予葡萄糖负荷后，各组小鼠表现出血糖先升高后下降，其中dm组小鼠表现出异常的口服糖耐量，表现为dm组小鼠的auc值(浓度-曲线下的面积)数值明显升高，约为78；对照组(仅灌胃双蒸水)的小鼠空腹糖耐量最低，auc值约为20；黑番茄提取物低、高剂量组均缓解了数值的升高，且随着黑番茄提取物摄入量的增加，缓解的效果更加明显。其中，灌胃150mg/kg黑番茄提取物的dm+bte150组auc数值约为70，灌胃300mg/kg黑番茄提取物的dm+bte300组auc数值约为60。
[0042]
2.4morris水迷宫试验
[0043]
morris水迷宫为直径120cm、高50cm的圆形水池，水温控制在22℃；将水池分为一、二、三、四共四个象限，在第四象限中央水下2cm处隐藏放置平台。
[0044]
每只小鼠每天进行4次测试，分别从四个象限面向水池池壁侧放入水中，让其寻找平台，限时60s，小鼠找到平台后，让其在平台上停留15s。超过60s无法寻找到平台者，则引导其上平台，停留15s。训练间歇期为15min，共训练7天。
[0045]
在第八天进行空间探索试验，移除平台，以第二象限为起点，将小鼠面对池壁放入
池中，记录其在60s内的游泳轨迹。
[0046]
如附图3所示，dm组小鼠在靶象限经过的时间占比明显减少，大约为22％；对照组小鼠在靶象限经过的时间占比最高，约为55％。而dm+rosi组通过灌胃一定剂量的罗格列酮(一种具有降血糖作用的药物)，使得该组小鼠在靶象限经过的时间占比接近对照组，约为50％。通过摄入一定剂量的黑番茄提取物，可以一定程度提高靶象限区间的时间占比，且随着黑番茄提取物摄入量的增加，提高程度越高。dm+bte150组小鼠在靶象限经过的时间占比约为37％、dm+bte 300组小鼠在靶象限经过的时间占比约为48％。
[0047]
2.5y迷宫试验
[0048]
y迷宫由三个(i、ii、iii)等长、互为120度角的臂组成辐射式迷路箱。臂长23cm，三个臂的顶端各装一盏15w的刺激信号灯，箱底铺设直径0.2cm、长14cm、间距1cm的电栅。控制面板有电压控制和延时控制旋钮，并有i、ii、iii、0四个按键；当分别按下i、ⅱ、iii键时，相应臂的信号灯亮，此时该臂不通电为安全区(亮灯区)，另外无灯光的两臂及交界区均通电而成为非安全区(电击区)。按下0键，则三臂均不通电。
[0049]
每次实验开始前将小鼠放入起步区适应3min，随后打开电源，观察其正确或错误反应，直到小鼠在训练过程中出现连续9次正确反应(即为学会)，记录小鼠学会所用的全部训练次数(小鼠的学习能力指标)。24h后进行记忆保持能力的检测，记忆保持能力为正确反应次数(9次)占总检测次数的百分比。
[0050]
由附图4可知，a附图为小鼠在训练过程中出现连续9次正确反应，小鼠所用的全部训练次数；b附图为出现连续9次正确反应占总检测次数的百分比。
[0051]
dm组小鼠出现连续9次正确反应所需总次数最高，约为30次，正确次数占总次数约为36％；dm+rosi组通过灌胃一定剂量的罗格列酮(一种具有降血糖作用的药物)，使得dm+rosi组小鼠出现连续9次正确反应所需总次数减少，约为20次，正确次数占总次数的百分比约为60％。通过向小鼠灌胃一定剂量的黑番茄提取物，均获得了减少总次数、提高正确次数百分比的效果；dm+bte150组小鼠出现连续9次正确反应所需总次数约为22次，正确次数占总次数约为58％；d m+bte300组小鼠出现连续9次正确反应所需总次数约为21次，正确次数占总次数约为59％。
[0052]
2.6避暗反应测试
[0053]
实验装置(jd-500型小鼠避暗仪来自于上海继德教学实验器械厂)分为明、暗两室；实验前，先开启明暗两室之间的通道，将小鼠放入明室，让其自由在明暗两室内活动，持续5min；正式测试开始时将鼠被放入明室，待其进入暗室后马上把明暗两室的门关闭，同时给予足部电击5s，之后立即将小鼠从暗室拿出。24h后，暗室电流刺激关闭，再次将小鼠放入明室，开启明暗两室间的通道，记录小鼠从明室进入暗室的时间，即为潜伏期；试验持续两天。
[0054]
由附图5可知，dm组的小鼠从明室进入暗室的潜伏期明显降低，约为70s；而黑番茄提取物可以增加潜伏期；随着黑番茄提取物摄入量的增加，潜伏期时间也在不断增加。dm+bte150组潜伏期约为120s、dm+bte300组潜伏期约为130s。
[0055]
通过一系列的小鼠试验及分析数据可知，黑番茄提取物具有降血糖药物相似的作用，具体表现为能够降低血糖数值、降低空腹糖耐量、提高记忆保持能力。但是，相较于人工药物，黑番茄提取物的安全性高，将其用于开发预防和治疗糖尿病脑病的药物，副作用会明
显减少。
[0056]
最后注明：以上实验数据均采用“平均值
±
标准差”表示，多组样本均数间比较应用单因素方差分析(one-wayanova检验)，以p《0.05、p《0.01和p《0.001为差异，有统计学意义。
[0057]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.黑番茄提取物在制备预防和治疗糖尿病脑病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黑番茄提取物具体为黑番茄冻干粉，制备过程包括以下步骤：(1)将新鲜的黑番茄冷冻干燥以去除水分，然后经过粉碎、真空冷冻、脱水研磨，得到冻干粗品粉末；(2)将所述冻干粗品粉末以及纤维素酶、盐酸-乙醇溶液和双蒸水混合、加热、超声处理、离心，上层滤液吸出，抽滤，收集粗滤液；粗滤液用ab-8大孔吸附树脂纯化、乙醇洗脱，得到纯化后的黑番茄提取液；后将其置入真空冷冻干燥机，获得黑番茄冻干粉。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和治疗糖尿病脑病具体体现在降低血糖值含量、降低口服葡萄糖耐量和改善学习和记忆能力。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将黑番茄提取物加入药学上可接受的辅料制成临床可用的药物剂型。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物剂型为片剂、胶囊剂、锭剂、注射剂、混悬剂、栓型、软膏剂中的一种或多种。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述辅料为载体或赋形剂。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述赋形剂为碳微晶纤维素、淀粉、乳糖、交联聚维酮、羟丙基纤维素中的一种或多种。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述载体为稀释剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。

技术总结
本发明属于药物领域，涉及黑番茄提取物新的药物用途。本发明首先制备黑番茄提取物，后对小鼠进行糖尿病造模和分组，对小鼠进行血糖测定、口服葡萄糖耐量试验、Morris水迷宫试验、Y迷宫试验和避暗反应测试，通过对获取的试验数据进行检测分析，发现黑番茄提取物具有降低血糖数值和口服葡萄糖耐量的作用，进而提高小鼠学习记忆能力、空间学习能力和记忆保持能力。可以将黑番茄提取物应用于预防和治疗糖尿病脑病的药物中。病脑病的药物中。病脑病的药物中。


技术研发人员：薛劲松 肖青青 顾泉 姜苏薇 王晓飞 李丹
受保护的技术使用者：合肥学院
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/8/13