一种荧光生物传感器及其制备方法和在重金属检测中的应用

1.本发明涉及重金属离子检测的技术领域，特别是涉及一种荧光生物传感器及其制备方法和在重金属检测中的应用。


背景技术：

2.金属纳米簇是由几个到几十个原子与模板分子构成的一种新型荧光纳米材料，粒子半径通常在1-3nm之间，由于其超小的尺寸、固有的磁性、催化活性高、发光性能强等优势，在生物传感、生物成像、医学诊断和治疗、化学催化等领域有广阔的应用前景。目前，用于金属纳米簇制备的典型模板分子有蛋白质、聚合物、dna、小分子物质，这些模板分子一般起到稳定金属纳米簇的支架作用，组成上通常包括富电子原子或某些官能团，以便与金属核形成稳定的化学键，从而可以控制金属纳米簇的大小、分散性以及形态，赋予金属纳米簇独特的功能或特定的结构。其中，具有不同氨基酸序列和空间构象的蛋白质作为稳定剂和还原剂为合成具有不同尺寸和荧光发射的金属纳米簇提供了一种便捷而有效的途径。而木瓜蛋白酶(papain)是一种主要来源于番木瓜青果乳汁中的巯基蛋白酶，由212个氨基酸组成，其中包括了6个半胱氨酸，可形成三对二硫键，二硫键的存在赋予了papain较高的热稳定性、酸碱稳定性和去垢剂抗性，可高效的水解多肽和蛋白，在食品、化工、轻纺工业领域都得到充分利用。
3.在目前的环境治理领域中，重金属污染涉及面广、危害大，对环境中重金属的监测和治理成为一大难题。汞污染作为重金属污染中具有代表性的一种，其来源有：汞电解法生产烧碱、含汞矿石和金矿的开采冶炼、燃煤、医院、电池制造、仪器仪表生产、垃圾焚烧、氯碱工业等生产行业或部门。它们通过排放废水、废渣、废气等方式将汞及其化合物排放到自然环境中，造成周边地区空气、水体、土壤、植物等的污染。汞在自然界中一般以金属汞、无机汞盐(hg
2+
)、有机汞三种形式存在，其中hg
2+
是最稳定和最危险的形式，水溶性高，对人体危害性大，在临床上可导致高血压、冠心病等心血管疾病。而现阶段常用的hg
2+
检测方法，原子吸收光谱、高效液相色谱法、电化学检测等，通常需要复杂昂贵的设备、严格的样品预处理、繁琐耗时的检测程序，因此，怎样高效、快速、便捷的检测hg
2+
是目前亟待解决的一大难题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了一种荧光生物传感器及其制备方法和在重金属检测中的应用，用于快速、便捷、无毒、廉价、有选择性的检测环境中的hg
2+
。
5.本发明提出的一种荧光生物传感器及其制备方法和在重金属检测中的应用，采用如下技术方案：
6.s1：将papain溶液与ni
2+
溶液混合，得到混合溶液；
7.s2：向所述混合溶液中加入碱性溶液修饰后，恒温振荡，反应得到papain-ni ncs溶液；
8.其中，所述混合溶液中papain与ni
2+
的摩尔比为(9-20)：1。
9.优选的，所述碱性溶液为naoh溶液。
10.优选的，所述papain溶液的浓度为45-65mg/ml，所述ni
2+
溶液为15-45mmol/l。
11.优选的，还包括：将所述papain溶液与所述ni
2+
溶液混合后与加入碱性物质修饰后分别进行振荡，振荡的时间为4-30min。
12.优选的，s2中所述恒温振荡为在25℃-65℃条件下恒温振荡8-16h。
13.优选的，s2中所述恒温振荡后，还包括：依次离心、取上层清液与透析；所述离心速度为6000-8000rpm下离心3-10min；所述透析后得到所述papain-ni ncs溶液。
14.此外，本发明还提供了一种由上述方法制备得到的荧光生物传感器。
15.另外，本发明还提供了一种由上述方法制备得到的荧光生物传感器在hg
2+
的可视化检测中的应用。
16.本发明公开了一种荧光生物传感器及其制备方法和在重金属检测中的应用，与现有技术相比，其有益效果在于：
17.本发明的荧光生物传感器papain-ni ncs可用于hg
2+
浓度检测；本发明的papain-ni ncs制备方法简单、水溶性好、可特异性被hg
2+
荧光猝灭，并且通过papain-ni ncs荧光强度与hg
2+
浓度的线性变化，快速、准确、灵敏地检测hg
2+
的浓度；本发明的纳米粒子安全性高，适合规模化生产，极大程度的解决环境中hg
2+
污染检测程序复杂，检测成本高的问题。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
19.图1为实施例1-5的papain-ni ncs溶液的时间优化图；
20.图2为实施例6-10的papain-ni ncs溶液的ph优化图；
21.图3为实施例11的papain-ni ncs溶液的激发-发射荧光光谱图；
22.图4为实施例12的papain-ni ncs溶液的紫外-可见吸收光谱图；
23.图5为实施例13的papain-ni ncs溶液的红外光谱图；
24.图6为实施例14的papain-ni ncs溶液应用于金属离子的选择性检测的柱状图；
25.图7为实施例14的papain-ni ncs溶液应用于金属离子的选择性检测的可视化检测图；
26.图8为实施例15的papain-ni ncs溶液应用于检测hg
2+
的散点图；
27.图9为实施例15的papain-ni ncs溶液应用于检测hg
2+
的线性关系图(12.5-125μm)；
28.图10为实施例15的papain-ni ncs溶液应用于检测hg
2+
的线性关系图(250-2000μm)；
29.图11为实施例16的papain-ni ncs溶液应用于检测不同浓度hg
2+
的荧光光谱图；
30.图12为实施例16的papain-ni ncs溶液应用于检测不同浓度hg
2+
的可视化检测图。
具体实施方式
31.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.本发明实施例的荧光生物传感器papain-ni ncs可用于hg
2+
浓度检测；同时，papain-ni ncs制备方法简单、水溶性好、可特异性被hg
2+
荧光猝灭，并且通过papain-ni ncs荧光强度与hg
2+
浓度的线性变化，快速、准确、灵敏地检测hg
2+
的浓度；另外，本发明的纳米粒子安全性高，适合规模化生产，在检测环境中hg
2+
污染的应用中更具优势。
33.本发明实施例提供了一种荧光生物传感器制备方法，包括以下步骤：
34.s1：将papain溶液与ni
2+
溶液以各自的溶质papain与ni
2+
的摩尔比为(9-20)：1的比例混合，振荡4-30min，得到混合溶液；其中papain溶液的浓度为45-65mg/ml，ni
2+
溶液为15-45mmol/l；其中，papain溶液的配制：取papain粉末加之至蒸馏水中溶解，制备成papain溶液；ni
2+
溶液的配制：溶解nicl2·
6h2o，制备成ni
2+
溶液；
35.s2：向所述混合溶液中加入naoh溶液修饰后，振荡4-30min，继续在25℃-65℃条件下恒温振荡8-16h，并在6000-8000rpm下离心3-10min、取上层清液透析，得到papain-ni ncs溶液。
36.papain-ni ncs溶液在365nm紫外灯照射下发出强烈绿色荧光，其最大激发波长为370nm，最大发射波长为487nm。
37.另外，本发明实施例还提供了一种由上述方法制备得到的荧光生物传感器在hg
2+
的可视化检测中的应用，检测方法具体为：
38.1.制定标准曲线：
39.将制得的papain-ni ncs溶液与浓度为0-200μm的hg
2+
溶液混合，采用荧光分光光度计分别检测并记录各混合溶液的荧光强度，绘制各混合溶液的相对荧光强度值与其对应的不同浓度的hg
2+
溶液之间的标准曲线；
40.2.对实际样品中的hg
2+
浓度进行检测：
41.将papain-ni ncs溶液和预处理后的样品(土样、水样)混合，检测加入待测样品后的溶液的荧光强度，将数值代入上述标准曲线计算即可得到待测样品中的hg
2+
浓度。
42.上述检测方法可用于检测hg
2+
的线性范围为1μm-150μm，其检测限为0.4μm。
43.以下将结合实施例对本发明的荧光生物传感器进行解释说明：
44.实施例1
45.本实例提供一种papain-nincs溶液，具体步骤为：
46.(1)制备50mg/ml的papain水溶液、25mm的ni
2+
溶液：取papain水溶液475μl，加入25μl的ni
2+
溶液，旋涡振荡仪充分振荡5min，得到混合溶液，混合溶液中papain与ni
2+
的摩尔比为10.5：1；
47.(2)向步骤(1)得到的混合溶液中逐滴加入浓度为1m的naoh溶液，调节混合溶液ph＝13，漩涡振荡仪再次振荡混匀5min；
48.(3)将步骤(2)得到的混合溶液置于37℃、转速为150rpm的摇床中恒温、避光反应14h；
49.(4)反应结束后，在转速为8000rpm的离心机中进行离心5min，取上清液透析后即得papain-ni ncs，将该溶液置于4℃冰箱保存备用。
50.实施例2
51.本实施例与实施例1基本相同，其区别仅在于：步骤(3)中反应时间为12h，其余条件均不变。
52.实施例3
53.本实施例与实施例1基本相同，其区别仅在于：步骤(3)中反应时间为10h，其余条件均不变。
54.实施例4
55.本实施例与实施例1基本相同，其区别仅在于：步骤(3)中反应时间为8h，其余条件均不变。
56.实施例5
57.本实施例与实施例1基本相同，其区别仅在于：步骤(3)中反应时间为16h，其余条件均不变。
58.综上，实施例1-5的papain-ni ncs溶液的时间优化图，如图1所示，其中x轴为波长(nm)，y轴为荧光强度(a.u.)。由图1可知：当步骤(3)中的反应时间为8-14h时，papain-ni ncs溶液的荧光强度随反应时间的增加而增强，但当反应时间大于14h后出现拐点，例如，实施例5的反应时间为16h，但荧光强度却低于反应时间为14h的实施例1，继续增加反应时间只会增加时间成本与经济成本。
59.实施例6
60.本实施例与实施例1基本相同，其区别仅在于：调整步骤(2)中ph＝12，其余条件均不变。
61.实施例7
62.本实施例与实施例1基本相同，其区别仅在于：调整步骤(2)中ph＝11，其余条件均不变。实施例6
63.实施例8
64.本实施例与实施例1基本相同，其区别仅在于：调整步骤(2)中ph＝9.5，其余条件均不变。实施例6
65.实施例9
66.本实施例与实施例1基本相同，其区别仅在于：调整步骤(2)中ph＝8.5，其余条件均不变。实施例6
67.实施例10
68.本实施例与实施例1基本相同，其区别仅在于：调整步骤(2)中ph＝8，其余条件均不变。
69.综上，实施例6-10的papain-ni ncs溶液的ph优化图，如图2所示，其中x轴为波长(nm)，y轴为荧光强度(a.u.)。由图2可知：随着ph的增加，荧光强度总体为上升趋势，但当ph≥11后，荧光强度随ph增强的增长率大幅度降低，另外，随着ph的增大，荧光强度最高峰向长波长方向位移。
70.实施例11
71.papain-ni ncs溶液与papain荧光光谱的表征：
72.取实施例1制得的papain溶液和papain-ni ncs溶液各200μl于微量石英比色皿中，使用暗箱式四用紫外分析仪分别观察它们的荧光特性。结果表明，在365nm紫外灯照射下，实施例1制得的papain溶液无荧光，而papain-ni ncs发出强烈的绿色荧光；
73.取实施例1制得papain-ni ncs溶液200μl于微量石英比色皿中，在荧光分光光度计下得到其荧光激发-发射光图谱如图3所示，其中ex为激发波长，em为发射波长，papain-ni ncs的最大激发波长在370nm处，最大发射波长在487nm处。
74.由图3可知，在365nm紫外灯照射下发出强烈绿色荧光，其最大激发波长为370nm，最大发射波长为487nm。
75.实施例12
76.papain-ni ncs、papain紫外-吸收光谱的表征：
77.分别取实施例1制得的papain溶液、实施例1所制的papain-ni ncs溶液放入微量石英比色皿中，使用紫外分光光度仪uv-1700检测紫外光谱，结果如图4所示。
78.由图4可知，本实施例1所制得的papain-ni ncs在300-350nm范围内具有较宽的吸收光谱，而相同浓度的papain溶液在此处没有最大吸收，可证明实施例1所制的papain-nincs与papain本身至少不是同一种物质。
79.实施例13
80.papain-ni ncs、papain红外光谱的表征：
81.取实施例1制得papain-ni ncs干燥后粉末、papain粉末与溴化钾按1：100混合后充分研磨，使用傅里叶变换红外光谱仪检测其红外光谱，结果如图5所示，y轴为透射率。
82.由图5可知，papain与所制的papain-ni ncs在500-1500cm-1
之间有明显不同，可证明实施例1所制的papain-nincs与papain本身至少不是同一种物质。
83.实施例14
84.papain-ni ncs对不同离子的选择性实验：
85.本实施例中进行了不同测试离子对所制的papain-ni ncs的荧光淬灭实验，以检测papain-ni ncs对金属离子的检测是否具有选择性，从而判断在实际检测中是否会对papain-ni ncs进行hg
2+
检测产生干扰。
86.具体步骤如下：
87.配制浓度均为10mm的al
3+
、la
2+
、li
+
、ba
2+
、bi
3+
、ca
2+
、na
+
、k
+
、hg
2+
溶液；取20μl实施例1制得的papain-ni ncs溶液，分别加入体积为20μl的上述离子溶液，加入超纯水最终配制成体积为200μl的数份待检测溶液，在370nm激发光条件下，测试并记录每份待检测溶液在487nm处的荧光强度；
88.将papain-ni ncs溶液，加入相同体积的超纯水，加入超纯水补足至200μl待检测液后，重复上述步骤再次检测，记录荧光强度，另外，将上述混合后溶液置于暗箱四用分析仪中，可发现hg
2+
组中荧光发生淬灭，而其他组中荧光强度无明显区别；其结果如图6所示，其中x轴为金属离子种类，y轴为相对荧光值，blank为不添加金属离子的papain-nincs溶液空白组；图7为金属离子的选择性检测的可视化检测图。
89.由图6、7可知，除hg
2+
的相对荧光值为0，其余金属离子与空白组的相对荧光值基本相同，因此，本发明的papain-ni ncs具有较强的选择性，对hg
2+
检测的专一性较高，在实际
应用中可信度高。
90.实施例15
91.本实施例提供一种以papain-ni ncs为荧光生物传感器检测hg
2+
的方法：
92.具体步骤如下：
93.向实施例1制得的papain-ni ncs体系中加入一系列不同浓度的hg
2+
溶液，检测标准体系为200μl，其中不同浓度hg
2+
溶液20μl，papain-ni ncs溶液20μl，加超纯水补足至200μl，25℃水浴5min后，使用rf-5301荧光分光光度计，在激发光波长为370nm的条件下，检测溶液在487nm的发射光的峰值。如图8所示，papain-ni ncs荧光强度随hg
2+
浓度的增大而减弱；如图9、10所示，其相对荧光强度线性检测关系，所构建的检测hg
2+
的线性范围为1μm-150μm，其检测限为0.4μm。结果表明，所制备的papain-ni ncs对hg
2+
具有高度灵敏性。
94.实施例16
95.实施例1所制的papain-ni ncs对hg
2+
的可视化检测：
96.将实施例1中制得的papain-ni ncs溶液与浓度为2000μm、1000μm、600μm、500μm、250μm、200μm、125μm、100μm、60μm、30μm、25μm、12.5μm的hg
2+
标准溶液混合，加水补足至200μl，使用暗箱四用分析仪观察它们的荧光强度，如图11、12所示，结果显示其荧光强度随着hg
2+
浓度升高而降低，表明该荧光生物传感器在重金属的可视化检测中具有优良的应用潜力。
97.实施例17
98.实施例1所制papain-ni ncs对实际环境样品的检测：
99.本实施例提供一种实施例1中制得的荧光生物传感器的应用，其用于检测实际环境中hg
2+
的浓度。
100.为了验证该方法在实际样品中的可行性，证实papain-ni ncs作为探针检测hg
2+
的实用性，下面将其应用到长江水(芜湖段)、镜湖水、自来水(安徽省某地区)、赭山土中进行检测。长江水、镜湖水、自来水、赭山土取样后过滤得上清液，将上清液经8000rpm离心5min，再通过0.45mm膜滤器处理后，制得四种实际样品供实验使用，结果如表1所示。
101.表1
[0102][0103]
由上表可知，上述检测地区就汞含量上而言，环境较为良好。
[0104]
综上，本发明选用具还原能力的木瓜蛋白酶作为保护剂和还原剂，具氧化能力的ni
2+
作金属核，通过温和条件下生成荧光生物传感器；该探针具明显的绿色荧光，hg
2+
通过使其荧光快速猝灭的方式实现其可视化检测，检测限低至0.4μmol/l。
[0105]
术语“包括”或者任何其它类似用语旨在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备/装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其它要素，或者还包括这些过程、方法、物品或者设备/装置所固有的要素。
[0106]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
[0107]
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征作出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：s1：将papain溶液与ni
2+
溶液混合，得到混合溶液；s2：向所述混合溶液中加入碱性溶液修饰后，恒温振荡，反应得到papain-nincs溶液；其中，所述混合溶液中papain与ni
2+
的摩尔比为(9-20)：1。2.根据权利要求1所述荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液为naoh溶液。3.根据权利要求1所述荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述papain溶液的浓度为45-65mg/ml，所述ni
2+
溶液为15-45mmol/l。4.根据权利要求1所述荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，还包括：将所述papain溶液与所述ni
2+
溶液混合后与加入碱性物质修饰后分别进行振荡，振荡的时间为4-30min。5.根据权利要求1所述荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，s2中所述恒温振荡为在25℃-65℃条件下恒温振荡8-16h。6.根据权利要求1所述荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，s2中所述恒温振荡后，还包括：依次离心、取上层清液与透析；所述离心为6000-8000rpm下离心3-10min；所述透析后得到所述papain-ni ncs溶液。7.一种荧光生物传感器，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的方法制备得到。8.一种荧光生物传感器，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的方法制备得到，其应用于hg
2+
的可视化检测。

技术总结
本发明涉及重金属离子检测技术领域，公开了一种荧光生物传感器的制备方法，包括：S1：将Papain溶液与Ni


技术研发人员：王宝娟 曹毅 张梨梨 成慧丽 陈绍兴 陈菁菁 程雨洁 张勇
受保护的技术使用者：安徽师范大学
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/8/13