利用CD3254激活RNA外切体驱动体细胞重建多能性

利用cd3254激活rna外切体驱动体细胞重建多能性
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及利用cd3254激活rna外切体驱动体细胞重建多能性。


背景技术：

2.诱导多能干细胞具备类似于胚胎干细胞的无限自我更新能力和多胚层分化潜能，被广泛应用于疾病建模、药物开发和再生医学。目前，获得诱导多能干细胞主要有2种方式：转录因子重编程和化学重编程。
3.转录因子重编程主要借助转基因方法，外源性转录因子整合到起始细胞基因组中，将会引发安全隐患。相比于转录因子重编程，化学重编程具有独特的优势。
4.化学重编程主要借助小分子组合，小分子不会整合到体细胞基因组，安全性更高。其次，小分子容易穿透细胞膜，处理可逆，处理时间与剂量易控制，小分子可以任意组合，成本更低。
5.最后，一直以来，小分子被用于治疗人类疾病。因此，小分子化学重编程可能更容易被接受应用于临床治疗。目前，细胞化学重编程存在效率低、机制不清晰等问题，严重阻碍了其应用。化学重编程发展至今，仍然是一个缓慢而且低效的过程，分3个阶段，需要将近40天。
6.因此希望找到新的小分子，实现快速有效的化学重编程。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种通过小分子调节实现快速有效的化学重编程的方法。
8.在本发明的第一方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分包含rxra激活剂的试剂，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于：
9.激活rna外切体复合物；
10.促进sall4基因表达；
11.促进细胞重编程；
12.促进诱导多能干细胞的多能标志物表达；和/或
13.治疗或降低炎症反应。
14.在另一优选例中，所述促进细胞重编程为显著提高细胞化学重编程的效率。
15.在另一优选例中，所述rna外切体复合物包括11个亚基：exosc1、exosc2、exosc3、exosc4、exosc5、exosc6、exosc7、exosc8、exosc9、exosc10和dis3。
16.在另一优选例中，所述激活rna外切体复合物包括促进exosc1、exosc2、exosc3、exosc4、exosc5、exosc6、exosc7、exosc8、exosc9、exosc10和dis3的基因或蛋白的表达；较佳地包括促进exosc3，exosc7，exosc8和dis3的基因或蛋白的表达。
17.在另一优选例中，所述激活rna外切体复合物包括：
18.促进exosc3基因或蛋白的表达或活性提高≥2倍，较佳地≥4倍；
19.促进exosc7基因或蛋白的表达或活性提高≥1倍，较佳地≥3倍；
20.促进exosc8基因或蛋白的表达或活性提高≥1倍，较佳地≥3倍；和/或
21.促进exosc8基因或蛋白的表达或活性提高≥1倍，较佳地≥3倍。
22.在另一优选例中，所述激活rna外切体复合物包括：促进转座子rnas(如mmvl30)的降解。
23.在另一优选例中，所述rxra激活剂为cd3254或cd3254样化合物。
24.在另一优选例中，所述活性成分还包括：
25.(i)hdac抑制剂；
26.(ii)gsk-3α/β抑制剂；
27.(iii)tgf-β-ri/alk5抑制剂；
28.(iv)腺苷酸环化酶激活剂；
29.(v)rarα激动剂。
30.在另一优选例中，所述激活剂是指能够在体内或体外提高rxra基因或其蛋白的活性和/或含量的物质；所述物质可以为人工合成的或天然的化合物、蛋白、核苷酸等。
31.在另一优选例中，所述rxra激活剂包括激活rxra表达的物质。
32.在另一优选例中，所述rxra激活剂包括rxra蛋白激活剂和/或rxra基因激活剂。
33.在另一优选例中，所述促进sall4基因表达指将sall4基因或蛋白的表达或活性提高≥1倍，较佳地≥2倍，更佳地≥5倍。
34.在另一优选例中，所述诱导多能干细胞的多能标志物包括oct4、sox2或nanog基因。
35.在另一优选例中，所述促进诱导多能干细胞的多能标志物表达包括：
36.促进oct4基因或蛋白的表达或活性提高≥2倍，较佳地≥4倍；
37.促进sox2基因或蛋白的表达或活性提高≥1倍，较佳地≥2倍；和/或
38.促进nanog基因或蛋白的表达或活性提高≥1倍，较佳地≥3倍。
39.在另一优选例中，所述促进oct4、sox2或nanog基因表达指将sall4基因或蛋白的表达或活性提高≥1倍，较佳地≥2倍，更佳地≥5倍。
40.在另一优选例中，所述hdac抑制剂为vpa(valproic acid)。
41.在另一优选例中，所述gsk-3α/β抑制剂为chir99021。
42.在另一优选例中，所述tgf-β-ri/alk5抑制剂为repsox(616452)。
43.在另一优选例中，所述腺苷酸环化酶激活剂为forskolin。
44.在另一优选例中，所述rarα激动剂为am580。
45.在另一优选例中，所述包含rxra激活剂的试剂组合用于：
46.上调早期多能基因(例如，sall4，lin28a，esrrb，klf4，cmyc)和上皮基因(例如，cdh1，cldn4，tjp3)；和/或
47.下调间充质基因(例如，zeb1，twist1，snail1)。
48.在另一优选例中，所述包含rxr激活剂和/或rxr拮抗剂的试剂组合用于：
49.上调干细胞群维持，染色质组织，rna代谢过程和dna复制；
50.下调的胞外基质，上皮到间充质的过渡，tgf-β和mapk信号通路。
51.在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物非多能细胞。
52.在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
53.在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
54.在另一优选例中，所述炎症为ifn-γ-或tnf-α介导的炎症；包括由双链dna引起的ifn-γ的分泌，激活ifngr受体以及下游的jak-stat信号通路，激活炎症反应；以及促进tnf-α的分泌，激活tnfr1受体和下游ikk-nfkb信号通路，激活炎症反应。
55.在本发明的第二方面，提供了一种筛选促进哺乳动物非多能细胞形成诱导多能干细胞(ipsc)的潜在化合物的方法，所述方法包括：
56.(a)提供测试组和空白对照组，将加入测试物的培养体系作为测试组，在测试物存在的情况下，培养非多能细胞；
57.将不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组，在不添加该测试物的情况下，培养非多能细胞，空白对照组与测试组其他的条件相同；
58.(b)检测测试组、空白对照组中转座子rna的降解情况，其中测试组的转座子rna的表达量记为c1，空白对照组的转座子rna的表达量记为c0；和
59.(c)比较测试组和空白对照组的转座子rna降解水平，如果测试组的转座子rna的表达量显著低于空白对照组的转座子rna的表达量；则提示所述化合物为能够促进哺乳动物非多能细胞形成诱导多能干细胞(ipsc)的潜在化合物。
60.在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
61.在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
62.在另一优选例中，所述起始细胞为胚胎成纤维细胞(mefs)。
63.在另一优选例中，所述“显著低于”指在测试组中转座子rna的表达量c1与空白对照组rna的表达量c0之比(c1/c0)≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/4。
64.在另一优选例中，所述转座子rna为vl30 erv1家族；较佳地为mmvl30。
65.在另一优选例中，所述促进哺乳动物非多能细胞向诱导多能干细胞转化的化合物为rxrα特异性激动剂。
66.在另一优选例中，所述rxrα特异性激动剂为cd3452或cd3452样化合物。
67.在另一优选例中，所述cd3452样化合物能够促进转座子mmvl30降解。
68.在另一优选例中，(a)中，还包括阳性对照组，阳性对照组和所述测试组的实验条件相同，其中在阳性对照品cd3452存在下，检测转座子rna的表达量记为c2；
69.如果测试组的转座子rna的表达量c1和表达量c2之比(c1/c2)越小，则提示所述待筛选的物质对转座子rna的降解作用越大。
70.在另一优选例中，所述方法还包括(d)，将筛选到的化合物与选自下组的化合物组合进行测试实验，测试所述筛选到的化合物对转座子rna的降解水平：
71.(i)hdac抑制剂；
72.(ii)gsk-3α/β抑制剂；
73.(iii)tgf-β-ri/alk5抑制剂；
74.(iv)腺苷酸环化酶激活剂；和
75.(v)rarα激动剂。
76.在本发明的第三方面，提供了一种筛选促进哺乳动物非多能细胞中sall4基因上调的化合物的方法，所述方法包括：
77.(a)提供测试组和空白对照组，将加入测试物的培养体系作为测试组，在测试物存在的情况下，培养非多能细胞；
78.将不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组，在不添加该测试物的情况下，培养非多能细胞，空白对照组与测试组其他的条件相同；
79.(b)检测测试组、空白对照组中转座子rna的降解情况，其中测试组的转座子rna的表达量记为c1，空白对照组的转座子rna的表达量记为c0；和
80.(c)比较测试组和空白对照组的转座子rna降解水平，如果测试组的转座子rna的表达量显著低于空白对照组的转座子rna的表达量；则提示所述化合物为能够促进哺乳动物非多能细胞中sall4基因上调的潜在化合物。
81.在另一优选例中，所述转座子rna为vl30 erv1家族；较佳地为mmvl30。
82.在另一优选例中，所述促进哺乳动物非多能细胞中sall4基因上调的化合物为rxrα特异性激动剂。
83.在另一优选例中，所述rxrα特异性激动剂为cd3452或cd3452样化合物。
84.在本发明的第四方面，提供了用本发明的第二方面的筛选方法获得的具有cd3254活性的化合物。
85.在本发明的第五方面，提供了一种由哺乳动物非多能细胞培养诱导多能干细胞的方法，在细胞适合生长的条件和rxra激活剂存在下，培养哺乳动物非多能细胞，获得诱导的多能干细胞。
86.在另一优选例中，所述培养体系还包括选自下组的一种或多种试剂：
87.(i)hdac抑制剂；
88.(ii)gsk-3α/β抑制剂；
89.(iii)tgf-β-ri/alk5抑制剂；
90.(iv)腺苷酸环化酶激活剂；和
91.(v)rarα激动剂。
92.在另一优选例中，所述方法包括：
93.(s1)提供一起始细胞，使所述细胞与第一培养基接触，培养时间d1；获得第一诱导多能干细胞；
94.所述第一培养基包含第一试剂组合，所述试剂组合包括：rxra激活剂，和选自下述的一种或多种试剂：
95.(i)hdac抑制剂；
96.(ii)gsk-3α/β抑制剂；
97.(iii)tgf-β-ri/alk5抑制剂；
98.(iv)腺苷酸环化酶激活剂；和
99.(v)rarα激动剂。
100.在另一优选例中，所述培养时间d1为10-20天；较佳地为12-15天。
101.在另一优选例中，所述hdac抑制剂为vpa(valproic acid)。
102.在另一优选例中，所述gsk-3α/β抑制剂为chir99021。
103.在另一优选例中，所述tgf-β-ri/alk5抑制剂为repsox(616452)。
104.在另一优选例中，所述腺苷酸环化酶激活剂为forskolin。
105.在另一优选例中，所述rarα激动剂为am580。
106.在另一优选例中，所述rxra激活剂为cd3254，结构如下所示：
[0107][0108]
在另一优选例中，所述起始细胞的数量为3
×
10
5-4
×
105/plate。
[0109]
在另一优选例中，所述cd3254的浓度为0.1-1mm；较佳地为0.25-0.75mm。
[0110]
在另一优选例中，所述vpa(valproic acid)的浓度为0.1-1mm；较佳地为0.25-0.75mm。
[0111]
在另一优选例中，所述chir99021的浓度为5-30μm；较佳地为10-15μm。
[0112]
在另一优选例中，所述repsox的浓度为5-30μm；较佳地为10-15μm。
[0113]
在另一优选例中，所述forskolin的浓度为1-50μm；较佳地为5-20μm。
[0114]
在另一优选例中，所述am580的浓度为0.1-1mm；较佳地为0.25-0.75mm。
[0115]
在另一优选例中，所述第一诱导多能干细胞诱导的多能干细胞表达选自下组的早期多能基因标志物，包括sall4，cdh1，epcam和lin28a；较佳地为sall4。
[0116]
在另一优选例中，所述第一诱导多能干细胞中：
[0117]
20％-60％的细胞表达早期多能基因标志物sall4。
[0118]
在另一优选例中，所述方法还包括：
[0119]
(s2)将(s1)获得的第一诱导多能干细胞在第二培养基下培养时间d2，获得第二诱导多能干细胞。
[0120]
在另一优选例中，所述第二诱导多能干细胞表达选自下组的早期多能基因标志物，包括sall4，cdh1，epcam和lin28a。
[0121]
在另一优选例中，所述第二诱导的多能干细胞中：
[0122]
40％-80％的细胞表达早期多能基因标志物sall4；
[0123]
40％-80％的细胞表达期多能基因标志物cdh1；
[0124]
40％-80％的细胞表达期多能基因标志物epcam；和
[0125]
40％-80％的细胞表达期多能基因标志物lin28a。
[0126]
在另一优选例中，所述培养时间d2为12-20天；较佳地为12-18天。
[0127]
在另一优选例中，所述第二培养基包含或不包含rxra激活剂。
[0128]
在另一优选例中，所述第二培养基包含选自以下的试剂组合：
[0129]
gsk-3α/β抑制剂，较佳地为chir99021；
[0130]
tgf-β-ri/alk5抑制剂，较佳地为repsox(616452)；
[0131]
腺苷酸环化酶激活剂，较佳地为forskolin；
[0132]
单胺氧化酶抑制剂，较佳地为parnatate/tranylcypromine；
[0133]
rarα激活剂，较佳地为am580；
[0134]
组蛋白甲基转移酶ezh2抑制剂，较佳地为dznep。
[0135]
dot1l甲基转移酶抑制剂，较佳地为sgc0946。
[0136]
在另一优选例中，所述方法还包括：
[0137]
(s3)将(s1)获得的第二诱导多能干细胞在第三培养基下培养时间d3，获得胚胎干细胞样细胞。
[0138]
在另一优选例中，所述胚胎干细胞样细胞表达选自下组的多能标志物，包括oct4、sox2和nanog。
[0139]
在另一优选例中，所述胚胎干细胞样细胞中：
[0140]
20％-60％的细胞表达多能标志物oct4；
[0141]
20％-60％的细胞表达多能标志物sox2；和
[0142]
20％-60％的细胞表达多能标志物nanog。
[0143]
在另一优选例中，所述培养时间d3为12-20天；较佳地为12-18天。
[0144]
在另一优选例中，所述第三培养基包含选自以下的试剂组合：
[0145]
gsk-3α/β抑制剂，较佳地为chir99021；
[0146]
mek抑制剂，较佳地为pd0325901。
[0147]
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有活性成分，和药学上可接受的载体，其中，所述的活性成分包括rxra激活剂和选自下组的一种或多种试剂：
[0148]
(i)hdac抑制剂；
[0149]
(ii)gsk-3α/β抑制剂；
[0150]
(iii)tgf-β-ri/alk5抑制剂；
[0151]
(iv)腺苷酸环化酶激活剂；
[0152]
(v)rarα激动剂。
[0153]
在另一优选例中，所述药物组合物用于
[0154]
促进sall4基因表达；
[0155]
促进细胞重编程；
[0156]
激活rna外切体复合物；
[0157]
促进诱导多能干细胞的多能标志物表达；和/或
[0158]
治疗或降低炎症反应。
[0159]
在另一优选例中，所述炎症为ifn-γ-或trail介导的炎症。
[0160]
在本发明的第七方面，提供了一种的试剂盒，包括
[0161]
(1)rxra激活剂试剂，和
[0162]
(2)选自下组的一种或多种试剂：
[0163]
(i)hdac抑制剂；
[0164]
(ii)gsk-3α/β抑制剂；
[0165]
(iii)tgf-β-ri/alk5抑制剂；
[0166]
(iv)腺苷酸环化酶激活剂；和
[0167]
(v)rarα激动剂。
[0168]
在另一优选例中，所述试剂盒用于：
[0169]
促进sall4基因表达；
[0170]
促进细胞重编程；
[0171]
激活rna外切体复合物；
[0172]
促进诱导多能干细胞的多能标志物表达；和/或
[0173]
治疗或降低炎症反应。
[0174]
在另一优选例中，所述试剂盒还包括哺乳动物细胞。
[0175]
在另一优选例中，所述rxra激活剂为cd3254或cd3254样化合物。
[0176]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0177]
图1.类视黄醇x受体亚型α(rxrα)激动剂cd3254能显著促进小鼠化学重编程。(a)小鼠化学重编程过程中化合物筛选的示意图。(b)小分子筛选结果，第12天进行sall4免疫染色并对sall4阳性克隆数进行计数。(c)dmso和cd3254处理后sall4阳性克隆的荧光图像。比例尺，100μm。(d)用cd3254处理的sall4阳性克隆数。(e)获得poct4-gfp克隆过程示意图。(f)dmso和cd3254处理后poct4-gfp克隆的荧光图像。比例尺，100μm。(g-h)cd3254的浓度(g)和阶段(h)测试。(i)mefs，用dmso和cd3254处理的d12上的中间细胞以及r1 mescs中sall4，cdh1，epcam和lin28a基因表达的rt-qpcr分析。数据以三个独立实验的平均
±
sd表示。**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0178]
图2.化学诱导多能干细胞(cipscs)的鉴定。(a)建立cipsc系的示意图。(b)第1阶段使用dmso和cd3254处理的cipsc的明场和poct4-gfp图片。(c)dmso-cipscs和cd3254-cipscs中多能性标志物的免疫荧光染色结果。比例尺，50μm。(d)对小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)，dmso-cipsc，cd3254-cipsc和r1小鼠胚胎干细胞(mescs)中的oct4，sox2和nanog基因表达进行实时荧光定量pcr(rt-qpcr)分析。(e)比较mefs和dmso-cipsc，mefs和cd3254-cipsc，dmso-cipscs和cd3254-cipsc，r1 mescs和dmso-ipscs以及r1 mescs和cd3254-cipscs之间的整体转录水平。(f)亚硫酸氢盐测序分析oct4和nanog启动子位点的dna cpg甲基化。(g)cipscs的核型分析。(h)三种胚层分化标志物的免疫荧光染色结果。比例尺，100μm。(i)苏木精和伊红染色(h&e染色)，显示来自cipscs畸胎瘤的外胚层、中胚层和内胚层成分。比例尺，100μm。数据以三个独立实验的平均
±
sd表示。**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。(j)cipscs产生健康的小鼠的示意图
[0179]
图3.cd3254对化学重编程影响的转录分析。(a)比较cd3254和对照组dmso细胞之间整体基因表达模式的散点图。红点(n＝1330)和蓝点(n＝1330)分别代表上调(fc》1.5)和下调(fc《0.67)差异表达的基因，具有统计学意义(调整后的p值《0.05)。(b-c)与dmso细胞相比，cd3254中富集上调(b)和下调(c)基因的kegg通路的气泡图。周期大小表示每个通路中的基因数，橙色或蓝色梯度表示每个通路的调整p值。(d-g)早期多能性(d)、间充质(e)、上皮(f)和tgf-β信号通路的表达热图。(g)cd3254和dmso细胞中的相关基因。(h)cd3254与dmso细胞中上调(左)和下调(右)基因的功能富集分析。
[0180]
图4.类视黄醇x受体α亚型(rxrα)增强小鼠化学重编程。(a)显示rxra敲低过程的
图表。(b)感染shctr和shrxra病毒的mef中rxra表达的rt-qpcr分析。(c)sall4在重编程感染shctr和shrxra的中间体中的免疫荧光。比例尺，100μm。(d)用shctr和shrxra处理的细胞中多能基因表达的rt-qpcr分析。(e)显示感染rxra-oe病毒的重编程过程的图表。(f)对照细胞中sall4的免疫荧光和d12上rxra过表达细胞的免疫荧光。比例尺，100μm。(g)用ctr和rxra-oe处理的细胞中多能基因表达的rt-qpcr分析。数据以三个独立实验的平均
±
sd表示。**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0181]
图5.cd3254-rxrα轴转录激活rna外切体。(a)比较rxra-oe和对照细胞之间全局基因表达模式的散点图。红点(n＝1953)和蓝点(n＝2417)分别代表上调(fc》1.5)和下调(fc《0.67)差异表达的基因，具有统计学意义(调整后的p值《0.05)。(b)rxra-oe与对照细胞中富集上调基因的kegg途径的气泡图。rna降解途径以红色字体突出显示。(c)rna外切体复合物的模型。这个九亚基核心外泌体由顶部的三亚基帽(exosc1/2/3)和中间的六亚基环(exosc4-9)组成。两个活性核糖核酸酶亚基dis3和exosc10将接触该结构的底部和顶部。(e-f)对cd3254处理的(e)和rxra-oe处理的细胞(f)中的exosc3、exosc7、exosc8和dis3表达进行实时荧光定量pcr(rt-qpcr)分析。(g)表示rxrα结合基序(h)显示exosc3和dis3位点的rxrα峰。(i)exosc3和dis3启动子处预测的rxrα结合位点。(j)rxrα在exosc3和dis3基因位点结合能力的qpcr分析。数据以三个独立实验的平均
±
sd表示。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0182]
图6.rna外切体在重编程是多能性的过程中必不可少的。(a)显示exosc3敲低过程的图表。(b)感染shctr和shexosc3病毒的mef中exosc3表达的rt-qpcr分析。(c)sall4在感染shctr和shexosc3的中间体重编程中的免疫荧光。比例尺，100μm。(d)用shctr和shexosc3处理的细胞中多能基因表达的rt-qpcr结果。(e)比较shexosc3和shctr细胞之间全局基因表达模式的散点图。红点(n＝314)和蓝点(n＝1093)分别代表上调(fc》1.5)和下调(fc《0.67)差异表达的基因，具有统计学意义(调整后的p值《0.05)。(f)shexosc3和shctr细胞中差异表达mrna的表达热图。(g-h)富集上调(g)和下调的kegg通路的气泡图。(i)shexosc3与shctr细胞中上调(左)和下调(右)基因的功能富集分析。数据以三个独立实验的平均
±
sd表示。**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0183]
图7.rna外切体靶向转座子相关rna进行降解。(a)表示不同类型的差异表达rna的log2倍变化(b)火山图显示shexosc3与shctr细胞中差异表达的逆转录转座子。红点：3403个上调重复rna(fc》1.5，调整后的p值《0.05)，蓝点：35个下调的重复rna(fc《0.67，调整后的p值《0.05)。mmvl30-int重复项以红色字体突出显示。(c)比较shexosc3与shctr细胞的差异表达逆转录元件(fc》1.5或《0.67，调整后的p值《0.05)。mmvl30-int重复项以红色字体突出显示。(e)维恩图显示了shexosc3与shctr(上调)，cd3254与dmso(下调)和rxra-oe与ctr(下调)细胞中重叠的差异表达mmvl30-int转座子。(f)13个重叠的mmvl30-int转座子的rna丰度的密度图和热图。mmvl30-int转座子上的rna丰度按强度分类。(g)显示一些代表性mmvl30-int转座子(mmvl30-int_dup945至dup947)在cd3254处理和rxra-oe细胞中的表达降低，在shexosc3细胞中的表达增加。(h)cd3254处理的rxra-oe和shexosc3细胞中mmvl30-int表达的rt-qpcr分析。(i)与exosc3结合的mmvl30的rip-qpcr分析。(j)mmvl30-int的衰减曲线。(k)重编程感染shctr和shmmvl30的中间态细胞中的sall4阳性克隆。数据以三个独立实验的平均
±
sd表示。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0184]
图8.rna外切体降解mmvl30并减少炎症反应从而促进化学重编程。(a)shctr和shexosc3样本中ervs的顺式或反式转录本的差异表达(fc》1.5或《0.37，调整后的p值《0.05)的表达热图。(b)展示了shexosc3与shctr细胞中许多代表性双向ervs转录本的对数2倍变化。(c)cd3254处理下调重编程中间态细胞中的dsrnas。(d)cd3254降低mmvl30区域上的dsrnas。(e)cd3254处理的，rxra-oe和shexosc3细胞中ifngr1，tnfrsf1a和tnfrsf10b表达情况。(f)接受ifn-γ(20ng ml-1
)和tnf-α(20ng ml-1
)处理的sall4阳性克隆。(g)用ifn-γ和tnf-α处理对sall4，cdh1和zeb2表达进行rt-qpcr分析。(h)特异性jak抑制剂upadacitinib(5μm)和ikk抑制剂bms-345541(1μm)处理后的sall4阳性克隆。(i)用jaki和ikki处理对sall4，cdh1和zeb2表达进行rt-qpcr分析。(j)本发明的机制。数据以三个独立实验的平均
±
sd表示。*p《0.05，**p《0.01，****p《0.001，****p《0.0001。
具体实施方式
[0185]
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现，rxra激活剂小分子cd3254能够显著促进细胞化学重编程，转录激活rna外切体，调节转座子tes的降解(例如mmvl30)并降低mmvl30介导的炎症反应。在此基础上完成了本发明。
[0186]
具体地，本发明中：
[0187]
1.在化学重编程早期阶段进行无偏好小分子药物筛选，发现和明确了转录因子rxrα特异性激活剂cd3254能够显著稳定的促进化学重编程。同时，直接过表达rxra能显著提高重编程效率至10倍，进一步证实cd32540-rxrα在化学重编程中起着关键作用。
[0188]
2.通过rna-seq分析发现cd3254处理与过表达rxra都能整体激活rna外切体相关的11个基因(exosc1-10和dis3)。cut&tag测序与cut&tag-qpcr证实转录因子rxrα能结合在rna外切体相关基因的启动子区域，首次证明了cd3254-rxrα轴能整体转录激活rna外切体复合物。
[0189]
3.深入分析lncrna-seq数据，我们发现重编程过程中敲低rna外切体关键基因exosc3后，区别于其他种类rnas，转座子相关的rnas表达显著增加，其中主要是mmvl30-int这一类，首次揭示了cd3254-rxrα-rna外切体轴主要调节mmvl30-int这一类转座子rnas，同时首次证明mmvl30是细胞化学重编程中的障碍。
[0190]
4.进一步分析发现重编程中cd3254-rxrα-rna外切体信号轴会降低mmvl30介导的炎症反应，首次报道炎症反应相关ifn-γ和tnf-α通路是细胞化学重编程的障碍。
[0191]
术语
[0192]
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
[0193]
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
[0194]
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
[0195]
类视黄醇x受体(rxr)
[0196]
核受体是生物体内关键的转录因子，可以直接将化学信号转化为不同的生理效应，在发育和生理学中发挥重要作用。类视黄醇x受体(rxr)可以与其他核受体异二聚化，调
控多个相互交织的信号网络。目前研究表明，类视黄醇x受体信号通路在血液、棕色脂肪和胰腺分化等发育过程中发挥关键作用。除此之外，类视黄醇x受体已被证明参与组织修复和再生过程。但是，类视黄醇x受体精确的分子机制尚不清晰，需要进一步探索。
[0197]
哺乳动物中rxr蛋白存在三种亚型，rxrα，rxrβ和rxrγ。人类rxrα，rxrβ和rxrγ蛋白与小鼠对应蛋白分别有97.4％，94.75％和98.27％的同源性。rxrα主要定位于细胞核，在细胞质和线粒体中同样存在。rxrα主要在肝脏、肾脏和脑组织中广泛表达。在发育过程中，rxrα表达相当普遍，在妊娠晚期发育中的皮肤表皮有较高表达。
[0198]
rna外切体
[0199]
rna外切体是总共11个亚基的复合物，并参与rna降解。作为生物体内普遍存在rna监测系统，它能够精确调控rna稳态，保障正常发育。其中，rna外切体是rna监测系统的关键成分，具有3’至5’核糖核酸酶活性的多蛋白复合物，包含11个亚基(exosc1-esosc10和dis3)。细胞命运转变过程中伴随着大量rna的快速降解与合成，需要全面的rna监测。
[0200]
目前，rna监测对细胞重编程的具有贡献仍然未知。此外，如何利用rna监测更好地操纵细胞命运，值得研究与阐明。此外利用化学小分子调控rna外切体的整体表达情况，具有广泛的应用价值。
[0201]
cd3254-rxrα-rna外切体轴
[0202]
本发明中，发明人在首次发现了一条全新通路：cd3254-rxrα-rna外切体轴。具体地，在哺乳动物细胞中，cd3254-rxrα轴可以转录激活rna外切体所有11种成分(exosc1-10和dis3)。进一步发现rna外切体主要调节转座子tes的降解(主要是mmvl30-int)并降低mmvl30介导的炎症反应(ifn-γ和tnf-α通路)。
[0203]
激活剂和药物组合物
[0204]
如本文所用，“cd3452或cd3452样化合物”是指能够激活rxrα表达作用，转录激活rna外切体，调节转座子tes的降解，显著促进细胞化学重编程的一系列小分子化合物。
[0205]
如本文所用，术语“rxra激活剂”、“本发明的rxra激活剂”指能够激活rxra表达的物质，尤其是小分子化合物。
[0206]
一种代表性的激活剂是cd3254，结构如下所示：
[0207][0208]
其能够显著促进细胞化学重编程效率，并能够整体转录激活rna外切体复合物。
[0209]
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明激活剂(如化学小分子)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。
[0210]
本发明的主要优点包括
[0211]
(1)本发明发现新型小分子cd3254能够显著促进细胞化学重编程效率。
[0212]
(2)本发明发现cd3254能够激活rna外切体驱动体细胞重建多能性，破译化学重编程的潜在分子机制。
[0213]
(3)本发明的小分子cd3254能够整体转录激活rna外切体复合物，预期适用于损伤和癌症模型中。
[0214]
(4)本发明的小分子cd3254可以作为癌细胞rna外切体激活剂，促进相关癌症基因的rna降解，进而作为药物用于相关疾病的治疗。
[0215]
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0216]
实施例
[0217]
实验方法：
[0218]
动物
[0219]
og2小鼠和129小鼠交配产生后代，其携带oct4启动子驱动的gfp报告基因(og2x129小鼠)。从og2x129小鼠的e13.5胚胎中获得小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)。将小鼠饲养在浙江大学实验动物中心的无病原体设施中，并喂食正常的食物饮食。本发明中使用的动物相关程序已获得浙江大学实验动物伦理委员会的批准。
[0220]
细胞培养
[0221]
mef培养基：dmem basic培养基中加入10％ fbs和1
×
青霉素/链霉素双抗，混匀后4℃保存。
[0222]
小鼠多能干细胞培养基(2i)：dmem basic培养基中加入10％ fbs，10％ ksr，1
×
neaa溶液，1
×
p/s双抗，0.055mmβ-巯基乙醇，1000u/ml lif，(3μm)chir99021和pd0325901(0.2μm)，混匀后4℃保存。
[0223]
小鼠转录因子重编程培养基：dmem basic培养基中加入10％ fbs，10％ ksr，1
×
neaa溶液，1
×
p/s双抗，0.055mmβ-巯基乙醇，1000u/ml mlif和2μg/ml强力霉素(dox)。
[0224]
拟胚体(eb)分化培养基：dmem basic培养基中加入10％ fbs，10％ ksr，1
×
neaa溶液，1
×
p/s双抗和0.055mmβ-巯基乙醇，混匀后4℃保存。
[0225]
小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)和人胚胎肾(hek)293t细胞培养在mef培养基中。小鼠escs和cipscs培养在含有cf1饲养层细胞的小鼠多能干细胞培养基中。所有细胞均保持在37℃和5％ co2的加湿培养箱中。
[0226]
细胞化学重编程
[0227]
小鼠化学重编程第一阶段培养基(stage 1，见表1)：dmem basic培养基中加入10％fbs，10％ ksr，1
×
neaa溶液，1
×
p/s双抗，0.055mmβ-巯基乙醇，20ng/ml bfgf和化学小分子vpa(0.5mm)，chir99021(20μm)，616452(10μm)，parnatate(5μm)，forskolin(50μm)，am580(0.5μm)，epz004777(5μm)和vc(250μm)，混匀后4℃保存。
[0228]
小鼠化学重编程第二阶段培养基(stage 2)：dmem basic培养基中加入10％ fbs，
10％ ksr，1
×
neaa溶液，1
×
p/s双抗，0.055mmβ-巯基乙醇，20ng/ml bfgf和化学小分子vpa(0.5mm)，chir99021(10μm)，616452(10μm)，parnatate(5μm)，forskolin(10μm)，am580(0.5μm)，dznep(0.05μm)，5-aza-dc(0.5μm)，sgc0946(5μm)和vc(250μm)，混匀后4℃保存。
[0229]
小鼠化学重编程第三阶段培养基(stage 3)：47％ dmem/f12、47％ neurobasal medium、100
×
n2、50
×
b27补充剂、1％ neaa、1％ p/s、0.055mmβ-巯基乙醇、1000u/ml lif以及小分子chir99021(3μm)和pd0325901(0.2μm)，混匀后4℃保存。
[0230]
将约4
×
105小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)复苏接种到一个培养板中，过夜培养。
[0231]
将原有的mef培养基替换成小鼠化学重编程第一阶段培养基(stage 1)，每隔4天更换新鲜培养基，连续培养12天。
[0232]
第12天，将培养基替换成小鼠化学重编程第二阶段培养基(stage 2)，每隔4天更换新鲜培养基，连续培养12天。
[0233]
第24天，将培养基替换成小鼠化学重编程第三阶段培养基(stage 3)，每隔4天更换新鲜培养基，连续培养12到16天。
[0234]
最后，通过挑克隆或者传代的方式将ipsc进行纯化和扩增。
[0235]
表1 stage 1重要的小分子
[0236]
小分子靶标vpa又称为valproic acid，hdac抑制剂chir99021选择性gsk-3α/β抑制剂616452又称为repsox，tgf-β-ri/alk5抑制剂forskolin腺苷酸环化酶激活剂am580选择性的rarα激动剂
[0237]
小分子药物筛选
[0238]
在化学重编程第一阶段进行将近200个小分子筛选。将小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)接种到24孔板中，每个孔中额外添加一个小分子，每个培养板设置dmso孔作为对照，培养至第12天，进行sall4免疫染色，荧光显微镜下观察并计数每孔sall4阳性克隆数。
[0239]
小鼠转录因子重编程
[0240]
小鼠转录因子重编程培养基：dmem basic培养基中加入10％ fbs，10％ ksr，1
×
neaa溶液，1
×
p/s双抗，0.055mmβ-巯基乙醇，1000u/ml mlif和2μg/ml强力霉素(dox)。
[0241]
将表达oct4,sox2,klf4和nanog的病毒转染小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)两次后，传代到24孔板中。24小时后，将mef培养基替换成小鼠转录因子重编程培养基，每隔4天换液，重编程第8天计数gfp阳性的克隆数。
[0242]
免疫染色实验
[0243]
贴壁细胞去除培养基，加入4％多聚甲醛(pfa)覆盖住细胞，室温摇床处理10min；去除pfa，用pbst缓冲液清洗3次，每次5min；去除pbst，加入免疫荧光染色封闭液室温处理30-60min；去除封闭液，加入用封闭液稀释的一抗(anti-sall4，1:1000；anti-sox2，1:2000；anti-oct4，1:500；anti-nanog，1:500；anti-tuj1，1:5000；anti-α-sma，1:2000；anti-foxa2，1:1000)，置于4℃冰箱，过夜处理；回收一抗，pbst清洗细胞3次，每次15min；加入对应抗性的二抗(同样用封闭液稀释，1:2000)稀释液，置于摇床，室温避光处理1h；去除二抗，pbst清洗细胞2次，每次10min，避光处理；加入1:5000稀释的hoechst溶液，置于摇床，
避光处理10min；去除hoechst稀释液，pbst清洗细胞2次，每次10min，避光处理；使用荧光倒置显微镜观察细胞。
[0244]
实时荧光定量pcr(rt-qpcr)
[0245]
使用总rna提取试剂盒分离和纯化总rna，然后使用反转录试剂盒进行rna反转录为cdna。按照实时荧光定量pcr试剂盒说明书进行操作进行实时荧光定量pcr。引物序列列于表2中。
[0246]
质粒构建和病毒包装
[0247]
将rxra-，exosc3-，dis3-和mmvl30-靶向或对照shrna与plko.1载体连接。从cdna文库扩增rxra cds并与psin载体连接。将质粒转染到含有pei的hek293t细胞中，转染时mef培养基需去除双抗p/s。转染后48和72小时收集并过滤病毒。
[0248]
化学重编程过程中基因敲除与过表达实验
[0249]
将小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)接种到24孔板上，并在第1阶段培养基中培养。在第2天，用shrna病毒或psin-过表达病毒用5μg ml-1
polybrene处理细胞4小时。在第12天，sall4阳性克隆数计数为读数。
[0250]
拟胚体分化实验
[0251]
拟胚体(eb)分化培养基：dmem培养基中加入10％ fbs，10％ ksr，1
×
neaa溶液，1
×
p/s双抗和0.055mmβ-巯基乙醇，混匀后4℃保存。
[0252]
将小鼠化学诱导多能干细胞(cipscs)接种到低吸附细胞培养板中，在拟胚体(eb)分化培养基中培养7天形成悬浮拟胚体，每隔3天换液。然后将拟胚体1:6接种到普通培养板贴壁培养中，每隔3天换液，大约2周后进行免疫荧光染色。
[0253]
亚硫酸氢钠测序法检测dna甲基化
[0254]
使用基因组提取试剂盒提取基因组dna，获得的基因组dna用dna甲基化试剂盒修饰并纯化dna，pcr扩增修饰后的dna，将pcr产物连接至t载体，测序分析。
[0255]
化学诱导多能干细胞(cipscs)核型分析
[0256]
本发明中将第7代的ipsc细胞正常培养至80％密度，送至由杭州妇幼保健院产前诊断中心进行核型检测。
[0257]
蛋白免疫印迹(western blot)实验
[0258]
用含有1％苯甲基磺酰氟(pmsf)的裂解缓冲液处理细胞。然后离心细胞提取物并收集上清液。在10％丙烯酰胺梯度sds-page凝胶上分离细胞裂解物并转移到nc膜上。将膜用封闭液封闭2小时，在4℃下与一抗(anti-exosc3，1:1000；anti-dis3，1:1000)孵育过夜，然后在室温下与二抗孵育1小时，最后用高灵敏度ecl化学发光检测试剂盒或高灵敏度ecl检测试剂盒进行免疫印迹检测。
[0259]
rna测序分析
[0260]
利用rna试剂盒提取样本总rna，用于rna测序。cdna文库构建和高通量测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。使用读取长度为150bp的illumina hiseq 2500进行双端测序。首先通过软件fastp(v0.20.1)去除原始数据中测序质量低的适配器序列和读数[151]，并使用软件hisat2(v2.1.0)与小鼠基因组(mm10)对齐。针对敲低exosc3的链特异性rna-seqs(lncrna-seq)数据，上述操作相同。通过软件stringtie(v2.0)量化转录本(包括mrnas与lncrnas)并计算它们的fpkm。对于转座子tes的分析，计算每个te转录本的fpkm，将
它们进行整合计算。最后，利用来自bioconductor课题组的r包deseq2(http://www.bioconductor.org/)进行差异表达分析。
[0261]
go和kegg富集分析是通过来自bioconductor课题组的r包clusterprofiler完成[155]。本课题选择调整后的p值小于0.05作为有统计学意义。
[0262]
基因富集分析(gsea)和可视化分别由来自bioconductor课题组的r包msigdbr和enrichplot完成。
[0263]
靶向剪切及转座酶实验(cut&tag)
[0264]
将psin-flag-rxra慢病毒转染og2小鼠胚胎成纤维细胞2次，用小鼠化学重编程第一阶段培养基连续培养12天。根据cut&tag试剂盒说明书操作。
[0265]
若要进行cut&tag-qpcr实验，首先设计相关qpcr引物。在jaspar网站上预测转录因子在相关基因启动子区域可能的结合位点，在结合位点前后100bp序列处设计qpcr正反引物。将扩增后的dna稀释10倍，进行rt-qpcr实验。
[0266]
将cut&tag最后得到的dna产物送至北京诺禾致源科技股份有限公司，使用读取长度为150bp的illumina hiseq 6000进行双端测序。利用软件fastp(v0.20.1)处理原始数据，使用软件bowtie2(v2.2.5)将数据匹配到小鼠基因组[158]。然后，使用软件igv(v2.6.3)与deeptools(v3.4.3)可视化cut&tag峰[159]。利用来自bioconductor课题组的r包chipseeker对测序峰进行注释。
[0267]
使用软件homer(v4.11)进行基序(motif)富集分析。
[0268]
使用cistrome数据库(http://cistrome.org/)预测转录因子调控特定基因的可能性。
[0269]
rna免疫沉淀实验(rip)
[0270]
根据rip试剂盒说明书进行操作。将所得rna样品进行反转录，cdna产物稀释10倍用于实时荧光定量pcr(rt-qpcr)。
[0271]
mrna稳定性实验
[0272]
用10μg/ml放线菌素d处理重编程第12天的样品，在0h，4h和8h不同时间点收集细胞。用总rna提取试剂盒提取样本的总rna，送至公司进行高通量测序。
[0273]
流式细胞分析(facs)实验
[0274]
使用0.25％胰蛋白酶将重编程中间态细胞解离成单细胞。将细胞在4℃下用4％多聚甲醛(pfa)固定30分钟，并用pbst洗涤3-5次，然后以1500rpm离心5分钟。接下来，用封闭缓冲液封闭细胞，并与dsrna抗体(1：200)在4℃孵育过夜。用pbst洗涤3次后，将细胞在室温下在二抗中孵育1小时。
[0275]
双链rna(dsrna)检测实验
[0276]
从相应细胞中提取获得5μg总rnas，用去离子水稀释至46μl，加入3.5μl 5m的氯化钠溶液，充分混匀，配制相同的2管溶液。向2管中分别加入0.5μl 10mg/ml rnasea酶溶液和0.5μl去离子水作为空白对照组，总共体积为50μl，pcr 37℃反应30min。用pcr产物纯化试剂盒按照说明书纯化反应产物。纯化后，将获得的dsrnas进行95℃变性处理5min，通过反转录试剂盒反转录为cdna。通过rt-qpcr以actin作为内参测量所选mmvl30的rna转录本区域。用(反转录转座子/actin)rnase-a/(反转录转座子/actin)空白对照组公式计算mmvl30区域dsrnas的富集倍数。
[0277]
实施例1筛选发现小分子cd3254和类视黄醇x受体α亚型(rxrα)能够促进细胞化学重编程
[0278]
使用og2小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)作为起始细胞，从第0天到第12天用重编程第1阶段培养基处理细胞，并在第1阶段使用sall4阳性克隆数来筛选小分子(图1a)。有趣的是，小分子中cd3254重编程效率最高，其促进效果可以被进一步证实(图1b-d)。接下来，将重编程过程扩展到第2阶段，并观察到oct4-gfp阳性克隆数的增加(图1e和f)。cd3254的最佳浓度为0.5μm，此外，cd3254主要在第1阶段起作用(图1g和h)。
[0279]
使用实时定量pcr(rt-qpcr)，观察到cd3254诱导早期多能基因的表达，包括sall4，cdh1，epcam和lin28a(图1i)。从筛选结果中，还发现其他类视黄醇x受体(rxr)激动剂bexarotene和sr11237可以显著增强重编程(图1a和b)。
[0280]
小分子筛选前5个化合物为：cd3254、unc0646、bexarotene、sr11237、a-366。分子式如表2所示。
[0281]
另一方面，rxr拮抗剂hx531可以阻断cd3254的作用(图1c和d)。缩短了stage1的时间，发现cd3254的最大效果是提高重编程效率，而不是加速化学重编程过程(图1e)。进一步测试了cd3254对小鼠转录因子(tfs)重编程的影响，发现cd3254不能促进tf诱导的重编程(图1f)。
[0282]
总体而言，通过化学筛选，确定了一种新的小分子cd3254，它是一种特异性和有效的类视黄醇x受体α亚型(rxrα)激动剂，可以显著提高化学重编程的效率，有助于解决化学重编程的低效问题。基于这些结果，将以下研究重点放在cd3254上，以此为切入点去更好地了解化学重编程。
[0283]
在进一步培养第24天的重编程中间体12-16天后，建立了几个oct4阳性化学诱导多能干细胞(cipsc)系并对其进行了详细鉴定(图2a)。这些oct4-gfp阳性细胞具有典型的小鼠胚胎干细胞形态(图2b)。免疫染色表明，这些cipsc表达典型的多能标志物，包括oct4、sox2和nanog(图2c)。
[0284]
rt-qpcr显示多能基因的稳定表达，如oct4，sox2和nanog(图2d)。转录分析显示，dmso-cipscs和cd3254-cipscs接近r1 mescs，远离mefs(图2e)。亚硫酸氢盐测序分析显示，这些cipscs的oct4和nanog启动子在很大程度上被去甲基化，为成功的表观遗传重新配置提供了进一步的证据(图2f)。核型分析结果显示，这些cipscs保持正常的核型(图2g)。通过拟胚体分化实验，可以观察到所有三种胚层细胞，例如tuj1阳性外胚层细胞，α-sma阳性中胚层细胞和foxa2阳性内胚层细胞(图2h)。畸胎瘤实验表明，这些cipscs可以产生典型的畸胎瘤，其中包含所有三个胚层的衍生物，包括外胚层，中胚层和内胚层(图2i)。嵌合体实验表明，这些cipscs可以产生健康的小鼠(图2j)。
[0285]
上述鉴定表明，这些cipscs在分子和功能上与mesc相似，证明了通过化学方法成功进行多能性重编程。
[0286]
表2小分子筛选中的前5个化合物及分子式
[0287][0288]
表3rxr拮抗剂hx531
[0289][0290][0291]
实施例2cd3254对化学重编程转录水平的影响
[0292]
为了探索cd3254在化学重编程中的分子机制，将cd3254处理12天的重编程中间态细胞进行rna测序。测序数据重复性较好(图2a)。接下来，对两种处理的数据进行了差异基因表达分析。cd3254处理后，总共有1330个基因上调，1330个基因下调(倍数变化》1.5或《0.67，调整后的p值《0.05)(图3a和图2b)。
[0293]
接下来，做了京都基因和基因组百科全书(kegg)途径富集分析。上调基因中的kegg通路包括dna复制，同源重组，剪接体和rna降解(图3b)。下调的kegg通路包括类固醇生物合成，mapk信号通路，粘附和tgf-β信号传导(图3c)。特别的是，早期多能基因(例如，sall4，lin28a，esrrb，klf4，cmyc)和上皮基因(例如，cdh1，cldn4，tjp3)上调，而间充质基因(例如，zeb1，twist1，snail1)被下调(图3d-f)。还观察到参与tgf-β信号通路的关键基因
(例如，tgfb1，grem1，smad3)的下调(图3g)。此外，基因本体(go)分析显示上调术语，包括干细胞群维持，染色质组织，rna代谢过程和dna复制。下调的go通路包括胞外基质，上皮到间充质的过渡，tgf-β和mapk信号通路(图3h)。
[0294]
基因集富集分析(gsea)结果进一步提示核糖体、剪接体、dna修复、嘧啶代谢上调，溶酶体、细胞因子-细胞因子受体相互作用、刺猬信号通路下调(图2c)。
[0295]
总体而言，cd3254处理可以促进基因调控网络的重新配置，加速met和多能性诱导。
[0296]
实施例3类视黄醇x受体α亚型(rxrα)过表达可显著促进化学重编程
[0297]
为了进一步剖析cd3254是否通过其同源靶标rxrα促进小鼠化学重编程，测试了rxra敲低和过表达的功能(图4a和b)。shrna敲低rxra抑制sall4阳性克隆数，以及早期多能性标记基因的表达，如sall4、cdh1、epcam和lin28a(图4c和d)。
[0298]
出乎意料的是，rxra过表达的影响非常显着，可以使sall4阳性克隆数量增加约10倍，进一步表明cd3254-rxrα轴在化学重编程中起着关键作用(图4e-g)。此外，发现rxra过表达不能促进tf诱导的重编程(图1f)。
[0299]
同样地，使用rna-seq，评估了rxra过表达的基因表达变化。在rxra过表达后，总共有1953个基因上调，2147个基因下调(倍数变化》1.5或《0.67，调整后的p值《0.05)(图5a，图3a和b)。上调类别包括干细胞群维持、染色质重塑、dna复制、rna降解和mrna监测途径(图5b和图3d)。
[0300]
另一方面，下调基因属于溶酶体、粘附、mapk信号通路、tgf-β信号通路、自噬和缺氧反应(图3c和d)。与cd3254处理类似，发现早期多能基因和上皮基因上调，而间充质基因和参与tgf-β信号通路的关键基因下调(图3f)。gsea进一步发现同源重组的上调，以及细胞因子-细胞因子受体相互作用、溶酶体、趋化因子信号通路的下调(图3e)。
[0301]
总体而言，rxra过表达还增强了(甚至比cd3254更有效)基因调控网络从体细胞状态到多能状态的重新布置。
[0302]
实施例4cd3254-rxrα轴直接转录上调rna外切体
[0303]
整合cd3254处理和rxra过表达的rna-seq数据，发现rna外切体成分基因被显著诱导。rna外切体是总共11个亚基的复合物，并参与rna降解(图5b和c)。rna外切体在细胞重编程中的作用尚未被描述，在很大程度上仍然未知。如图5d所示，cd3254处理和rxra过表达都增加了rna外切体所有11个亚基的表达，包括exosc1-10和dis3。利用实时荧光定量pcr(rt-qpcr)进一步确认cd3254处理和rxra过表达后，exosc3，exosc7，exosc8和dis3的上调(图5e和f)。此外，cd3254处理和rxra过表达都可以增强exosc3和dis3蛋白水平(图3g)。
[0304]
利用cistrome数据库对rna外切体成分基因进行转录因子(tf)调控电位指标分析，将类视黄醇x受体α亚型(rxrα)确定为rna外切体成分基因的预测性上游调控tf(图4a和b)。为了确定rna外切体亚基基因是否是rxrα的直接下游靶标，进行了cut&tag实验。事实上，观察到rxrα可以直接与所有11个rna外切体组成基因的基因组区域结合(图5g和h以及图4c)。接下来，通过cut&tag-qpcr测定进一步证实了rxrα与rna外切体成分基因exosc3和dis3基因组区域的直接结合(图5i和j)。
[0305]
综上，本发明提示rxrα是rna外切体所有组成基因的新的直接上游调节因子。
[0306]
实施例5rna外切体是化学重编程所必需的
[0307]
接下来，测试了rna外切体在化学重编程中的功能。使用shrna敲低rna外切体的核心成分exosc3(图6a和b)。发现exosc3敲低减少了sall4阳性克隆的数量，以及早期多能性基因sall4，cdh1，epcam和lin28a的表达(图6c和d)。然而，exosc3敲低对转录因子诱导的重编程没有影响，表明cd3254-rxrα-rna外切体信号轴未参与转录因子诱导的重编程(图1f)。此外，敲低rna外切体的另一个关键成分dis3表现出类似的表型(图5a-d)。使用rna-seq，评估了exosc3敲低后的基因表达变化。在exosc3敲低后，总共有314个基因上调，1093个基因下调(倍数变化》1.5或《0.67，调整后的p值《0.05)(图6e和f)。上调基因属于ecm-受体相互作用、对损伤的反应和细胞因子-细胞因子受体相互作用(图6g和i)。另一方面，下调的通路包括dna复制，染色质组织，甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢以及调节干细胞多能性的信号通路(图6h和i)。
[0308]
综上所述，确定了rna外切体是化学重编程的一种新的正调节因子。
[0309]
实施例6rna外切体主要靶向转座子rnas进行降解
[0310]
rna外切体是一种rna降解复合物，但是exosc3敲低后反而下调mrnas的总体数量要高得多(314个上调vs 1093个下降)。这种现象也不同于以前在其他生物系统中的观察。除了mrnas，非编码rnas(ncrnas)，包括长非编码rnas(lncrnas)，增强子rnas(ernas)，启动子相关rnas(parnas)和转座子rnas(重复rnas)，也被证明是rna外切体的底物。为了研究rna外切体对ncrnas的影响，量化了lncrna，erna和parna在exosc3敲低时的表达变化。总体而言，这些ncrnas的表达水平在shexosc3中呈下降趋势，与mrna相似(图6a、e和f)。此外，观察到一些lncrnas的表达模式与邻近基因的表达模式相关，表明lncrnas在其邻近基因上的表达调控。例如，在exosc3敲低后，位于sall4上游的gm14261的表达减少，而位于siah1a下游的gm10638的表达增加(图6b-d)。
[0311]
出乎意料的是，在exosc3敲低后，重复rna的表达显着增加，这表明重编程过程中rna外切体主要靶向重复rnas进行降解(图7a)。发现大多数差异表达的重复rnas上调(n＝3403)，而只有少数下调(n＝35)(图7b)。增加的重复rnas包括大多数转座子类别，例如含有长末端重复(ltr)的内源性逆转录病毒(erv)和非ltr元件，包括长穿插核元件(line)和短穿插核元件(sine)(图7c)。有趣的是，通过精确研究重复rnas的表达变化，发现前10个上调重复rnas中有8个(按log2倍变化和p值排列)是mmvl30-int，属于vl30 erv1家族(图7b和c)。此外，上调的mmvl30-int转座子的比例明显高于所有表达的tes的比例，这意味着mmvl30-int是rna外切体的主要靶标(图7d)。为了进一步验证这一假设，研究了cd3254处理和rxra过表达后重复rnas的表达变化。同样，mmvl30-int在下调tes中显著丰富(图6g和6h)。对这些rna-seq数据集的综合分析表明，13个mmvl30-int转座子受exosc3敲低，cd3254处理和rxra过表达的调节(图7e)。这些转座子的表达模式在cd3254处理，rxra过表达和exosc3敲低中表现出不同的方式，这意味着rna外切体确实是mmvl30-int转录本降解的原因(图7f和g)。
[0312]
rt-qpcr证实了cd3254处理和rxra过表达对mmvl30表达的下调，以及exosc3敲低对mmvl30表达的上调(图7h)。此外，用rna免疫沉淀实验rip-qpcr进行了exosc3 rna免疫沉淀，并验证了exosc3蛋白可以直接结合mmvl30转录本(图7i)。接下来，分析了用转录抑制剂放线菌素d(act d)处理的重编程中间体的rna-seq数据，并分别在0h，4h和8h收集。发现mmvl30-int在cd3254处理细胞中的稳定性显著降低(图7j)。在功能上，发现mmvl30敲低可
以增加sall4阳性克隆数(图7k和图7a-c)，并促进早期多能基因的诱导，包括sall4，cdh1，epcam和lin28a(图7d)。因此，mmvl30被证明是化学重编程的新障碍。
[0313]
总的来说，通过进一步的数据探索，发现cd3254-rxrα-rna外切体轴在细胞命运转换过程中促进转座子rnas(主要是mmvl30)的降解。
[0314]
实施例7rna外切体介导转座元件降解并减弱炎症反应从而促进化学重编程
[0315]
最近的研究表明，mmvl30转录本的积累可以刺激细胞质核苷酸感应途径，随后刺激干扰素反应，而干扰素反应在肿瘤发生，发育和组织修复中起作用。然而，转座子在细胞重编程中的作用仍然难以确定。因此，决定进一步探讨mmvl30在化学重编程过程中失调后的后果。cd3254处理方法与实施例1中相同。
[0316]
总体而言，发现在exosc3敲低时，许多ervs以顺式和反式转录物的形式被诱导(图8a)。这些上调的ervs，包括mmvl30-int，以正向和反向方向表达，并且可以形成双链rnas(dsrnas)(图8b)。事实上，荧光激活细胞分选(facs)分析发现cd3254处理可以降低总体dsrnas水平(图8c)。还观察到mmvl30区域形成的dsrnas显著降低(图8d)。dsrnas的积累可以引发炎症和免疫反应。事实上，观察到几种炎症相关基因，包括ifngr1，tnfrsf1a和tnfrsf10b在cd3254处理的，rxra过表达和mmvl30敲低样品中下调，但是，在exosc3敲低样品中表达上调(图8e)。为了进一步测试ifn-γ和tnf-α通路的作用，在重编程过程中添加了ifn-γ和tnf-α，发现它们确实减少了sall4阳性克隆的数量(图8f)。同时，早期多能基因sall4和上皮基因cdh1的表达降低，间充质基因zeb2的表达增加。另一方面，jak抑制剂upadacitinib和ikk抑制剂bms-345541可以促进重编程(图8h和i)。炎症和细胞命运之间的关系取决于所处环境。初步研究表明，tlr3或il6介导的先天免疫的激活是有效的多能重编程所必需的。后来，一些研究表明ifn-γ-或trail介导的炎症是转录因子诱导多能性的障碍。在这里，研究表明ifn-γ和tnf-α途径是化学重编程的障碍，这是以前从未报道过的。
[0317]
综上所述，通过无偏好化学筛选，发现rxrα特异性激动剂cd3254可以显著促进化学重编程。进一步的机理研究提示，cd3254-rxrα轴可以转录激活rna外切体所有11种成分(exosc1-10和dis3)。进一步解析相关数据后，观察到rna外切体主要调节转座子tes的降解(主要是mmvl30-int)并减少炎症(例如，ifn-γ和tnf-α通路)。
[0318]
值得注意的是，这些研究提供了关于细胞命运转变的新见解以及控制细胞命运的更好策略(图8j)。
[0319]
讨论
[0320]
自2006年yamanaka因子被报道以来，细胞重编程领域蓬勃发展，取得了显著的成就，有望用于探索疾病机制和加强疾病治疗。目前，体细胞重编程技术对疾病建模、细胞移植和药物筛选等方面的贡献已经得到广泛认可。结合直接细胞重编程和基因编辑等新技术，ipsc技术将有助于未来个性化、预测性和精准治疗。相比于外源转录因子突然迫使细胞发生命运转变，化学小分子通过触发细胞内源先天机制从而能够减少人工操作，其临床前景更加广阔。然而，化学重编程目前仍然存在效率低下和确切分子机制尚不明确的2个根本性问题，这限制了其真正走向临床。
[0321]
为了尝试解决上述化学重编程领域目前存在的难题，本发明首先建立了小鼠体细胞化学重编程系统，进行了无偏好化合物筛选。通过200多个化合物筛选，发现rxrα激活剂cd3254，以及其同类型的rxr激活剂bexarotene和sr11237能够有效提高重编程效率，其中
cd3254促进效果最为显著，在这之前cd3254对重编程的促进作用未被报道过。
[0322]
本发明以cd3254为切入点，进行重编程机制方面的研究。结合cd3254处理以及过表达rxra的2组rna-seq数据，发现2种处理都能促进基因调控网络的重新配置，加速met和多能性诱导。此外更重要的是，发现cd3254处理和过表达rxra的上调差异基因经过kegg通路富集分析，都富集到了rna降解这一通路。通过进一步的rt-qpcr以及cut&tag实验，明确了cd3254-rxrα轴能够转录激活rna外切体复合物的全部11个基因(exosc1-10和dis3)。rna外切体在rna监测系统中发挥重要作用，确保以时空调控的模式精确控制细胞内rna稳态平衡，保障正常发育。通过非整合型小分子而不是遗传学手段诱导rna外切体非常有利。测试cd3254激活rna外切体是否可以应用于其他生物学系统，如损伤和癌症模型中，有利于进一步开发cd3254为多种疾病的药物。
[0323]
现有技术中，rna外切体的研究以mrnas为其主要底物。但在本发明中，发现敲低rna外切体关键基因exosc3，包括mrnas、lncrnas、ernas和parnas在内的rna，整体转录水平呈下降趋势，与预期不一致。经过更深入的生物信息学分析，发现本发明中rna外切体主要调控转座子tes的降解，其中多数属于mmvl30家族。进一步的功能实验，证明mmvl30是细胞重编程的新障碍。
[0324]
除此之外，mmvl30介导的炎症反应(ifn-γ和tnf-α通路)降低有助于促进化学重编程。在此之前，有几项研究报道了炎症反应与细胞命运之间的关系。例如，初步研究表明，tlr3介导的先天免疫的激活是有效多能性重编程必不可少的。之后，又有两项工作表明损伤诱导的炎症和衰老也能够调节体内重编程。与这些研究不同，发现炎症反应是小鼠化学重编程的障碍。因此，炎症反应在细胞命运转变过程中的角色取决于其所处的环境。
[0325]
综上所述，本发明不仅发现了用于改进化学重编程技术的新小分子，而且还发现了新的机制，有利于ipsc领域的进一步的探索。
[0326]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分包含rxra激活剂的试剂，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于：激活rna外切体复合物；促进sall4基因表达；促进细胞重编程；促进诱导多能干细胞的多能标志物表达；和/或治疗或降低炎症反应。2.一种筛选促进哺乳动物非多能细胞形成诱导多能干细胞(ipsc)的潜在化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)提供测试组和空白对照组，将加入测试物的培养体系作为测试组，在测试物存在的情况下，培养非多能细胞；将不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组，在不添加该测试物的情况下，培养非多能细胞，空白对照组与测试组其他的条件相同；(b)检测测试组、空白对照组中转座子rna的降解情况，其中测试组的转座子rna的表达量记为c1，空白对照组的转座子rna的表达量记为c0；和(c)比较测试组和空白对照组的转座子rna降解水平，如果测试组的转座子rna的表达量显著低于空白对照组的转座子rna的表达量；则提示所述化合物为能够促进哺乳动物非多能细胞形成诱导多能干细胞(ipsc)的潜在化合物。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转座子rna为vl30 erv1家族；较佳地为mmvl30。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述促进哺乳动物非多能细胞向诱导多能干细胞转化的化合物为rxrα特异性激动剂；较佳地为cd3452或cd3452样化合物。5.一种筛选促进哺乳动物非多能细胞中sall4基因上调的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)提供测试组和空白对照组，将加入测试物的培养体系作为测试组，在测试物存在的情况下，培养非多能细胞；将不加入测试化合物的培养体系作为空白对照组，在不添加该测试物的情况下，培养非多能细胞，空白对照组与测试组其他的条件相同；(b)检测测试组、空白对照组中转座子rna的降解情况，其中测试组的转座子rna的表达量记为c1，空白对照组的转座子rna的表达量记为c0；和(c)比较测试组和空白对照组的转座子rna降解水平，如果测试组的转座子rna的表达量显著低于空白对照组的转座子rna的表达量；则提示所述化合物为能够促进哺乳动物非多能细胞中sall4基因上调的潜在化合物。6.一种用权利要求1的筛选方法获得的具有cd3254活性的化合物。7.一种由哺乳动物非多能细胞培养诱导多能干细胞的方法，其特征在于，在细胞适合生长的条件和rxra激活剂存在下，培养哺乳动物非多能细胞，获得诱导的多能干细胞。8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有活性成分，和药学上可接受的载体，其中，所述的活性成分包括rxra激活剂和选自下组的一种或多种试剂：(i)hdac抑制剂；
(ii)gsk-3α/β抑制剂；(iii)tgf-β-ri/alk5抑制剂；(iv)腺苷酸环化酶激活剂；(v)rarα激动剂。9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于激活rna外切体复合物；促进sall4基因表达；促进细胞重编程；促进诱导多能干细胞的多能标志物表达；和/或治疗或降低炎症反应。10.一种用于促进细胞重编程的试剂盒，其特征在于，包括(1)rxra激活剂试剂，和(2)选自下组的一种或多种试剂：(i)hdac抑制剂；(ii)gsk-3α/β抑制剂；(iii)tgf-β-ri/alk5抑制剂；(iv)腺苷酸环化酶激活剂；和(v)rarα激动剂。

技术总结
本发明涉及利用CD3254激活RNA外切体驱动体细胞重建多能性。具体地，本发明提供了一种由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法，所述方法包括将起始细胞与包含RXRa激活剂的试剂组合接触，促进细胞化学重编程，激活RNA外切体驱动体细胞重建多能性。活RNA外切体驱动体细胞重建多能性。


技术研发人员：祝赛勇 金燕
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/13