制造蛋白质的方法与流程

制造蛋白质的方法
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2020年8月14日提交的美国临时申请号63/066,127以及2021年1月7日提交的美国临时申请号63/199,547的优先权权益，将其各自通过引用以其整体并入本文。通过efs-web电子提交的序列表的引用
2.与本技术一起提交的ascii文本文件(名称：3338_205pc02_seqlisting_st25.txt；大小：25,078字节；以及创建日期：2021年8月10日)的以电子提交的序列表的内容通过引用以其整体并入本文。


背景技术：

3.蛋白质治疗剂的市场显著增长，发展步伐不断加快。然而，对于本行业来说，维持所需质量属性(例如，糖基化)同时维持数量、降低生产成本并提供生产灵活性是一项挑战。为了继续满足市场需求，需要高效生产规模的蛋白质治疗剂的生产。
4.糖基化是所有蛋白质翻译后修饰(ptm)中最丰富的一种。它是由于将糖残基添加到蛋白质侧链中以形成糖蛋白而产生的。哺乳动物糖蛋白寡糖通常由有限数量的单糖构成，但是它们的结构多样性很大，主要是因为它们经常形成复杂的分支模式。
5.糖基化在许多特定的生物学功能(包括免疫防御、受精、病毒复制、寄生生物感染、细胞生长、炎症和细胞-细胞粘附)中起着重要作用。对于药物糖蛋白，糖基化会影响蛋白质构象的稳定性、清除率、对蛋白水解的保护，并且改善蛋白质的溶解度。由于不同的糖形可能具有不同的生物学特性，因此在生产过程中监测和控制糖基化的能力对于生物制药分子的质量至关重要。
6.然而，糖基化天然以一定程度的异质性存在，并且可以受到许多不同因素(如表达系统、工艺条件、培养基组成、补料方案、纯化过程或其任何组合)的影响。因此，需要改善包括培养和/或纯化在内的蛋白质制造过程，同时保持蛋白质的糖基化模式一致。


技术实现要素：

7.本公开文本涉及一种在蛋白质生产阶段期间提高蛋白质的产量和/或控制蛋白质的糖基化的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将能够表达所述蛋白质的细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括在约7.1与约7.2之间的ph设定点。在一些方面，所述ph设定点为约7.15。在一些方面，所述合适的条件进一步包括在约35℃与约37℃之间的初始温度设定点、在约32℃与约34℃之间的第二温度设定点和在约30℃至约32℃之间的第三温度设定点。在一些方面，所述合适的条件进一步包括在约0.5x106个细胞/ml与约1x106个细胞/ml之间的初始活细胞密度(vcd)设定点。在一些方面，所述合适的条件包括：(a)约36℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和约31℃的第三温度设定点；(b)约7.15的ph设定点；以及(c)约0.70x106个细胞/ml的初始活细胞密度(vcd)设定点。
8.本公开文本涉及一种控制细胞生长速率、细胞活力、活细胞密度和/或细胞滴度以
产生蛋白质的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在约7.15的ph设定点下在生物反应器中培养。在一些方面，所述合适的条件进一步包括：(i)约36.0℃的初始温度设定点和低于约36℃的第二温度设定点；(ii)低于约36.5℃的初始温度设定点和约31℃的最终温度设定点；或(iii)低于约36.5℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和低于约33℃的最终温度设定点。在一些方面，所述合适的条件进一步包括将所述细胞在约36℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和约31℃的最终温度设定点培养。在一些方面，所述合适的条件进一步包括约0.70x106个细胞/ml的初始活细胞密度(vcd)设定点。
9.本公开文本还涉及在蛋白质生产阶段期间提高贝他西普的产量和/或控制贝他西普的糖基化的方法，所述方法包括将能够表达贝他西普的细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括：(a)约36℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和约31℃的第三温度设定点；(b)约7.15的ph设定点；和(c)约0.70x106个细胞/ml的初始活细胞密度(vcd)设定点。
10.在一些方面，所述合适的条件进一步包括在约80小时的第一补料时间。在一些方面，所述第三或最终温度设定点发生在约204小时与约276小时之间。在一些方面，第三或最终温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约204小时、约216小时、约228小时、约240小时、约252小时、约264小时或约276小时。在一些方面，所述第三最终温度设定点为约31℃并且在约240小时之后发生。在一些方面，所述第二温度设定点发生在约72小时与约168小时之间。在一些方面，所述第二温度设定点发生在约72小时、约78小时、约84小时、约90小时、约96小时、约102小时、约108小时、约114小时、约120小时、约126小时、约132小时、约138小时、约144小时、约150小时、约156小时、约162小时或约168小时。在一些方面，在约140小时后所述第二温度设定点为约33℃。
11.在一些方面，与不采用所述合适的条件的参考方法相比，所述条件将所述蛋白质产量提高至少150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％或至少约400％。
12.在一些方面，所述合适的条件进一步包括所述生物反应器中的锰。在一些方面，所述锰的浓度为从约1.6十亿分率(ppb)至约15ppb。在一些方面，所述锰的浓度为约3ppb至约6ppb。
13.在一些方面，所述方法降低细胞生长速率。在一些方面，所述方法控制细胞活力。在一些方面，所述细胞活力展现出在约10.0x106个细胞/ml与约15.0x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，所述方法控制滴度。在一些方面，所述滴度展现出在约1.50g/l与约3.5g/l之间的最终滴度。在一些方面，所述滴度展现出大于约2.00g/l的最终滴度。
14.在一些方面，所述方法控制所述蛋白质的糖基化谱。在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种n-连接的聚糖。在一些方面，在所述蛋白质生产阶段期间测量所述糖基化谱。在一些方面，约每1天测量所述糖基化谱。在一些方面，当收获所述细胞培养物时测量所述糖基化谱。在一些方面，所述n-连接的聚糖包括：g0f、g1f、g2f、s1g1f、s1g2f、s2g2f或其任
何组合。在一些方面，所述蛋白质包含ctla4结构域。在一些方面，所述蛋白质是融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白包含fc部分。在一些方面，所述蛋白质是贝他西普。在一些方面，所述蛋白质包含与seq id no:5至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于选自贝他西普的asn76、asn108和/或asn207的一个或多个残基处。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖包含唾液酸，并且具有从约4至约10的nana的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖包含唾液酸并且具有从约5至约9、从约5.5至约8.5、从约5.8至约6.7、从约5.2至约7.5、从约6至约8、从约6.2至约7.4或从约5至约6的nana的摩尔比。在一些方面，所述nana的摩尔比为约6.8。在一些方面，所述糖基化谱是经由n-连接的碳水化合物谱方法分析的。在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种o-连接的聚糖。在一些方面，所述o-连接的聚糖位于残基ser129、ser130、ser136和/或ser139处。
15.在一些方面，所述方法以分批补料培养过程进行。在一些方面，将葡萄糖和/或半乳糖补充到所述生物反应器中的补料培养基中。在一些方面，将所述补料培养基定期添加到所述生物反应器中。在一些方面，约每24小时将所述补料培养基添加到所述生物反应器中。
16.在一些方面，所述方法以灌注过程进行。在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一些方面，所述哺乳动物细胞是cho-k1细胞、cho-dxb11细胞或cho-dg44细胞。
17.本公开文本还涉及一种分析ctla4-fc融合蛋白的聚糖的方法，所述方法包括测量与ctla4蛋白中的一个或多个天冬酰胺残基附接的一种或多种n-连接的聚糖，其中所述聚糖中的一种包括g0f、g1f、g2f、s1g1f、s1g2f和/或s2g2f。在一些方面，经由超高效液相色谱-荧光检测(uplc-flr)测量所述聚糖。在一些方面，在所述测量之前切割所述ctla4-fc融合蛋白的fc结构域。在一些方面，在所述测量之前不切割所述ctla4-fc融合蛋白的fc结构域。
18.在一些方面，通过本文所述的方法产生蛋白质。在一些方面，所述蛋白质包括ctla4-fc融合蛋白。在一些方面，所述蛋白质是贝他西普。在一些方面，通过本文所述的方法产生细胞。在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一些方面，所述细胞是cho-k1细胞、cho-dxb11细胞或cho-dg44细胞。
19.本公开文本还涉及一种用于制造通过本文所述的方法产生的蛋白质的生物反应器。在一些方面，所述生物反应器包含本文所述的细胞和细胞培养基，其中将所述生物反应器维持在约7.15的ph。在一些方面，将所述生物反应器维持在：(a)约36℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和约31℃的第三温度设定点；(b)约7.15的ph设定点；以及(c)约0.70x106个细胞/ml的初始活细胞密度(vcd)设定点。在一些方面，所述细胞培养基进一步包含锰。
附图说明
20.图1a示出了三个过程(过程a、过程b和过程x)的操作参数。图1b和图1c示出了过程a、过程b、过程x的另外的过程参数。
21.图2示出了在培养16天的上游生产期间测得的细胞培养物的唾液酸(nana)摩尔比。
22.图3a和图3b示出了贝他西普参考标准品(rs)洗脱的n-聚糖谱分析的全尺度和放大的代表性色谱图，其中标记了特定的聚糖(g0f、g1f、g2f、s1g1f和s2g2f)。
23.图4a和图4b示出了贝他西普rs洗脱的n-聚糖谱分析的全尺度和放大的代表色谱图，其中聚糖s1g1f(“s1g1f_2”)洗脱为两个峰。
24.图5示出了贝他西普的上游生产过程的概述。
25.图6a和6b示出了g0f(甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-岩藻糖)、g1f(甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-1-岩藻糖)、g2f(甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-2-岩藻糖)、s1g1f(单唾液酸化的甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-1-岩藻糖)、s1g2f(单唾液酸化的甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-2-岩藻糖)、s1g3f(单唾液酸化的甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-3-岩藻糖)和s2g2f(二唾液酸化的甘露糖-3-n-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-2-岩藻糖)的示例性结构。
具体实施方式
26.本公开文本涉及提高细胞中蛋白质的产量同时维持蛋白质的所需特性(例如，糖基化模式)的方法。特别地，本公开文本显示出在生物反应器中蛋白质生产期间，尤其是在蛋白质诱导阶段中，ph设定点的出乎意料的效果。在一些方面，所述提高产量的方法包括在蛋白质诱导阶段中将细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，所述合适的条件包括但不限于调节温度、设定ph、使用特定活细胞密度或其任何组合。i.定义
27.术语“和/或”在本文中使用的情况下被视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个一起的具体公开。因此，如在本文中以短语如“a和/或b”使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)、和“b”(单独)。同样，在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
28.应当理解，本文中无论用语言“包括/包含(comprising)”描述任何方面，还提供了以“由
……
组成”和/或“本质上由
……
组成”描述的其他类似方面。
29.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属技术的本领域技术人员通常所理解的相同的含义。例如，concise dictionary of biomedicine and molecular biology,juo,pei-show,第2版,2002,crc出版社；the dictionary of cell and molecular biology,第3版,1999,学术出版社；以及oxford dictionary of biochemistry and molecular biology,修订版,2000,牛津大学出版社，为本领域技术人员提供本公开文本中所使用的许多术语的一般解释。
30.单位、前缀和符号均以其国际单位制(si)可接受的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考作为整体的说明书而获得。因此，通过从整体上参考说明书，更全面地定义下文紧接着定义的术语。
31.替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一者、两者或其任何
组合。如本文中所用，不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”应被理解为是指任何所述或列举组分的“一个/一种或多个/多种”。
32.术语“约”或“基本上由
……
构成”是指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由
……
构成”可以意指在1个或多于1个标准差内。可替代地，“约”或“基本上由
……
构成”可以意指高达20％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指高达值的一个数量级或高达值的5倍。当在本技术和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应假定“约”或“基本上由
……
构成”的含义在该特定值或组成的可接受误差范围内。
33.如本文所述，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举范围内的任何整数及(在适当时)其分数(如整数的十分之一和百分之一)的值。
34.如本文所用，术语“ctla4细胞外结构域”是指与b7-1(cd80)和/或b7-2(cd86)结合的包含seq id no:1所示氨基酸序列的全部或部分的蛋白质结构域。在一些方面，ctla4细胞外结构域可以包含具有与seq id no:1至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。ctla4细胞外结构域由以下序列表示：seq id no:1[ctla4细胞外结构域]mhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyvidpepcpdsd
[0035]
如本文所用，术语“ctla4-ig”或“ctla4-ig分子”或“ctla4ig分子”或“ctla4-ig蛋白”或“ctla4ig蛋白”或“ctla4-fc”可互换使用，并且是指至少包含具有ctla4细胞外结构域和免疫球蛋白恒定区或其部分的ctla4-ig多肽的蛋白质分子。在一些方面，例如，ctla4-ig多肽至少包含seq id no:2的氨基酸序列。在某些方面，所述ctla4细胞外结构域和免疫球蛋白恒定区或其部分可以是野生型的或突变的或经修饰的。突变的ctla4-ig多肽是包含突变的ctla4细胞外结构域的ctla4-ig多肽。突变的ctla4ig分子至少包含突变的ctla4-ig多肽。在一些方面，所述ctla4细胞外结构域和免疫球蛋白恒定区或其部分可以是哺乳动物(包括人或小鼠)的。在一些方面，突变的ctla4细胞外结构域可以具有与seq id no:2、3、4、5、6、7或8中的任何一个或多个所示的ctla4细胞外结构域至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。所述多肽可以进一步包含另外的蛋白质结构域。ctla4-ig分子可以指ctla4-ig多肽的单体，并且可以指所述多肽的多聚体形式，如二聚体、四聚体和六聚体等(或其他高分子量物质)。ctla4-ig分子也能够与cd80和/或cd86结合。ctla4-ig和片段(例如，贝他西普)的例子示于seq id no:2、3、4、5、6、7和8中。在一些方面，贝他西普是seq id no:2、3、4、5、6、7和8的组合。seq id no:2[ctla4
a29yl104e-ig氨基酸序列]mgvlltqrtllslvlallfpsmasmamhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkytevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyyegigngtqiyvidpepcpdsdqepkssdkthtsppspapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqksl
slspgkseq id no:3[seq id no:2的氨基酸25-383]mamhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkytevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyyegigngtqiyvidpepcpdsdqepkssdkthtsppspapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseq id no:4[seq id no:2的氨基酸26-383]amhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkytevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyyegigngtqiyvidpepcpdsdqepkssdkthtsppspapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseq id no:5[seq id no:2的氨基酸27-383]mhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkytevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyyegigngtqiyvidpepcpdsdqepkssdkthtsppspapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseq id no:6[seq id no:2的氨基酸25-382]mamhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkytevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyyegigngtqiyvidpepcpdsdqepkssdkthtsppspapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgseq id no:7[seq id no:2的氨基酸26-382]amhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkytevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyyegigngtqiyvidpepcpdsdqepkssdkthtsppspapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgseq id no:8[seq id no:2的氨基酸27-382]mhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkytevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyyegigngtqiyvidpepcpdsdqepkssdkthtsppspapellggssvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgseq id no:9[具有a29y和l104e突变的ctla4细胞外结构域]mhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkytevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgt
ssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyyegigngtqiyvidpepcpdsd
[0036]
如本文所用，术语“可溶性ctla4”意指可以在体内循环的分子或不与细胞膜结合的ctla4。例如，可溶性ctla4可以包括包含与ig连接的ctla4胞外区的ctla4-ig。
[0037]
如本文所用，术语“二聚体”是指由连接或接合在一起的两种ctla4-ig多肽或单体构成的ctla4-ig蛋白或ctla4-ig分子。单体或二聚体之间的连接可以是非共价连接或相互作用、共价连接或相互作用(例如，一个或多个二硫键)或两者。由两种相同单体构成的ctla4-ig蛋白或ctla4-ig分子是同二聚体。ctla4-ig同二聚体还涵盖包含序列可能略有不同的两种单体的分子。同二聚体涵盖这样的二聚体，其中连接在一起的单体具有基本上相同的序列。包含在同二聚体中的单体具有可比的结构同源性。例如，序列的差异可能是由于单体的n末端加工修饰所致。
[0038]
如本文所用，术语“谷氨酸盐”与“谷氨酸”可互换使用。
[0039]
如本文所用，asn76、asn108(ctla4区)和asn207(fc区)是指存在于贝他西普分子上的特定糖基化位点。这些标记分别对应于天冬酰胺76、天冬酰胺108和天冬酰胺，并且对应于seq id no:5中的残基。通常，使用五字符代码来定义碳水化合物结构类别，例如，p2100、p2120、p2121、p3131和p4142。关于此标记方案，代码中的第一个字符(p)将释放的碳水化合物定义为含有三甘露糖基(trimannosyl)核心结构的n-连接的结构。第二个字符表示与核心附接的n-乙酰葡糖胺(glcnac)单元的数量。第三个字符(0或1)表示是否具有与核心的第一个glcnac附接的岩藻糖(fuc)。第四个字符表示与核心附接的半乳糖(gal)的数量。第五个字符表示与碳水化合物附接的sa(n-乙酰神经氨酸或n-羟乙酰神经氨酸)的数量。p2100也可以表示为g0f。p2110也可以表示为g1f。p2120也可以表示为g2f。p2121也可以表示为s1g2f。p2122也可以表示为s2g2f。p3131也可以表示为s1g3f。p4142也可以表示为s2g4f。这些聚糖的代表性图可以在图6a和图6b中看到。
[0040]
如本文所用，术语“纯化的”是指包含这样的蛋白质(例如，ctla4-ig分子)或选定的蛋白质群体(例如，ctla4-ig分子)的组合物，所述蛋白质或选定的蛋白质群体被从其自然环境中移取出(例如，被分离)并且是至少90％不含、91％不含、92％不含、93％不含、94％不含、95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含、99.5％不含或99.9％不含天然关联的其他组分，如细胞材料或培养基。“纯化的”也可以指包含这样的蛋白质(例如，ctla4-ig分子)或选定的蛋白质群体(例如，ctla4-ig分子)的组合物，所述蛋白质或选定的蛋白质群体被从其自然环境中移取出并且是至少60％不含、65％不含、70％不含、75％不含、80％不含或85％不含天然关联的其他组分，如细胞材料或培养基。例如，关于重组产生的蛋白质，例如ctla4-ig蛋白质分子，术语“纯化的”也可以指包含这样的蛋白质(例如ctla4-ig蛋白质分子)的组合物，所述蛋白质被从其生产环境中移取出使得所述蛋白质分子至少90％不含、91％不含、92％不含、93％不含、94％不含、95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含、99.5％不含或99.9％不含并非目的seq id no:2多肽或seq id no:2突变多肽的蛋白质分子。“纯化的”不排除蛋白质(例如ctla4-ig分子(如二聚体))与其他变体蛋白质(例如ctla4-ig分子(如四聚体))的混合物。“纯化的”不排除与蛋白质(例如ctla4-ig分子)组合的药学上可接受的赋形剂或载体，其中所述蛋白质(例如ctla4-ig分子)已经从其天然环境中取出。
[0041]
如本文所用，术语“大规模过程”与术语“工业规模过程”可互换使用。术语“培养器
皿”与“生物反应器”、“反应器”和“罐”可互换使用。以工业规模使用的生物反应器可以是至少2,000l、至少5,000l、至少10,000l、至少15,000l、至少20,000l、至少25,000l或适于生产工业供应量所需的大生产规模的任何尺寸。
[0042]“液体培养物”是指在支持物上生长或在液体营养培养基中悬浮生长的细胞(例如，细菌、植物、昆虫、酵母或动物细胞)。
[0043]“种子培养物”是指为了用于接种较大体积的培养基而生长的细胞培养物。种子培养物可用于接种较大体积的培养基，以便扩大培养物中生长的细胞(例如，悬浮生长的细胞)的数量。
[0044]
如本文所用，术语“培养基”和“细胞培养基”以及“补料培养基”和“发酵培养基”是指用于使细胞生长和或维持细胞(尤其是哺乳动物细胞)的营养溶液。不受限制，这些溶液通常提供来自以下类别中的一类或多类的至少一种组分：(1)能量来源，通常以碳水化合物如葡萄糖的形式；(2)所有必需氨基酸，并且通常是二十个氨基酸加半胱氨酸的基本集合；(3)以低浓度需要的维生素和/或其他有机化合物；(4)游离脂肪酸或脂质，例如亚油酸：和(5)微量元素，其中微量元素被定义为通常以非常低浓度(通常在微摩尔范围内)需要的无机化合物或天然存在的元素。营养溶液可以选择性地补充来自以下任何类别的一种或多种组分：(1)激素和其他生长因子，如血清、胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；(2)盐，例如镁盐、钙盐和磷酸盐；(3)缓冲液，如hepes；(4)核苷和碱基，如腺苷、胸苷和次黄嘌呤；(5)蛋白质和组织水解物，例如可以从纯化的明胶、植物材料或动物副产物中获得的蛋白胨或蛋白胨混合物；(6)抗生素，如庆大霉素；(7)细胞保护剂，例如普朗尼克多元醇(pluronic polyol)；和(8)半乳糖。可商购的培养基如ham's f10(sigma)、极限必需培养基((mem)，(sigma))、rpmi-1640(sigma)和杜氏改良伊格尔培养基((dmem)，(sigma))适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中所述的任何培养基作为宿主细胞的培养基：ham等人,meth.enz.58:44(1979)，barnes等人,anal.biochem.102:255(1980)。也可以以适当的浓度包含任何其他必要的补充剂。
[0045]
如本文所用，“培养”是指使一种或多种细胞在限定的或受控的条件下体外生长。可以定义的培养条件的例子包括温度、气体混合物、时间和培养基配制品。
[0046]
如本文所用，“扩增”是指出于在培养物中获得更多数量的细胞的目的，在体外培养一种或多种细胞。
[0047]
如本文所用，“温度设定点”是指用于使细胞生长和/或产生蛋白质产物的生物反应器或其他上游处理器皿的温度设定。可以在细胞培养开始时确立温度设定点，在这种情况下也可以将其称为“初始温度设定点”。可以使用序列编号(即，第二温度设定点或随后的第三温度设定点)来指代细胞培养期间初始温度设定点之后的后续温度变化。下游处理之前的最后温度设定点也可以称为“最终温度设定点”。在一些情形下，过程可以包括初始温度设定点、第二温度设定点和第三(和最终)温度设定点。
[0048]
如本文所用，除非另有指示，否则“设定点”是指用于使细胞生长和/或产生蛋白质产物的生物反应器或其他上游处理器皿的初始条件设定。在细胞培养开始时确立设定点。由于生长期间细胞培养基条件的变化，在细胞培养期间在设定点之后的后续条件变化可能发生。例如，设定点可以是ph设定点。在一些方面，设定点是温度设定点。在一些方面，可以在整个细胞培养方法中维持所述设定点。在其他方面，可以维持所述设定点直到设定不同
的设定点。在其他方面，可以将所述设定点改变为另一个设定点。
[0049]
如本文所用，“群体”是指两个或更多个分子(“分子群体”)或细胞(“细胞群体”)的组，其特征在于存在或不存在一种或多种可测量或可检测特性。在同质群体中，群体中的分子或细胞表征为相同或基本相同的特性(例如，克隆细胞系的细胞)。在异质群体中，群体中的分子或细胞表征为至少一种相同或基本相同的特性，其中所述细胞或分子还可以展现出不相同的特性(例如，蛋白质群体ctla4-ig分子，具有基本相似的平均唾液酸含量但是具有不相似的甘露糖含量)。
[0050]
如本文所用，“高分子量聚集体”与“高分子量物质”或“hmw”可互换使用，是指包含至少三个ctla4-ig单体的ctla4-ig分子。例如，高分子量聚集体可以是四聚体、五聚体或六聚体。
[0051]
如本文所用，“蛋白a”是指大约42kda并且与免疫球蛋白的fc部分非常强力地结合的蛋白，并且其在抗体纯化中的用途是本领域熟知的。蛋白a已经在本领域中广泛用于纯化。(boyle等人,1993；hou等人1991)。当应用于蛋白a时，术语“残留的”或“rpa”是指由于其在制造过程中的进一步上游纯化目的蛋白或抗体中的使用而存在于混合物中的任何剩余蛋白a。
[0052]
如本文所用，“蛋白质产量”或“产量”是指从培养过程，即生物反应器细胞培养过程中收获的目的蛋白质的总量。“蛋白质产量”或“产量”还可以指在本文公开的方法之后回收的目的蛋白的总量，并且可以通过质量(即，克)来测量。
[0053]
如本文所用，“滴度”或“蛋白质滴度”是指溶液中目的蛋白的浓度。例如，在上游培养过程(即生物反应器)中的目的蛋白的浓度的测量表示该时刻的蛋白质滴度。可以在固定体积中以浓度形式(例如，mg/ml)测量滴度。
[0054]
如本文所用，“糖基化含量”是指与蛋白质分子(如糖蛋白，像ctla4-ig分子)共价附接的n-连接的或o-连接的糖残基的量。
[0055]
如本文所用，“糖基化”是指在多肽链内的特定位点处将复杂的寡糖结构添加到蛋白质中。蛋白质的糖基化和添加的碳水化合物的后续加工会影响蛋白质的折叠和结构、蛋白质的稳定性(包括蛋白质的半衰期)以及蛋白质的功能特性。根据发生修饰的序列情境，蛋白质糖基化可以分为两类：o-连接的糖基化和n-连接的糖基化。o-连接的多糖与羟基连接，通常与丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接。不将o-聚糖添加到每个丝氨酸和苏氨酸残基中。o-连接的寡糖通常是单触角或双触角，即它们包含一个或最多两个分支(触角)，并且包含一至四个不同种类的糖残基，所述糖残基被逐个添加。n-连接的多糖与天冬酰胺的酰胺氮附接。只有作为两种三肽序列(天冬酰胺-x-丝氨酸或天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸))之一的一部分的天冬酰胺才是糖基化的靶标。n-连接的寡糖可以具有一至四个分支，称为单触角、二触角、三触角、四触角。在n-连接的寡糖和o-连接的寡糖中发现的糖残基的结构不同。尽管具有该差异，但是n-连接的多糖和o-连接的多糖的每个分支上的末端残基都可以通过唾液酸分子修饰，所述修饰称为唾液酸封端。唾液酸是独特的九碳单糖家族的通用名称，可以与其他寡糖连接。两个家族成员是n-乙酰神经氨酸(缩写为neu5ac、neuac或nana)和n-羟乙酰神经氨酸(缩写为neu5gc或ngna)。唾液酸在人类中最常见的形式是nana。n-乙酰神经氨酸(nana)是存在于ctla4-ig分子中的主要唾液酸种类。然而，应当注意，在ctla4-ig分子中也存在少量但可检测水平的n-羟乙酰神经氨酸(ngna)。
此外，本文所述的方法可用于确定nana和ngna两者的唾液酸的摩尔数，因此测定和报告ctla4-ig分子的nana和ngna两者的水平。n-连接的寡糖和o-连接的寡糖具有不同数量的分支，这些分支提供了唾液酸分子可以附接的不同数量的位置。n-连接的寡糖可以提供多达四个唾液酸附接位置，而o-连接的寡糖可以提供两个唾液酸附接位点。
[0056]
如本文所用，计算术语“唾液酸与蛋白质的摩尔比”或“mr”，并且以每摩尔蛋白质(ctla4-ig分子)或二聚体的唾液酸分子的摩尔数给出。
[0057]
如本文所用，术语“糖蛋白”是指通过添加一种或多种碳水化合物(包括添加一种或多种糖残基)而被修饰的蛋白质。
[0058]
如本文所用，术语“唾液酸化”是指将唾液酸残基添加到蛋白质(包括糖蛋白)中。
[0059]
如本文所用，术语“糖蛋白亚型”是指由其碳水化合物和唾液酸含量表征的分子，如通过等电聚焦(ief)凝胶电泳或其他合适的方法测定以通过其分子量、电荷和/或其他特征来区分混合物中的不同蛋白质。例如，在ief凝胶上观察到的每个不同的条带表示具有特定等电点(pi)并因此具有相同的净总电荷的分子。糖蛋白亚型可以是在ief凝胶上观察到的不同条带，其中每个条带可以是具有特定pi的分子群体。
[0060]
如本文所用，术语“β多肽”是指这样的突变ctla4-ig多肽，其(1)包含seq id no:1的氨基酸序列(其中位置29处的氨基酸突变为酪氨酸，并且位置104处的氨基酸突变为谷氨酸，任选地具有各种另外的突变)和免疫球蛋白恒定区或其一部分：和(2)能够与cd80和/或cd86结合。在一些方面，例如，β多肽至少包含ctla4
a29yl104e-ig的细胞外结构域的氨基酸序列(如seq id no:9所示)。β多肽的非限制性例子包括贝他西普和seq id no:2-8。在某些方面，免疫球蛋白恒定区或其部分可以是野生型的或突变的或经修饰的。在某些方面，免疫球蛋白恒定区或其部分可以是哺乳动物(包括人或小鼠)的。β多肽的另外的非限制性例子包括包含在免疫球蛋白恒定区或其部分中的一个或多个氨基酸突变(例如，seq id no:2的半胱氨酸120的取代)的β多肽，和包含在seq id no:1的氨基酸位置25、30、93、96、103或105中的一个或多个处的另外的突变的β多肽。β多肽分子包含β多肽。β多肽分子可以指β多肽的单体和β多肽的多聚体形式，如二聚体、四聚体和六聚体等。例如，贝他西普包含β多肽分子。β多肽分子进一步描述于2019年12月17日授权的美国专利号10,508,144中，将其通过引用以其整体特此并入。
[0061]“效力”是指响应随配体浓度变化的量度。例如，激动剂效力被量化为产生最大效应一半的配体的浓度(ec
50
)。效力的非限制性药理学定义包括亲和力和功效的组分，其中，功效是药物一旦结合就引起反应的能力。效力与亲和力相关，但是效力和亲和力是药物作用的不同量度。
[0062]
如本文所用，“药学上可接受的载体”是指用于药理学活性剂的媒介物。载体有助于将活性剂递送至靶位点，而不会终止所述药剂的功能。合适形式的载体的非限制性例子包括适用于外用施用的溶液、乳膏、凝胶、凝胶乳剂、胶冻剂(jelly)、糊剂、洗剂、药膏、喷雾剂、软膏、散剂、固体混合物、气溶胶、乳剂(例如油包水或水包油)、凝胶水溶液、水溶液、混悬剂、搽剂、酊剂和贴剂。
[0063]
如本文所用，短语“药学上可接受的组合物”(或“药物组合物”)是指对于药物施用(如，施用于人类)可接受的组合物。除任何一种或多种活性剂外，这种组合物还可以包括作为不超过对于药物施用可接受的水平的水平(这种水平包括不存在此类杂质的情况)的杂
质的物质，并且可以包括药学上可接受的赋形剂、媒介物、载体和其他非活性成分，例如，以配制便于施用的这种组合物。例如，药学上可接受的ctla4-ig组合物可以包括mcp-1或dna，只要这些物质处于对于施用于人可接受的水平即可。
[0064]“原料药”是包含在药物组合物中的活性药物成分。术语“原料药”包括呈溶液和/或缓冲形式的活性药物成分。“药物产品”是被配制用于药物施用的含有原料药的药物组合物。出于在本文中可提及原料药和/或药物产品的实施例和其他地方中包含的测定的目的，可以测定的示例性原料药和药物产品如下。
[0065]
ctla4ig分子的示例性药物产品包括：冻干ctla4-ig蛋白(250mg/小瓶)药物产品的组成组分量(mg/小瓶)ctla4-ig蛋白262.5麦芽糖一水合物525磷酸二氢钠一水合物18.1氯化钠15.3盐酸调节至ph 7.5氢氧化钠调节至ph 7.5
[0066]
如本文所用，术语“接种”是指将细胞添加到培养基中以开始培养。
[0067]
如本文所用，细胞培养物的术语“诱导”或“诱导阶段”或“生长阶段”是指在上游细胞培养开始时生物反应器的初始接种，并且包括其中细胞主要快速分裂的指数细胞生长期(例如，对数期)。在此阶段期间，活细胞密度的增加速率高于任何其他时间点。
[0068]
如本文所用，细胞培养物的术语“生产阶段”是指在此期间细胞生长静止或保持在接近恒定水平的时间段。在给定的时间段内，活细胞的密度保持大致恒定。对数细胞生长已终止，并且蛋白质生产是生产阶段期间的主要活动。此时的培养基通常被补充以支持持续的蛋白质生产并获得所需的糖蛋白产物。
[0069]
如本文所用，术语“表达(expression)”或“表达(expresses)”用于指发生在细胞内的转录和翻译。宿主细胞中产物基因的表达水平可以基于存在于细胞中的相应mrna的量或由细胞产生的由产物基因编码的蛋白质的量或两者来确定。
[0070]
如本文所用，“n-连接的聚糖”是指其中聚糖经由氮连接与糖缀合物连接的蛋白质修饰。聚糖的受体是分别进入周质或er内腔的多肽链的所选择的天冬酰胺残基。寡糖转移酶(n-糖基化途径的中心酶)催化寡糖与通过共有序列n-x-s/t指定的天冬酰胺残基的侧链酰胺形成n-糖苷连接。所有真核生物n-聚糖共享共同的核心序列manα1-3(manα1-6)manβ1-4glcnacβ1-4glcnacβ1-asn-x-ser/thr，并分为三种类型：(1)寡甘露糖型，其中仅man残基延伸核心；(2)复合型，其中glcnac引发的“触角”延伸核心；和(3)杂合型，其中man延伸核心的manα1-6臂，并且一个或两个glcnac延伸manα1-3臂。
[0071]
如本文所用，“n-连接的糖基化”是指寡糖与氮原子(通常为天冬酰胺残基的n4)的附接。n-糖基化可以发生在分泌的或膜结合的蛋白质上，主要发生在真核生物和古细菌中。用于产生n-连接的聚糖(例如，高甘露糖型寡糖)的生物合成途径和酶的详细综述描述于stanley等人，
″
n-glycans
″
in essentials of glycobiology，编辑varki，cummings，和eskho，cold spring harbor press，2009。
[0072]
如本文所用，术语“分批补料”、“分批补料培养”或“分批补料培养过程”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的某个时间向培养物提供另外的组分。可以使用基础培养基开始分批补料培养。在培养过程开始后的某个时间向培养物提供另外的组分的培养基是补料培养基。通常在某一点停止分批补料培养，并且收获并任选地纯化培养基中的细胞和/或组分。
[0073]
如本文所用，“灌注”或“灌注培养”或“灌注培养过程”是指生理营养液的连续流以稳定的速率穿过或经过细胞群。由于灌注系统通常涉及将细胞保留在培养单元内，因此灌注培养典型地具有相对较高的细胞密度，但是培养条件难以维持和控制。另外，由于使细胞生长到高密度并且在高密度下保留在培养单元内，因此生长速率通常会随时间持续降低，从而导致细胞生长的后期指数期或甚至静止期。这种连续培养策略通常包括在连续细胞培养系统中在生产阶段期间培养哺乳动物细胞(例如，非贴壁依赖性细胞)，表达目的多肽和/或病毒。
[0074]
如本文所用，术语“质谱法”是指用于基于分子的质荷比(m/z)来检测、鉴定和定量分子的灵敏技术。当它们沿着平行且等距的极或杆(如四极，其包含四个极或杆)的中心轴通过时，电场用于根据离子的质荷比(m/z)、质量与电荷的整数比(z)来分离离子。每个杆施加两个电压，其中一个是固定的直流电，并且第二个是以叠加的射频循环的交流电。可以对所施加电场的大小进行排序，使得只有具有特定m/z比的离子才能穿过四极，然后进行检测。具有所有其他m/z值的离子偏转到轨迹上，这将导致它们与四极杆碰撞并放电，或者从质量分析仪场喷射并经由真空去除。四极通常被称为专用检测器，因为在任何时候只有具有特定m/z的离子在四极中是稳定的。那些具有稳定轨迹的离子通常被称为具有非碰撞、共振或稳定轨迹。
[0075]
通常，对于三重四极质谱仪上的实验，第一四极(q1)被设定为仅通过样品中预期化学种类的具有指定m/z的离子(先驱离子)。第二四极(即，q2或碰撞单元)用于碎裂通过q1的离子。第三四极(q3)被设定为仅使对应于预期化学种类的预期碎裂产物的具有指定m/z的离子(片段离子)通至检测器。在一些方面，在质谱仪中将样品电离，以生成一种或多种质子化或去质子化的分子离子。在一些方面，一种或多种质子化或去质子化的分子带单电荷、带双电荷、带三电荷或带更高电荷。在一些方面，质谱仪是三重四极质谱仪。在一些方面，用于q1和q3的分辨率是单位分辨率。在其他方面，用于q1和q3的分辨率是不同的。在其他方面，用于q1的分辨率高于q3的单位分辨率。
[0076]
如本文所用，术语“荧光团”是指可在光激发时再发射光的荧光化合物。荧光团通常含有若干个组合的芳族基团，或含有具有若干个π键的平面或环状分子。两种常用的荧光团是2-ab(2-氨基苯甲酰胺)和2-aa(邻氨基苯甲酸或2-氨基苯甲酸)。其他荧光团包括pa(2-氨基吡啶)、amac(2-氨基吖啶酮)、ands(7-氨基-1,3-萘二磺酸)、ants(8-氨基萘-1,3,6-三磺酸)、apts(9-氨基芘-1,4,6-三磺酸)和3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶。
[0077]
如本公开文本中使用的“聚糖谱”应理解为可以用于与源自另一样品或样品组的参考值或谱比较的聚糖的定量结果的值的任何定义集。例如，来自蛋白质样品的样品的聚糖谱可能与来自替代来源的样品的聚糖谱显著不同。聚糖谱可以通过将该谱与参考或标准谱进行比较来帮助预测或预期蛋白质的药效学(pd)或药代动力学(pk)治疗效果。可以通过能够检测聚糖的任何分析仪器(如质谱)来生成参考和样品聚糖谱。所述一种或多种n-聚糖
可以是半乳糖(gal)、n-乙酰半乳糖胺(galnac)、半乳糖胺(galn)、葡萄糖(glc)、n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)、葡萄糖胺(glcn)、甘露糖(man)、n-乙酰甘露糖胺(mannac)、甘露糖胺(mann)、木糖(xyl)、n-乙酰神经氨酸(neu5ac)、n-羟乙酰神经氨酸(neu5gc)、2-酮-3-脱氧壬酸(kdn)、岩藻糖(fuc)、葡萄糖醛酸(glca)、艾杜糖醛酸(idoa)、半乳糖醛酸(gala)、甘露糖醛酸(mana)或其任何组合。
[0078]
如本文所用，短语“一种或多种工作溶液”是指在方法中使用的溶液。工作溶液的非限制性例子包括缓冲液。
[0079]
如本文所用，“参考材料”是指在方法中用作标准品的材料。例如，可以将参考材料用作将实验样品与之比较的标准品。
[0080]
如本文所用，“参考方法”或“参考过程”是指使用相同的方法(不同之处在于用于过程x的条件)生产相同蛋白质的过程或方法。例如，参考过程或方法可以是实施例1(过程a)、实施例1b(过程b)和/或实施例1c(过程c)中所述的过程。如本文所用，参考方法可以用作将本公开文本的方法与之比较的基线。
[0081]
在不提供关于物质的量的范围的下限的情况下，考虑不存在这种物质。
[0082]
如本文所用，关于细胞培养所列举的温度是指在调节生物反应器温度的仪器上的温度设定。当然，液体培养物本身的温度将采用在调节生物反应器温度的仪器上设定的温度。在温度提及在培养箱中的架子上维持的细胞培养物的情况下，则温度是指培养箱的架子温度。ii.改善蛋白质生产的方法
[0083]
本公开文本提供改善细胞培养系统中的蛋白质生产阶段从而提高蛋白质的产量的方法。因此，本文公开的方法能够提高细胞培养性能，即，本发明方法的结果是细胞培养性能的任何期望的提高。举例来说，提高的细胞培养性能包括但不限于以下中的任何一种或多种：蛋白质产量增加；蛋白质滴度增加；细胞比生产率增加；最大细胞密度增加；高分子量物质减少；单体物质增加；细胞活力增强；培养基和/或cdfm中的沉淀减少：通过例如糖基化谱和尺寸排阻色谱确定的总体产品品质提高：和总体批次间一致性增强。在一些方面，所述方法包括在蛋白质诱导阶段和/或蛋白质生产阶段中将能够表达所述蛋白质的细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括但不限于初始温度设定点的调节、第二温度设定点的调节、最终温度设定点的调节、补料时间的调节、ph设定点的调节、初始细胞密度的调节或其任何组合的调节。在一些方面，本公开文本提供了提高细胞中蛋白质产量的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在合适条件下在生物反应器中培养，其中所述合适条件包括约7.15的ph设定点。
[0084]
本公开文本的方法可用于产生反应器条件，其中所述反应器条件提高蛋白质产量。在一些方面，与不采用所述合适的条件的参考方法相比，所述条件将所述蛋白质产量提高至少150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％或至少约400％，其中所述合适的条件包括将ph设定点调节至例如约7.15。在一些方面，所述合适的条件进一步包括初始活细胞密度的调节(例如，0.70x106个细胞/ml)，和/或初始、
第二和最终温度设定点的调节(例如，36℃、33℃和31℃的温度设定点)。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少150％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少160％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少170％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少180％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少190％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少200％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少210％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少220％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少230％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少240％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少250％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少260％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少270％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少280％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少290％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少300％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少310％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少320％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少330％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少340％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少350％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少360％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少370％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少380％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少390％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少400％。
[0085]
在一些方面，与不采用合适的条件的参考方法(例如，约7.15的ph设定点)相比，本发明方法将蛋白质产量提高至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
[0086]
在一些方面，合适的条件包括ph设定点的调节(至例如约7.15)、初始活细胞密度的调节(例如0.70x106个细胞/ml)和/或初始、第二和最终温度设定点的调节(例如36℃、33℃和31℃的温度设定点)，其中所述方法将蛋白质产量提高约2倍至约10倍，例如约2倍至约5倍、约3倍至约5倍或约2倍至约4倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约2倍至约3倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约3倍至约4倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约4倍至约5倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约5倍至约6倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约6倍至约7倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约7倍至约8倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约8倍至约9倍。
[0087]
本公开文本的方法还可用于增加作为总宿主细胞蛋白质部分的总蛋白质输出，从而实现每批更大的蛋白质产量。在一些方面，本公开文本的方法还可用于基于蛋白质在高尔基体中的驻留时间和向糖基化酶的暴露的改变而增加具有所需糖基化模式的总蛋白质输出。在一些方面，与不采用所述合适的条件的参考方法相比，所述条件将具有所需糖基化谱的蛋白质的蛋白质产量提高至少150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％或至少约400％；例如ph设定点的调节(例如约7.15的ph)、初始活细胞密度的调节(例如0.70x106个细胞/ml)和/或初始、第二和最终温度设定点的调节(例如36℃、33℃和31℃的温度设定点)。
[0088]
本公开文本的方法还可用于在蛋白质生产期间控制活细胞密度或峰值活细胞密度。在一些方面，“控制活细胞密度或峰值活细胞密度”意指将活细胞密度维持在以细胞/ml计的某些范围。在一些方面，细胞活力展现出在约5x106个细胞/ml至约21x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出在约6x106个细胞/ml至约20x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出在约7x106个细胞/ml至约19x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出在约8x106个细胞/ml至约18x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出在约9x106个细胞/ml至约17x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出在约10x106个细胞/ml至约16x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出在约10x106个细胞/ml至约15x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出在约11x106个细胞/ml至约15x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出在约12x106个细胞/ml至约14x106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。
[0089]
在一些方面，细胞活力展现出约6x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约8x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约10x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约10.5x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约11x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约11.5x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约12x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约12.5x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约13x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约13.5x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约14x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约14.5x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。在一些方面，细胞活力展现出约15x106个细胞/ml的平均峰值活细胞密度(vcd)。
[0090]
本公开文本的方法还可用于控制和/或监测蛋白质滴度。可以在生物反应器中培养细胞一定时间段(以在生物反应器中诱导蛋白质产生)后的一个或多个时间点(即在蛋白质生产阶段或蛋白质诱导阶段期间)测量滴度。在下游处理之前，也可以在收获培养物时测量滴度。在一些方面，在从蛋白质诱导阶段开始至少约一周后，在蛋白质诱导阶段期间测量滴度。在一些方面中，在蛋白质诱导阶段期间，在从蛋白质诱导阶段开始至少约10天、至少约两周或至少约三周后测量滴度。在一些方面，在从蛋白质诱导阶段开始约14天的时间段后测量滴度。在一些方面，所述滴度展现出约1.5g/l至约3.5g/l之间的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约1.5g/l至约3g/l之间的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2g/l至约3g/l之间的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2g/l至约2.5g/l之间的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2.5g/l至约3g/l之间的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2g/l的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2.5g/l的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约3g/l的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约3.5g/l的平均第14天滴度。
[0091]
在一些方面，能够表达蛋白质(例如重组蛋白)的细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述细胞是真核细胞。在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述细胞选自中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hek293细胞、小鼠骨髓瘤(ns0)、幼仓鼠肾细胞(bhk)、猴肾成纤维细胞(cos-7)、马-达二氏牛肾细胞(madin-darby bovine kidney cell，mdbk)及其任何组合。在一方面，所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。在一些方面，所述细胞是昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)细胞。在其他方面，所述细胞是哺乳动物细胞。此类哺乳动物细胞包括但不限于cho、vero、bhk、hela、mdck、hek 293、nih 3t3、w138、bt483、hs578t、htb2、bt2o和t47d、ns0、crl7o3o、cos(例如，cos1或cos)、per.c6、vero、hss78bst、hek-293t、hepg2、sp210、r1.1、b-w、l-m、bsc1、bsc40、yb/20、bmt10和hss78bst细胞。在一些方面，所述哺乳动物细胞是cho细胞。在一些方面，所述cho细胞是cho-dg44、chozn、cho/dhfr-、chok1sv gs-ko或cho-s。在一些方面，所述cho细胞是cho-dg4。在一些方面，所述cho细胞是chozn。本文公开的其他合适的cho细胞系包括cho-k(例如，cho k1)、cho pro3-、cho p12、cho-k1/sf、duxb11、cho dukx、pa-dukx、cho pro5、duk-bii或其衍生物。iia.ph
[0092]
在一些方面，本公开文本的方法涉及通过改变过程的ph来改善或控制蛋白质生产。在一些方面，所述方法涉及在细胞培养过程中改变蛋白质生产阶段的ph设定点。细胞内ph的调节是对细胞生长和代谢具有重要意义的基本生理过程。由于细胞内ph对营养物质和激素的运输以及细胞中的酶促反应具有广泛的影响，因此细胞将大量能量用于胞质ph的调节。此外，ph在细胞产生的蛋白质的糖基化速率和糖基化谱方面起作用。本公开文本通过控制蛋白质生产阶段中的ph设定点，提供了对蛋白质产量和/或蛋白质糖基化的出乎意料的影响。
[0093]
在一些方面，可用于本公开文本的ph设定点在约7.1与约7.2之间。在一些方面，所述ph设定点为约7.15。在一些方面，所述ph设定点为7.25。在一些方面，所述ph设定点为7.15。在一些方面，所述ph设定点为7.05。在一些方面，所述ph设定点为7.0。在一些方面，所述ph设定点为6。在一些方面，所述ph设定点为6.1。在一些方面，所述ph设定点为6.2。在一些方面，所述ph设定点为6.3。在一些方面，所述ph设定点为6.4。在一些方面，所述ph设定点为6.5。在一些方面，所述ph设定点为6.6。在一些方面，所述ph设定点为6.7。在一些方面，所述ph设定点为6.8。在一些方面，所述ph设定点为6.9。iib.温度
[0094]
生产器皿(如生物反应器)的温度可以是生物生产的另一个重要方面，因为生物反应器的温度在细胞内的细胞生长、活细胞密度、细胞寿命和/或糖基化酶的糖基化活性中起作用。温度变化会显著影响细胞内酶促反应的速率、使蛋白质变性和/或对细胞培养物产生其他影响。例如，可以将细胞在初始温度设定点(如37℃)培养，以促进最大活细胞密度，然后可以将温度修改为另一个温度设定点(即，第二温度设定点或最终温度设定点)以延长细胞寿命或增强细胞内所需的糖基化活性。可以在上游生产过程的各个阶段期间使用一个或多个温度设定点，以改善目的蛋白的总体细胞密度、蛋白质产量或蛋白质糖基化谱。在一些方面，所述方法涉及蛋白质生产期间的一次或多次温度调节。温度调节可以是制造过程期间操作温度的降低。温度调节也可以是在制造过程期间的操作温度的升高。在一些方面，本公开文本的方法在制造过程期间使用至少一次、至少两次、至少三次或至少四次温度调节。
[0095]
本公开文本的方法还涉及控制细胞生长速率、细胞活力、活细胞密度和/或细胞滴度以产生蛋白质。初始温度设定点对于在对数生长期期间创造有利于细胞扩增和细胞生长的反应器条件很重要。在初始对数期之后，使用低于初始设定点的第二温度设定点来降低细胞扩增条件，以防止细胞培养物的将导致不期望的细胞密度和随后的总细胞活力损失的过度生长。在一些方面，本公开文本的方法涉及在诱导阶段中将细胞在生物反应器中在约36℃的初始温度设定点下培养，随后将细胞在33℃的第二温度设定点下培养，最后将细胞在31℃的最终温度设定点下培养。在一些方面，本公开文本的方法使用至少两个、至少三个、至少四个或至少五个温度设定点，例如，初始温度设定点、最终设定点或在初始温度设定点之后但在最终设定点之前的更多个设定点。在一些方面，本公开文本的方法使用至少三个温度设定点，即，初始温度设定点、第二温度设定点和最终温度设定点。
[0096]
在一些方面，本发明方法的初始温度设定点为约37℃并且第二温度设定点低于约36℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36℃并且第二温度设定点低于所述第一温度设定点，例如约35℃、约34℃、约33℃、约32℃或约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约37℃并且第二温度设定点低于约34℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36℃并且第二温度设定点低于约35℃、约34℃或约33℃。在一些方面，所述初始温度设定点低于约36.5℃并且所述最终温度设定点为约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36.0℃并且所述最终温度设定点为约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点低于约35.5℃并且所述最终温度设定点为约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点低于约35.0℃并且所述最终温度设定点为约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点低于约36.5℃，第二温度设定点为约33℃，并且最终温度设定点低于约33℃或约32℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36.0℃，第二温度设定点为约33℃，并且最终温度设定点低于约33℃或约32℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36.0℃，第二温度设定点为约33℃，并且最终温度设定点低于约32℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36.0℃，第二温度设定点为约33℃，并且最终温度设定点为约31℃。
[0097]
本公开文本的方法可以包括初始温度设定点、第二温度设定点以及第三和/或最终设定点。初始、第二以及第三和/或最终温度设定点用于在制造过程期间进一步控制稳态细胞密度、控制活细胞百分比、管理培养物的细胞周期分裂和/或改变所产生的蛋白质的糖基化速率和糖基化谱。在一些方面，所述第三温度设定点低于所述第二温度设定点。在一些方面，初始温度设定点为34℃与37℃之间的温度，例如，34℃、35℃、36℃或37℃：第二温度设定点为32℃与34℃之间的温度，例如，32℃、33℃或34℃：并且最终温度设定点为30℃与32℃之间的温度，例如，30℃、31℃或32℃，其中，所述第二温度设定点低于所述第一温度设定点，并且所述最终温度设定点低于所述第二温度设定点。在一些方面，初始温度设定点为34℃与37℃之间的温度，例如，34℃、35℃、36℃或37℃：第二温度设定点为32℃与34℃之间的温度，例如，32℃、33℃或34℃：并且最终温度设定点为30℃与32℃之间的温度，例如，30℃、31℃或32℃，其中所述第一温度设定点不是37℃，所述第二温度设定点不是34℃，和/或所述最终温度设定点不是32℃。
[0098]
本公开文本的方法可以包括初始温度设定点、第二温度设定点、第三温度设定点以及任选地第四温度设定点、任选地第五温度设定点和任选地第六温度设定点。这些第四、第五和第六温度设定点用于在制造过程期间进一步控制稳态细胞密度、控制活细胞百分
比、管理培养物的细胞周期分裂和/或改变所产生的蛋白质的糖基化速率和糖基化谱。在一些方面，所述方法进一步包括设置任选的第四温度设定点、任选的第五温度设定点、任选的第六温度设定点，其中所述任选的第四温度设定点、所述第五温度设定点和/或所述第六温度设定点低于所述第三温度设定点。在一些方面，所述方法进一步包括设置任选的第四温度设定点、任选的第五温度设定点和任选的第六温度设定点，其中所述任选的第四温度设定点、所述第五温度设定点和/或所述第六温度设定点高于所述第三温度设定点。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点、所述第五温度设定点和/或所述第六温度设定点为约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃。在一些方面中，所述第四、第五或第六温度设定点、所述第五温度设定点和/或所述第六温度设定点为约30℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约31℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约32℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约33℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约34℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约35℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约36℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约37℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约38℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约39℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约40℃。
[0099]
除了温度设定点之外，本公开文本的方法还涉及修改温度设定点的时间设定，以在特定时间窗内进行温度转变。温度转变的时间设定对于控制上游过程期间细胞培养物的细胞密度、细胞生长和蛋白质生产特征很重要。在一些方面，本公开文本的方法涉及一种提高细胞中蛋白质的产量的方法，所述方法包括将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括(i)36.0℃的初始温度设定点和低于约36℃的第二温度设定点；(ii)低于约36.5℃的初始温度设定点和约31℃的最终温度设定点；或(iii)低于约36.5℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和低于约33℃的最终温度设定点。在一些方面，本公开文本的方法涉及一种提高细胞中蛋白质的产量的方法，所述方法包括将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括(i)36.0℃的初始温度设定点和低于34℃的第二温度设定点；(ii)低于36.5℃的初始温度设定点和31℃的最终温度设定点；或(iii)低于36.5℃的初始温度设定点、32℃的第二温度设定点和低于32℃的最终温度设定点。
[0100]
在一些方面，将细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，所述合适的条件包括(i)高于约35℃但低于约37℃的初始温度设定点和高于约32℃但低于约34℃的第二温度设定点，(ii)高于约35.5℃但低于约37.5℃的初始温度设定点和高于约32℃但低于约34℃的第二温度设定点，以及(iii)高于约35℃但低于约37℃的初始温度设定点，高于约32℃但低于约34℃的第二温度设定点，和高于约30℃但低于约32℃的最终温度设定点。
[0101]
本公开文本的方法还可用于通过在初始温度设定点之后调节生物反应器中的温度设定点来提高细胞中蛋白质的产量。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约120小时至约168小时之间，例如约5天、约6天或约7天。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约
32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约84小时、约90小时、约96小时、约102小时之间，约108小时、约114小时、约120小时、约126小时、约132小时、约138小时、约144小时、约150小时、约156小时、约162小时或约168小时。在一些方面，所述第二温度设定点发生在从约72小时至约168小时。在一些方面，所述第二温度设定点发生在从约96小时至约168小时。在一些方面，所述第二温度设定点发生在从约96小时至约144小时。
[0102]
在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约120小时，5天。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约144小时，6天。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约168小时，7天。在一些方面，所述第二温度设定点发生在初始温度设定点之后约192小时，例如8天。
[0103]
本公开文本的方法还用于控制到最终温度设定点的转变时间设定。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述最终温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述最终温度设定点发生在初始温度设定点之后从约168小时至约312小时、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天或约13天、从7天至12天、从8天至13天、从9天至13天、从8天至12天、从8天至11天。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述最终温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述最终温度设定点发生在从约192小时至约300小时。在一些方面，所述最终温度设定点发生在从约216小时至约288小时。在一些方面，所述最终温度设定点发生在从约216小时至约264小时。iic.活细胞密度
[0104]
在生物反应器过程开始时细胞的初始活细胞密度(vcd)或种子密度可以是上游生长过程的重要方面，因为在生产期间初始活细胞密度(vcd)影响细胞培养物的稳态和/或最大活细胞密度。较高的初始细胞密度可以导致在上游过程的初始生长阶段期间产生的细胞数量高得多，并且最终可以导致更快的细胞死亡和更短的生物反应器运行时间。生物反应器生产过程可以缩短，但是在一些情况下，对所述过程产生的蛋白质进行的翻译后修饰会受到影响，因为较短的生物反应器运行时间可导致蛋白质在高尔基体中的驻留时间改变，因此改变翻译后修饰，如蛋白质的糖基化模式的改变。由于初始细胞密度可能对蛋白质的总体产量和质量输出产生广泛的影响，因此初始活细胞密度是上游蛋白质生产的重要参数。
[0105]
在一些方面，本公开文本的方法涉及以初始活细胞密度(vcd)接种生物反应器。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.45x106个细胞/ml与约1.35x106个细胞/
ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.45x106个细胞/ml与约1.3x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.45x106个细胞/ml与约1.25x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.45x106个细胞/ml与约1.2x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.45x106个细胞/ml与约1.15x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.45x106个细胞/ml与约1.1x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.45x106个细胞/ml与约1.05x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.5x106个细胞/ml与约1.0x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.55x106个细胞/ml与约1.0x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.50x106个细胞/ml与约0.90x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.55x106个细胞/ml与约0.90x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.55x106个细胞/ml与约0.85x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.55x106个细胞/ml与约0.8x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.6x106个细胞/ml与约1.0x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.6x106个细胞/ml与约0.75x106个细胞/ml之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(vcd)设定点在约0.65x106个细胞/ml与约0.75x106个细胞/ml之间。iid.细胞补料时间
[0106]
本公开文本的方法还可以通过改变细胞补料时间以影响或控制细胞的生长条件来实现。补料过程的时间设定对于产生细胞培养物生产过程的所需生长特性(如细胞密度)很重要。生物反应器中的最佳补料策略取决于反应动力学的结构和不同反应(如蛋白质合成和这些蛋白质的翻译后修饰(即糖基化))之间的相互作用。对细胞群体过度补料和补料不足均不利于细胞生长和产物形成，因此补料的时间设定对于确保最大的产物产量可能很重要。培养物的补料不足可导致营养物质耗尽和细胞死亡，而过度补料可导致营养物质过剩、在密集的细胞环境中重量摩尔渗透压浓度和细胞应激增加、以及目的蛋白的不希望的翻译后修饰。
[0107]
在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约24小时至约100小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约48小时至约100小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约48小时至约72小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约48小时至约96小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约72小时至约96小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约66小时至约84小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约24小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约48小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约66小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约72小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约84小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约96小时。
[0108]
在一些方面，第一细胞补料时间为诱导后约80小时，并且此后约24小时发生一个或多个后续补料时间。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后104小时、诱导后128小时、诱导后152小时、诱导后176小时、诱导后200小时、诱导后224小时、诱导后248小时、诱导后272小时、诱导后296小时、诱导后320小时、诱导后344小时、诱导后368小时、诱导后392小时
和/或诱导后416小时。在一些方面，第一细胞补料时间为诱导后约74小时至约86小时，并且此后约24小时发生一个或多个后续补料时间。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约98小时至约110小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约122小时至约134小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约146小时至约158小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约170小时至约182小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约194小时至约206小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约218小时至约230小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约242小时至约254小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约266小时至约278小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约290小时至约302小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约314小时至约326小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约338小时至约350小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约362小时至约374小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约386小时至约396小时。在一些方面，所述后续补料时间为诱导后约410小时至约422小时。在一些方面，所述后续补料时间为根据图1b。iie.条件的组合
[0109]
在一些方面，本公开文本的方法包括以上所列条件的任何组合。在一些方面，所述方法包括选自以下的两种或更多种条件：(i)在约35℃与约37℃之间的初始温度设定点，例如约36℃，在32℃与约34℃之间的第二温度设定点，例如约33℃，和在约30℃与约32℃之间的第三温度设定点，例如约31℃；(ii)7.15的ph设定点；以及(iii)在约0.65x106个细胞/ml与约0.75x106个细胞/ml之间的初始活细胞密度(vcd)设定点。
[0110]
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间的初始温度设定点，例如约36℃，在32℃与约34℃之间的第二温度设定点，例如约33℃，和在约30℃与约32℃之间的第三温度设定点，例如约31℃，以及(ii)7.15的ph设定点。
[0111]
在一些方面，所述方法包括(i)约36℃的初始温度设定点，约33℃的第二温度设定点和约31℃的第三温度设定点以及(ii)在约0.65x106个细胞至约0.75x106个细胞之间(例如0.70x106个细胞)的初始活细胞密度(vcd)设定点。
[0112]
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间的初始温度设定点，例如约36℃，在32℃与约34℃之间的第二温度设定点，例如约33℃，和在约30℃与约32℃之间的第三温度设定点，例如约31℃；(ii)7.15的ph设定点；以及(iii)在约0.65x106个细胞至约0.75x106个细胞之间(例如0.70x106个细胞)的初始活细胞密度(vcd)设定点。
[0113]
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间的初始温度设定点，例如约36℃，在32℃与约34℃之间的第二温度设定点，例如约33℃，和在约30℃与约32℃之间的第三温度设定点，例如约31℃；(ii)7.15的ph设定点；(iii)在约0.65x106个细胞至约0.75x106个细胞之间(例如0.70x106个细胞)的初始活细胞密度(vcd)设定点：以及(iv)在约66至约84小时之间的第一补料时间。
[0114]
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间的初始温度设定点，例如约36℃，在32℃与约34℃之间的第二温度设定点，例如约33℃，和在约30℃与约32℃之间的第三温度设定点，例如约31℃；(ii)7.15的ph设定点；(iii)在约0.65x106个细胞至约0.75x106个细胞之间(例如0.70x106个细胞)的初始活细胞密度(vcd)设定点：以及(iv)约80小时的第一补料时间。
[0115]
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间的初始温度设定点，例如约36℃，在32℃与约34℃之间的第二温度设定点，例如约33℃，和在约30℃与约32℃之间的第三温度设定点，例如约31℃；(ii)7.15的ph设定点；(iii)在约0.65x106个细胞至约0.75x106个细胞之间(例如0.70x106个细胞)的初始活细胞密度(vcd)设定点：以及(iv)在约66至约84小时之间的第一补料时间。
[0116]
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间的初始温度设定点，例如约36℃，在32℃与约34℃之间的第二温度设定点，例如约33℃，和在约30℃与约32℃之间的第三温度设定点，例如约31℃；(ii)7.15的ph设定点；(iii)在约0.65x106个细胞至约0.75x106个细胞之间(例如0.70x106个细胞)的初始活细胞密度(vcd)设定点：以及(iv)约80小时的第一补料时间。iif.培养基
[0117]
可以使产生目的蛋白的细胞在细胞培养基中生长。如本文所用，术语“培养基(culture media)”(与“培养基(culture medium)”可互换使用)是指有助于维持、繁殖和/或分化细胞的营养组合物。术语“培养基”是指能够支持细胞在多细胞生物体或组织之外的人工体外环境中生长、维持、繁殖或扩增的任何介质。可以针对特定的细胞培养用途优化细胞培养基，包括例如被配制成促进细胞生长的细胞培养生长培养基，或被配制成促进重组蛋白产生的细胞培养生产培养基。培养基提供标准的无机盐(如锌、铁、镁、钙和钾)以及微量元素、维生素、能源、缓冲系统和必需氨基酸。示例性培养基包括但不限于伊斯科夫改良的杜氏培养基，rpmi 1640，极限必需培养基-α(mem-α)，杜氏改良的伊格尔培养基(dmem)，dme/f12，αmem，含厄尔bss的伊格尔基础培养基，含l-谷氨酰胺的高葡萄糖dmem，不含l-谷氨酰胺的高葡萄糖dmem，不含l-谷氨酰胺的低葡萄糖dmem，含l-谷氨酰胺的dmem:f12 1:1，gmem(格拉斯哥mem)，含l-谷氨酰胺的gmem，格雷斯完全昆虫培养基，不含fbs的格雷斯昆虫培养基，f-10，f-12，含l-谷氨酰胺的ham's f-10，含l-谷氨酰胺的ham's f-12，含hepes和l-谷氨酰胺的imdm，含hepes但不含l-谷氨酰胺的imdm，ipl-41昆虫培养基，不含l-谷氨酰胺或酚红的l-15(leibovitz)(2
×
)，不含l-谷氨酰胺的l-15(leibovitz)，mccoy's 5a改良的培养基，培养基199，不含l-谷氨酰胺或酚红(2
×
)的mem伊格尔，含l-谷氨酰胺的mem伊格尔-厄尔bss，不含l-谷氨酰胺的mem伊格尔-厄尔bss，不含l-谷氨酰胺的mem伊格尔-hanks bss，含l-谷氨酰胺的nctc-109，含l-谷氨酰胺的richter's cm培养基，含hepes、l-谷氨酰胺和/或青霉素-链霉素的rpmi 1640，含l-谷氨酰胺的rpmi 1640，不含l-谷氨酰胺的rpmi 1640，schneider's昆虫培养基或适用于本发明方法的任何其他培养基。此外，如本文所述的培养基包括但不限于化学成分确定的培养基、含水解产物的培养基和简单培养基。
[0118]
本公开文本的方法可以在各种器皿类型中进行，以适应各种蛋白质产生策略。本公开文本的方法可以涉及分批补料培养。分批补料培养是培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的某个时间向培养物提供另外的组分。可以使用基础培养基开始分批补料培养。在培养过程开始后的某个时间向培养物提供另外的组分的培养基是补料培养基。通常在某一点停止分批补料培养，并且收获并任选地纯化培养基中的细胞和/或组分。本公开文本的方法可以涉及灌注培养。灌注培养涉及生理营养液的连续流以稳定的速率穿过或经过细胞群体。由于灌注系统通常涉及将细胞保留在培养单元内，因此灌注培养典型地具有相对较高的细胞密度，但是培养条件难以维持和控制。另外，由于使细胞生长到高密度并且在高密
occidentalis)；和丝状真菌，例如像脉孢菌属(neurospora)、青霉属(penicillium)、弯颈霉属(tolypocladium)和曲霉属(aspergillus)宿主(如构巢曲霉(a.nidulans)和黑曲霉(a.niger))。
[0122]
在一些方面，所述细胞源自多细胞生物。在特定实施方案中，所述细胞是来自植物和昆虫细胞的无脊椎动物细胞。非限制性例子包括(也可以利用)源自以下的细胞：草地贪夜蛾(毛虫(caterpillar))、埃及伊蚊(aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(drosophila melanogaster)(果蝇)、家蚕(bombyx mori)、棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛(petunia)、番茄和烟草。
[0123]
在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。例如，所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)(包括描述于urlaub和chasin,(1980)pnas usa 77:4216-4220的dhfr-cho细胞，与dhfr选择性标记一起使用，例如如kaufman和sharp(1982)mol.biol.159:601-621中所述，将这些文献的全部传授内容通过引用并入本文)、nso骨髓瘤细胞、cos细胞和sp2细胞。哺乳动物细胞系的其他非限制性例子是经sv40转化的猴肾cv1系(cos-7，atcc crl 1651)；人胚肾系(293细胞或为悬浮培养生长而亚克隆的293细胞，graham等人,j.gen virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho，urlaub等人,proc.natl.acad.sci.usa 77:4216(1980))；小鼠塞托利细胞(tm4，mather,biol.reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(cv1，atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcc crl-1587)；人宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck，atcc ccl 34)；大鼠肝细胞(brl 3a，atcc crl1442)；人肺细胞(w138，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tri细胞(mather等人,annals n.y.acad.sci.383:44-68(1982))；mrc 5细胞；fs4细胞；和人肝细胞瘤系(hep g2)，将其全部传授内容通过引用并入本文。
[0124]
在一些方面，将细胞用表达载体或克隆载体转化以产生产物或其部分，并且在适当情况下进行培养以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。在一些方面，标准的分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染细胞、选择转化体、培养细胞以及从培养基中回收产物。在一些方面，本文所述的细胞培养基可用作杂交瘤细胞、单克隆抗体产生细胞、病毒产生细胞、经转染细胞、癌细胞和/或重组肽产生细胞的培养基。
[0125]
本公开文本的细胞可以在合适的条件下培养合适的时间段，所述条件取决于所培养的细胞和所产生的产物的一种或多种类型。在一些方面，将细胞培养约两天至约十四天。在一些方面，将细胞培养约四天至约十天。
[0126]
在一些方面，所述细胞培养物是悬浮培养物或贴壁培养物。术语“悬浮培养物”是指这样的培养物中的细胞，其中培养物中的大部分或全部细胞以悬浮形式存在，并且培养器皿中的少数细胞或没有细胞附着于器皿表面或器皿内的另一表面(贴壁细胞)。“悬浮培养物”可以具有大于约50％、60％、65％、75％、85％或95％的细胞悬浮，而不附着于培养器皿上或培养器皿中的表面。术语“贴壁培养物”是指这样的培养物中的细胞，其中培养物中的大部分或全部细胞附着于器皿表面或器皿内的另一表面存在，而培养器皿中的少数细胞或没有细胞悬浮。“贴壁培养物”可以具有大于50％、60％、65％、75％、85％或95％的细胞贴壁。
[0127]
用于产生重组蛋白的培养基可以包括适用于细胞培养基的一种或多种金属离子。
在一些方面，可以包含在细胞培养物中的金属离子为而不限于ag
+
、au
3+
、cd
2+
、cu
2+
、ga
3+
、in
3+
、ni
2+
、pd
2+
、zn
2+
和mn
2+
。在一些方面，在生物反应器过程开始时某些金属离子(例如，锰)的浓度可影响生产期间的生长和/或稳态细胞培养动力学。此外，金属离子(例如锰)可以影响在生物反应器中参与产生的蛋白质的糖基化的各种酶的通量。尤其是，锰是哺乳动物细胞中几种糖转移酶的已知辅因子，包括n-乙酰基-葡糖胺基-转移酶和β-1,4-半乳糖基-转移酶。因此，不受任何理论束缚，生物反应器过程中锰浓度的调节可影响蛋白质的糖基化分布和糖基化谱。在一些方面，将锰补充到生物反应器，即分批补料生物反应器中。在一些方面，在蛋白质诱导阶段开始时或期间，将锰补充到生物反应器中。
[0128]
在一些方面，本发明方法的锰的浓度为至少约30mg/ml、至少约50mg/ml、至少约80mg/ml、至少约100mg/ml、至少约110mg/ml、至少约120mg/ml、至少约130mg/ml、至少约140mg/ml、至少约150mg/ml、至少约160mg/ml、至少约170mg/ml、至少约180mg/ml、至少约190mg/ml、至少约200mg/ml、至少约220mg/ml、至少约240mg/ml、至少约260mg/ml、至少约280mg/ml或至少约300mg/ml。在一些方面，本公开文本的方法涉及将锰浓度调节至约30-300mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约30mg/ml至约280mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约50mg/ml至约280mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约50mg/ml至约260mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约70mg/ml至约260mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约90mg/ml至约240mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约120mg/ml至约240mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约120mg/ml至约220mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约140mg/ml至约220mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约140mg/ml至约200mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约160mg/ml至约200mg/ml。在一些方面，锰浓度为从约160mg/ml至约180mg/ml。在一些方面，锰浓度为约160mg/ml、约160mg/ml或约180mg/ml。
[0129]
还可以在上游细胞培养过程期间测量锰浓度。也可以在蛋白质生产阶段或蛋白质诱导阶段期间，即直接在生物反应器中测量锰。在一些方面，锰以约1-20十亿分率(ppb)的浓度存在。在一些方面，锰以约1.6ppb至约15ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约2ppb至约10ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约2ppb至约6ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约2ppb至约4ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约1ppb至约3ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约1ppb至约2ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约3ppb至约10ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约3ppb至约6ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约1.3ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约1.6ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约2ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约3ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约4ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约5ppb的浓度存在。在一些方面，锰以约6ppb的浓度存在。
[0130]
本公开文本还包括通过本发明方法产生的蛋白质。在一些方面，通过本发明方法产生的蛋白质是ctla4-fc融合蛋白。在一些方面，所述蛋白质包含贝他西普。在一些方面，通过本发明方法产生的蛋白质是糖基化的。在一些方面，所述糖基化蛋白在本文的其他地方示出。
[0131]
在一些方面，本公开文本包括通过本发明方法培养的细胞。还提供了可用于本发明方法的生物反应器。在一些方面，将所述生物反应器维持在：(a)约36℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和约31℃的第三温度设定点；(b)约7.15的ph设定点；以及(c)约0.70x106个细胞/ml的初始活细胞密度(vcd)设定点。
iii.糖基化谱
[0132]
本公开文本的方法和条件可用于影响、维持、控制和/或修饰通过本发明方法产生的蛋白质的糖基化谱。在一些方面，所述方法控制所述蛋白质的糖基化谱。在一些方面，所述蛋白质的糖基化谱包含一种或多种n-连接的聚糖。
[0133]
本公开文本的方法可以经由使用各种方法(包括聚糖释放测定)的聚糖分析来实现或证实。糖缀合物如糖蛋白的聚糖分析中的第一步是从它们所附接的分子中释放糖。糖蛋白上的n-连接的聚糖可以通过酰胺酶如肽-n-糖苷酶f(pngase f)释放。分析来自生物来源的寡糖的大多数方法都需要聚糖衍生化步骤：可以将聚糖衍生化以引入生色团或荧光团，从而有助于色谱分离或电泳分离后的检测。衍生化也可以用于在还原端连接带电基团或疏水基团，以增强聚糖分离和质谱检测。此外，衍生化步骤(如过甲基化)旨在稳定唾液酸残基、提高质谱灵敏度以及支持通过(串联)质谱的详细结构表征。
[0134]
在贝他西普的具体情况下，在聚糖衍生化后，可以将免疫球蛋白降解酶，如来自化脓链球菌(streptococcus pyogenes))的那些(ides)用于在铰链区正下方的一个特定位点处消化igg的铰链区，从而产生ctla4片段和两个fc片段。然后可以对分离的片段进行聚糖释放、衍生化和聚糖分析，其中可以一起分析asn76和asn108位点(ctla4区)，并且可以单独分析asn207(fc区)位点。
[0135]
质谱法(mass spectrometry)(“ms”或“质谱(mass-spec)”)是用于测量质荷比离子的分析技术。这可以通过以下方式来实现：电离样品并分离不同质量的粒子，并且通过测量离子流的强度来记录其相对丰度。典型的质谱仪包含三个部分：离子源、质量分析器和检测器系统。离子源是质谱仪中电离所分析物质(分析物)的部分。然后通过磁场或电场将离子运输至质量分析器，其根据离子的质荷比(m/z)来分离离子。许多质谱仪使用两个或更多个质量分析器进行串联质谱(ms/ms)。检测器记录离子经过或击中表面时诱导的电荷或产生的电流。质谱图是在用质量分析器扫描m/z离子时测量检测器中产生的信号的结果。
[0136]
蛋白质的糖基化谱中可以存在各种n-连接的聚糖。在一些方面，所述n-连接的聚糖包括g0f、g1f、g2f、s1g1f、s1g2f、s2g2f、s1g3f和/或s2g4f。g0f、g1f、g2f、s1g1f、s2g2f、s1g3f和s2g4f的代表性图可以在图6a-图6b中看到。在一些方面，本公开文本的方法涉及在蛋白质诱导阶段期间在蛋白质诱导阶段开始的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第9天、第20天或第21天之后测量糖基化谱。在一些方面，本公开文本的方法涉及在蛋白质诱导阶段开始的第7天之后测量糖基化谱。在一些方面，本公开文本的方法涉及在蛋白质诱导阶段开始的第14天之后测量糖基化谱。在一些方面，本公开文本的方法涉及在蛋白质诱导阶段开始的第21天之后测量糖基化谱。在一些方面，本公开文本的方法涉及在收获细胞培养物时测量糖基化谱。
[0137]
在一些方面，通过本发明方法产生的糖基化蛋白是ctla4蛋白。ctla4分子或ctla4细胞外结构域可以与fc融合，其中所述分子称为ctla4-fc或ctla4-ig。“fc区”(片段可结晶区)、“fc结构域”或“fc”是指抗体的重链的c末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的fc受体的结合或与经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。因此，fc区包含抗体的除了第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，ch1或cl)之外的恒定区。在igg、iga和igd抗体同种型中，fc区包含两个相同的蛋白
质片段，其衍生自抗体两条重链的第二(ch2)和第三(ch3)恒定结构域；igm和ige fc区在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(ch结构域2-4)。igg同种型在某些物种中分为如下亚类：人中的igg1、igg2、igg3和igg4，以及小鼠中的igg1、igg2a、igg2b和igg3。对于igg，fc区包含免疫球蛋白结构域ch2和ch3以及ch1和ch2结构域之间的铰链。如本文所定义的，尽管免疫球蛋白重链的fc区的边界的定义可能会发生变化，但是人igg重链的fc区被定义为从igg1的氨基酸残基d221、igg2的氨基酸残基v222、igg3的氨基酸残基l221和igg4的氨基酸残基p224延伸到重链的羧基末端，其中编号根据kabat编号方案。人igg fc区的ch2结构域从氨基酸237延伸至氨基酸340，并且ch3结构域位于fc区中的ch2结构域的c末端侧，即，其从igg的氨基酸341延伸至氨基酸447或446(如果不存在c末端赖氨酸残基)或445(如果不存在c末端甘氨酸和赖氨酸残基)。如本文所用，fc区可以是天然序列fc，包括任何同种异型变体或变体fc(例如，非天然存在的fc)。本公开文本的方法还可用于产生包含ctla4结构域的蛋白质。本公开文本的方法还可用于产生与fc部分融合的ctla4结构域。在一些方面，所述蛋白质是融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白包含fc部分。在一些方面，所述蛋白质是贝他西普。在一些方面，所述蛋白质包含选自seq id no:2-9的序列。在一些方面，所述蛋白质包含seq id no:2。在一些方面，所述蛋白质包含seq id no:3。在一些方面，所述蛋白质包含seq id no:4。在一些方面，所述蛋白质包含seq id no:5。在一些方面，所述蛋白质包含seq id no:6。在一些方面，所述蛋白质包含seq id no:7。在一些方面，所述蛋白质包含seq id no:8。在一些方面，所述蛋白质包含seq id no:9。
[0138]
通过本发明方法产生的ctla4-ig融合蛋白可以包含一个或多个突变。在一些方面，所述ctla4-ig融合蛋白是(a)具有seq id no:8的氨基酸序列(氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的ctla4-ig融合蛋白；(b)具有seq id no:5的氨基酸序列(氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的ctla4-ig融合蛋白；(c)具有seq id no:7的氨基酸序列(氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的ctla4-ig融合蛋白；(d)具有seq id no:4的氨基酸序列(氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的ctla4-ig融合蛋白；(e)具有seq id no:6的氨基酸序列(氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的ctla4-ig融合蛋白：或(f)具有seq id no:3的氨基酸序列(氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的ctla4-ig融合蛋白。在一些方面，所述ctla4-ig融合蛋白是(a)约90％的ctla4-ig多肽包含以残基27处的甲硫氨酸开始的seq id no:2的氨基酸序列；(b)约10％的ctla4-ig多肽包含以残基编号26处的丙氨酸开始的seq id no:2的氨基酸序列；(c)约4％的ctla4-ig多肽包含以残基编号383处的赖氨酸结束的seq id no:2的氨基酸序列；(d)约96％的ctla4-ig多肽包含以残基编号382处的甘氨酸结束的seq id no:2的氨基酸序列；以及任选地(e)约少于1％的ctla4-ig多肽包含以残基编号25处的甲硫氨酸开始的seq id no:2的氨基酸序列。
[0139]
本公开文本的蛋白质具有糖基化位点。糖基化是这样的过程，其涉及在多肽链内的特定位点处将复杂的寡糖结构添加到蛋白质中。蛋白质的糖基化和添加的碳水化合物的后续加工会影响蛋白质的折叠和结构、蛋白质的稳定性(包括蛋白质的半衰期)以及蛋白质的功能特性。根据发生修饰的序列情境，蛋白质糖基化可以分为两类：o-连接的糖基化和n-连接的糖基化。o-连接的多糖与羟基连接，通常与丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接。不将o-聚糖添加到每个丝氨酸和苏氨酸残基中。o-连接的寡糖通常是单触角或双触角，即它们包
含一个或最多两个分支(触角)，并且包含一个至四个不同种类的糖残基，所述糖残基被逐个添加。n-连接的多糖与天冬酰胺的酰胺氮附接。只有作为两种三肽序列(天冬酰胺-x-丝氨酸或天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸))之一的一部分的天冬酰胺才是糖基化的靶标。n-连接的寡糖可以具有一至四个分支，称为单触角、二触角、三触角、四触角。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖位于选自贝他西普的asn76、asn108和/或asn207的一个或多个天冬酰胺残基处。
[0140]
在一些方面，所述方法包括将蛋白质在本文公开的任一种条件下培养，例如这样的条件，即初始温度设定点在约35℃与约37℃之间，例如约36℃，第二温度设定点在32℃与约34℃之间，例如约33℃，以及第三温度设定点在约30℃与约32℃之间，例如约31℃，其中所述蛋白质在残基asn108处具有n-连接的聚糖，例如g2f。
[0141]
本公开文本的方法还可用于表征、分析或控制蛋白质的唾液酸含量。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖是唾液酸并且具有在约5至约9之间、从约5.5至约8.5、从约5.8至约6.7、从约5.2至约7.5、从约6至约8、从约6.2至约7.4或从约5至约6的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖是唾液酸并且具有在约3至约9之间、从约3.5至约8.5、从约4.5至约7.5、从约5.5至约7.5、从约5.5至约7.4、从约6.0至约7.4或从约6.2至约7.4的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖是唾液酸并且具有在约4至约7之间的nana的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖是唾液酸并且具有在约5至约8之间的nana的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种n-连接的聚糖是唾液酸并且具有在约6.2至约7.4之间的nana的摩尔比。
[0142]
本公开文本的方法还可用于分析o-连接的聚糖。在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种o-连接的聚糖。在一些方面，所述o-连接的聚糖位于残基ser129、ser130、ser136和/或ser139处。
[0143]
本公开文本的方法还可用于分析ctla4-fc融合蛋白的双触角聚糖，包括测量与ctla4蛋白中的一个或多个天冬酰胺残基附接的一种或多种n-连接的聚糖，其中所述双触角聚糖中的一种是g2f。在一些方面，测量与ctla4蛋白中的一个或多个天冬酰胺残基附接的一种或多种n-连接的聚糖，其中所述双触角聚糖中的一种是g0f。在一些方面，所述双触角聚糖选自g0f、g1f、g2f、s1g1f、s1g2f和/或s2g2f。液相色谱可用于分析本公开文本的聚糖。特定的糖蛋白可以显示碳水化合物的异质性。可以观察到几个水平的异质性：糖基化位点可以从被完全占据到未被占据变化，并且任何特定位点都可以填充有许多不同的寡糖结构，其中每个结构可以通过唾液酸分子(如nana或ngna)修饰。
[0144]
本公开文本的蛋白质的碳水化合物含量可以通过本领域已知的方法(包括本文实施例中所述的方法)分析。用于糖基化分析的几种方法是本领域中已知的，并且可用于本公开文本的上下文中。这些方法提供了关于与产生的肽附接的寡糖的身份和组成的信息。关于本公开文本可用的碳水化合物分析的方法包括但不限于凝集素色谱；高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测(hpaec-pad)，其使用高ph阴离子交换色谱以基于电荷分离寡糖；nmr；质谱；hplc；多孔石墨化碳(gpc)色谱。
[0145]
释放寡糖的方法包括：1)酶方法，其通常使用肽-n-糖苷酶f/内切-α-半乳糖苷酶进行：2)β-消除方法，其使用苛刻的碱性环境以释放主要是o-连接的结构；以及3)化学方法，其使用无水肼以释放n-连接的寡糖和o-连接的寡糖二者。分析方法可以包括以下步骤
中的一个或多个：1.将样品针对去离子水透析以去除所有缓冲盐，然后冷干：2.用无水肼释放完整的寡糖链；3.将完整的寡糖链用无水甲醇hcl处理，以释放作为o-甲基衍生物的单独单糖；4.对任何伯氨基进行n-乙酰化；5.衍生化以产生全-o-三甲基甲硅烷基甲基糖苷：6.通过在cp-sil8柱上的毛细管气-液色谱(glc)分离衍生物；7.与已知标准品相比，通过glc和质谱的保留时间鉴定单独糖苷衍生物；以及8.通过fid与内部标准品(13-o-甲基-d-葡萄糖)定量单独衍生物。在一些方面，经由超高效液相色谱和荧光检测(uplc-flr)测量所述双触角聚糖。在一些方面，在所述测量之前切割所述ctla4-fc融合蛋白的fc结构域。在一些方面，在所述测量之前不切割所述ctla4-fc融合蛋白的fc结构域。在一些方面，所述蛋白质运行通过病毒灭活过程。在一些方面，所述病毒灭活过程用0.5％ triton x-100运行。iv.药物组合物
[0146]
通过本公开文本的方法产生的蛋白质可以被进一步配制为适合于人类施用，例如药物组合物。可接受用于药物施用的组合物，除任何一种或多种活性剂外，这种组合物还可以包括作为不超过药物施用的可接受水平的水平(这种水平包括不存在此类杂质的情况)的杂质的物质，并且可以包括药学上可接受的赋形剂、媒介物、载体和其他非活性成分，例如，以配制便于施用的这种组合物。例如，药学上可接受的ctla4-ig组合物可以包括mcp-1或dna，只要这些物质处于对于施用于人可接受的水平即可。
[0147]
本公开文本还提供了作为冻干混合物的任何所述的ctla4-ig分子。包含待冻干的ctla4-ig的配制品可以进一步包含三种基本组分：(1)一种或多种包含其他蛋白质或小分子的另外的活性成分(如免疫抑制剂)，(2)一种或多种赋形剂和(3)一种或多种溶剂。赋形剂包括药学上可接受的试剂，以提供良好的冻干饼特性(填充剂)以及提供蛋白质的冻干保护和/或冷冻保护(“稳定剂”)、维持ph(缓冲剂)、以及在储存期间蛋白质的适当构象以便维持生物活性(包括活性成分的稳定性，如蛋白质的稳定性)的实质性保留。关于赋形剂，配制品的例子可以包括以下中的一种或多种：一种或多种缓冲剂、一种或多种填充剂、一种或多种蛋白质稳定剂和一种或多种抗微生物剂。糖或多元醇可以用作溶液中以及冻融和冷冻干燥期间的非特异性蛋白质稳定剂。聚合物可用于稳定溶液中以及冻融和冷冻干燥期间的蛋白质。一种流行的聚合物是血清白蛋白，它已经被用作冷冻保护剂和冻干保护剂两者。在一方面，本公开文本提供了无白蛋白的配制品。各种盐可以用作填充剂。说明性盐填充剂包括例如nacl、mgcl2和cacl2。
[0148]
某些氨基酸可以用作冷冻保护剂和/或冻干保护剂和/或填充剂。可以使用的氨基酸包括但不限于甘氨酸、脯氨酸、4-羟脯氨酸、l-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、精氨酸和赖氨酸盐酸盐。在配制品中可以选择许多覆盖宽ph范围的缓冲剂。缓冲剂包括例如乙酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸、磷酸盐(钠或钾)、二乙醇胺和tris。缓冲剂涵盖在冻干之前将溶液的ph维持在可接受的范围内的那些试剂。在一方面，本公开文本提供了冻干ctla4-ig混合物，其包含至少90％、95％、99％或99.5％的包括根据seq id no:1-9中任一个的任何序列的ctla4-ig二聚体。在一方面，本公开文本提供了冻干ctla4-ig混合物，其包含至少90％、95％、99％或99.5％的ctla4-ig二聚体和不超过5％、4％、3％、2％或1％的ctla4-ig四聚体。在另一方面，本公开文本提供了冻干ctla4-ig混合物，其包含至少90％、95％、99％或99.5％的ctla4-ig二聚体、和不多于5％、4％、3％、2％或1％的ctla4-ig四聚体和不超过2％、1.5％、1.0％、0.8％、0.5％或0.3％的ctla4-ig单体。在另外的方面，本公开文本提供
了冻干ctla4-ig混合物，其包含至少8.0摩尔唾液酸/摩尔ctla4-ig二聚体或ctla4-ig分子。在另一方面，本公开文本提供了冻干ctla4-ig混合物，其包含：从约15至约35摩尔glcnac/摩尔ctlaig分子或二聚体；从约1至约5摩尔galnac/摩尔ctla4-ig二聚体或ctla4-ig分子；从约5摩尔至约20摩尔半乳糖/摩尔ctla4-ig二聚体或ctla4-ig分子；从约2至约10摩尔岩藻糖/摩尔ctla4-ig二聚体或ctla4-ig分子；和/或从约5-15摩尔甘露糖/摩尔ctla4-ig二聚体或ctla4-ig分子。
[0149]
在一些方面，包含ctla4-ig分子(例如，贝他西普)的药物组合物可以作为用于静脉内施用的无菌白色或灰白色冻干粉末提供。可以将冻干物(lyophile)用合适的流体重构，以获得ph范围为7.2至7.8的透明至略微乳光的无色至浅黄色溶液。用于冻干物的重构的合适的流体包括swfi、0.9％ ns或d5w。ctla4-ig分子(贝他西普)的每个单次使用小瓶还可以含有：磷酸二氢钠(34.5mg)、氯化钠(5.8mg)和蔗糖(500mg)。v.治疗方法
[0150]
通过本公开文本的方法制备的组合物可用于治疗各种疾病。本公开文本提供了一种用于抑制t细胞增殖(或激活)的方法，所述方法包括使t细胞与有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物接触。本公开文本提供了一种用于抑制受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于诱导受试者中对抗原的免疫耐受性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗受试者的炎症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。
[0151]
本公开文本提供了一种用于治疗受试者的银屑病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗或预防受试者的变态反应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗或预防受试者的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗或预防受试者的移植器官排斥的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。
[0152]
本公开文本提供了一种用于治疗受试者的克罗恩病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗受试者的i型糖尿病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。
[0153]
本公开文本提供了一种用于治疗受试者的卵巢炎的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗受试者的肾小球肾炎的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗受试者的变态反应性脑脊髓炎的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。
[0154]
本公开文本提供了一种用于治疗受试者的重症肌无力的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的ctla4-ig组合物。因此，在本公开文本的某些方
面，本公开文本提供了在本文所述的生产方法中由细胞系产生的ctla4-ig分子，以便治疗t细胞相关的疾病或障碍，所述疾病或障碍通常包括但不限于任何t细胞依赖性淋巴增殖性疾病或障碍以及任何t细胞依赖性自身免疫性疾病或障碍，并且更具体地是：t细胞淋巴瘤、t细胞急性淋巴母细胞白血病、睾丸血管中心性t细胞淋巴瘤、良性淋巴细胞性血管炎、移植物抗宿主病(gvhd)、与移植物移植排斥相关的免疫障碍、银屑病、炎症、变态反应、卵巢炎、肾小球肾炎、脑脊髓炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、艾迪生病、原发性粘液性水肿、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、类风湿性关节炎、胰岛素依赖型糖尿病、古德帕斯彻综合征(good pasture's syndrome)、重症肌无力、天疱疮、交感性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性行动性肝炎、硬皮病、多肌炎、和混合性结缔组织病。
[0155]
本公开文本提供了一种用于抑制t细胞增殖(或激活)的方法，所述方法包括使t细胞与有效量的与或不与另一种药剂(如甲氨蝶呤)组合的本公开文本的ctla4-ig组合物接触。本公开文本提供了一种用于抑制受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单独或与甲氨蝶呤组合的本公开文本的ctla4-ig组合物。本公开文本提供了一种用于诱导受试者中对抗原的免疫耐受性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的与甲氨蝶呤组合的本公开文本的ctla4-ig组合物。
[0156]
在一些方面，所述ctla4-ig分子(例如贝他西普)被指示用于在接受肾移植的成年患者中预防器官排斥。在一些方面，所述ctla4-ig分子(例如贝他西普)将与巴司利昔单抗诱导、吗替麦考酚酯和皮质类固醇组合使用。在一些方面，所述ctla4-ig分子(例如贝他西普)仅用于ebv血清阳性的患者。
[0157]
在以下小节中更详细地描述本公开文本的各个方面。通过以下实施例进一步说明本公开文本，所述实施例不应当被视为进一步限制。实施例实施例1过程a和过程b参考方法
[0158]
贝他西普是基因工程化的融合蛋白，其由人细胞毒性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4)的功能结合结构域和igg1类人单克隆免疫球蛋白的fc结构域组成。在ctla-4结构域的b7结合区中进行两个氨基酸修饰，即位置104处的亮氨酸变为谷氨酸和位置29处的丙氨酸变为酪氨酸，以生成贝他西普。贝他西普由2条各大约46kda的同源糖基化多肽链构成，它们通过单个链间二硫键共价连接。贝他西普是使用中国仓鼠卵巢(cho)细胞系在大规模细胞培养中生产的，并且通过解冻来自mwcb的冷冻小瓶而起始。将所述培养物在一系列摇瓶培养物中繁殖。然后将这些培养物转移到细胞袋生物反应器中，以产生足够的细胞数量以接种一系列种子生物反应器，然后接种生产生物反应器。主要基于目标唾液酸(sa)与贝他西普蛋白摩尔比收获生产生物反应器。最后，将细胞培养收获物澄清以为下游处理作准备。代表性生长条件和过程可以在图1a、图1b和图1c中看到。图1a在标题“过程a”和“过程b”下示出了用于过程a和过程b的方法的反应器条件。图1b示出了过程a和过程b的上游生物反应器生长的补料时间设定，并且图1c示出了过程a和过程b的补料策略参数。过程a和过程b的唾液酸摩尔比分析的结果可以在图2中看到。过程a和过程b导致较高的蛋白质滴度，但是在生产期间导致显著较低的唾液酸(nana)摩尔比，如图2所示。由于唾液酸摩尔比是生产贝他西普的
关键质量属性，因此随后开发了过程x。实施例2过程c参考方法
[0159]
在种子培养扩增后，在过程c中在5000l生产生物反应器中使用0.8x106个细胞/ml的初始细胞密度、37℃的温度设定和约7.05的ph设定点生产贝他西普。在培养物达到144小时的培养时间后，将生物反应器温度设定点从37℃降低至34℃。收获时唾液酸与贝他西普的摩尔比的可接受范围为约5.8至约6.7，并且以约0.34g/l至约0.82g/l的滴度生产贝他西普。实施例3ctla4-ig 5,000l生物反应器生产过程
–
过程x
[0160]
为了维持过程c中所示的糖基化谱，但还要提高蛋白质产量和/或滴度，我们产生了如本文所示的过程x。下表1和表2总结了为贝他西普的生产生物反应器步骤定义的上游过程和过程中控制(ipc)。通过利用具有可接受的范围、动作范围、动作限度或警报范围的一组分层过程中操作范围的策略，以关键过程参数(cpp)、过程参数(pp)、关键过程属性(cpa)和性能属性(pa)对关键程度进行分类，以确保对原料药制造过程进行一致的监测和控制。
[0161]
表1中描述的贝他西普制造的种子生物反应器步骤提供了足够的细胞培养物生物质以接种生产生物反应器。每日从种子生物反应器中取出样品，以监测细胞生长、细胞活力百分比以及代谢物和营养物质浓度。用于接种生产生物反应器的细胞培养物的稳健生长和活力对于确保贝他西普融合蛋白的一致性生产很重要。贝他西普制造的种子生物反应器步骤和生产生物反应器步骤的通用工艺流程示于图5。表1.种子反应器
[0162]
在生产生物反应器阶段的生产期间使用的反应器条件描述于下表2和图1a和图1b中。具体地，将初始温度设置为36℃，以便维持高细胞活力和唾液酸(nana)含量。将生产生物反应器调节至7.15
±
0.1的ph设定点，以便增加生长和唾液酸(nana)含量。在生产期间，在诱导生产生物反应器后大约240小时将温度调节降至约33℃，如图1a和表2详述的。进行此温度调节以便在生产生物反应器中的整个生产运行过程中维持滴度。此外，如图1a和表2所述，在诱导后大约240小时，将温度进一步降低至31℃，以便在生产运行过程中进一步维持滴度。在大约240-420小时收获培养物，以便确保达到6.2至7.4的所需唾液酸(nana)摩尔比范围，如图2所述。进一步的反应参数详见表2。过程x示出了大于2.0g/l的生产滴度，是过程c的滴度(参见实施例2)的至少2倍，并且与过程a和过程b相比过程x产生的蛋白质具有高
得多的唾液酸摩尔比(nana)，如图2所示。表2.生产生物反应器条件。表2.生产生物反应器条件。*接种期间和接种后15分钟，压力可以超过12psig。**可以根据需要再添加4次4.5ppm的补充添加，以减少细胞培养物的起泡。实施例4贝他西普的糖基化分析
–
过程x
[0163]
来自化脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(ides)是一种独特的酶，其在铰链区正下方的一个特定位点处消化igg的铰链区，从而产生贝他西普的ctla4片段和两个fc片段。贝他西普原料药(ds)的完全蛋白质消化在37℃下在1小时内发生。然后将消化的样品使用蛋白a旋转柱通过洗脱来纯化。树脂结合fc片段，同时允许ctla4片段流过。使用agilentinstantpc n-聚糖释放和荧光标记试剂盒制备ctla4片段，并且将其在超高效液相色谱系统-荧光检测(uplc-flr)上进行分析。
[0164]
uplc是一种在比高效液相色谱(hplc)更高的压力下运行的色谱技术，并且由于化合物的相容性和所用柱的特征而发生分离。在此方法中，将纯化的贝他西普ds ctla4区域的n-聚糖进行荧光标记并且通过uplc进行分析。然后使用梯度方法和酰胺柱利用分析物极性的差异将聚糖分离。纯化的ctla4片段中荧光标记的n-聚糖的量由面积％确定。此方法适用于测定贝他西普ds样品的ctla4区域中存在的荧光标记的n-聚糖的量。在25mm磷酸钠、
10mm氯化钠(ph 7.5)中配制贝他西普ds。此方法在waters acquity uplc系统上进行分析，所述系统配置有waters acquity uplc聚糖beh酰胺(1.7μm，2.1mm x 150mm)柱和waters acquity flr检测器。用于分析的色谱分离参数见表3：表3
[0165]
贝他西普参考标准品(rs)洗脱的n-聚糖谱的全尺度代表性色谱图和放大的代表性色谱图(其中标记了特定的聚糖(g0f、g1f、g2f、s1g1f和s2g2f))可以在图3a和图3b中看到，而贝他西普rs洗脱的n-聚糖谱的全尺度和放大的代表性色谱图(其中聚糖s1g1f洗脱为两个峰)可以在图4a和图4b中看到。各种聚糖示于图6a和图6b中。***
[0166]
在本技术通篇中，依据著者姓名和日期或依据专利号或专利公开号，在括号中提及各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用以其整体特此并入本技术中，以更全面地描述截至本文所述且要求保护的本公开文本的日期，所述出版物中如技术人员已知的最新技术水平。然而，本文对参考文献的引用不应被解释为承认这个参考文献是本公开文本的现有技术。

技术特征：
1.一种在蛋白质生产阶段期间提高蛋白质的产量和/或控制所述蛋白质的糖基化的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将能够表达所述蛋白质的细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括在约7.1与约7.2之间的ph设定点。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ph设定点为约7.15。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括在约35℃与约37℃之间的初始温度设定点、在约32℃与约34℃之间的第二温度设定点和在约30℃至约32℃之间的第三温度设定点。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括在约0.5x106个细胞/ml与约1x 106个细胞/ml之间的初始活细胞密度(vcd)设定点。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述合适的条件包括：a.约36℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和约31℃的第三温度设定点；b.约7.15的ph设定点；以及c.约0.70x 106个细胞/ml的初始活细胞密度(vcd)设定点。6.一种控制细胞生长速率、细胞活力、活细胞密度和/或细胞滴度以产生蛋白质的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在约7.15的ph设定点下在生物反应器中培养。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括(i)约36.0℃的初始温度设定点和低于约36℃的第二温度设定点；(ii)低于约36.5℃的初始温度设定点和约31℃的最终温度设定点；或(iii)低于约36.5℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和低于约33℃的最终温度设定点。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括将所述细胞在约36℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和约31℃的最终温度设定点培养。9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括约0.70x106个细胞/ml的初始活细胞密度(vcd)设定点。10.一种在蛋白质生产阶段期间提高贝他西普的产量和/或控制贝他西普的糖基化的方法，所述方法包括将能够表达贝他西普的细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括：a.约36℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和约31℃的第三温度设定点；b.约7.15的ph设定点；以及c.约0.70x 106个细胞/ml的初始活细胞密度(vcd)设定点。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括在约80小时的第一补料时间。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第三或最终温度设定点发生在约204小时与约276小时之间。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第三或最终温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约204小时、约216小时、约228小时、约240小时、约252小时、约264小时或约276小时。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述第三最终温度设定点为约31℃并且在约240小时之后发生。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第二温度设定点发生在约72小时与约168小时之间。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二温度设定点发生在约72小时、约78小时、约84小时、约90小时、约96小时、约102小时、约108小时、约114小时、约120小时、约126小时、约132小时、约138小时、约144小时、约150小时、约156小时、约162小时或约168小时。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在约140小时后所述第二温度设定点为约33℃。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中与不采用所述合适的条件的参考方法相比，所述条件将所述蛋白质产量提高至少150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％或至少约400％。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括所述生物反应器中的锰。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述锰以从约1.6十亿分率(ppb)至约15ppb的浓度存在。21.根据权利要求19所述的方法，其中所述锰以从约3ppb至约6ppb的浓度存在。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法降低细胞生长速率。23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述方法控制细胞活力。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞活力展现出在约10.0x 106个细胞/ml与约15.0x 106个细胞/ml之间的平均峰值活细胞密度(vcd)。25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述方法控制滴度。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述滴度展现出在约1.50g/l与约3.5g/l之间的最终滴度。27.根据权利要求25所述的方法，其中所述滴度展现出大于约2.00g/l的最终滴度。28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述方法控制所述蛋白质的糖基化谱。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述糖基化谱包括一种或多种n-连接的聚糖。30.根据权利要求28或29所述的方法，其中在所述蛋白质生产阶段期间测量所述糖基化谱。31.根据权利要求30所述的方法，其中约每1天测量所述糖基化谱。32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中当收获所述细胞培养物时测量所述糖基化谱。33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述n-连接的聚糖包括：g0f、g1f、g2f、s1g1f、s1g2f、s2g2f或其任何组合。34.根据权利要求1至9或11至33中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含ctla4结构域。35.根据权利要求1至9或11至34中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是融合蛋白。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述融合蛋白包含fc部分。37.根据权利要求1至9或11至36中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是贝他西普。38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含与seq id no:5至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。39.根据权利要求29至38中任一项所述的方法，其中所述一种或多种n-连接的聚糖位于选自贝他西普的asn76、asn108和/或asn207的一个或多个残基处。40.根据权利要求29至39中任一项所述的方法，其中所述一种或多种n-连接的聚糖包含唾液酸，并且具有从约4至约10的nana的摩尔比。41.根据权利要求29至40中任一项所述的方法，其中所述一种或多种n-连接的聚糖包含唾液酸并且具有从约5至约9、从约5.5至约8.5、从约5.8至约6.7、从约5.2至约7.5、从约6至约8、从约6.2至约7.4或从约5至约6的nana的摩尔比。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述nana的摩尔比为约6.8。43.根据权利要求28至42中任一项所述的方法，其中所述糖基化谱是经由n-连接的碳水化合物谱方法分析的。44.根据权利要求28至43中任一项所述的方法，其中所述糖基化谱包括一种或多种o-连接的聚糖。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述o-连接的聚糖位于残基ser129、ser130、ser136和/或ser139处。46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，所述方法以分批补料培养过程进行。47.根据权利要求1至46中任一项所述的方法，其中将葡萄糖和/或半乳糖补充到所述生物反应器中的补料培养基中。48.根据权利要求47所述的方法，其中将所述补料培养基定期添加到所述生物反应器中。49.根据权利要求48所述的方法，其中约每24小时将所述补料培养基添加到所述生物反应器中。50.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，所述方法以灌注过程进行。51.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是cho-k1细胞、cho-dxb11细胞或cho-dg44细胞。54.一种分析ctla4-fc融合蛋白的聚糖的方法，所述方法包括测量与ctla4蛋白中的一个或多个天冬酰胺残基附接的一种或多种n-连接的聚糖，其中所述聚糖中的一种包括g0f、g1f、g2f、s1g1f、s1g2f和/或s2g2f。55.根据权利要求54所述的方法，其中经由超高效液相色谱-荧光检测(uplc-flr)测量所述聚糖。56.根据权利要求54或55所述的方法，其中在所述测量之前切割所述ctla4-fc融合蛋白的fc结构域。57.根据权利要求54所述的方法，其中在所述测量之前不切割所述ctla4-fc融合蛋白
的fc结构域。58.一种通过根据权利要求1至57中任一项所述的方法产生的蛋白质。59.一种通过根据权利要求1至9和11至57中任一项所述的方法产生的蛋白质，其中所述蛋白质包括ctla4-fc融合蛋白。60.根据权利要求59所述的蛋白质，其中所述蛋白质是贝他西普。61.一种通过根据权利要求1至57中任一项所述的方法产生的细胞。62.一种通过根据权利要求1至50和54至57中任一项所述的方法产生的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。63.根据权利要求62所述的细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。64.根据权利要求63所述的细胞，其中所述细胞是cho-k1细胞、cho-dxb11细胞或cho-dg44细胞。65.一种生物反应器，所述生物反应器用于制造根据权利要求1至57中任一项所述的方法产生的蛋白质。66.一种包含根据权利要求61至64中任一项所述的细胞和细胞培养基的生物反应器，其中将所述生物反应器维持在约7.15的ph。67.根据权利要求66所述的生物反应器，其中将所述生物反应器维持在：a.约36℃的初始温度设定点、约33℃的第二温度设定点和约31℃的第三温度设定点；b.约7.15的ph设定点；以及c.约0.70x 106个细胞/ml的初始活细胞密度(vcd)设定点。68.根据权利要求66或67所述的生物反应器，其中所述细胞培养基进一步包含锰。

技术总结
本公开文本提供了一种在生产期间控制蛋白质的糖基化谱的新型方法。本公开文本还提供了一种提高蛋白质产量同时控制蛋白质糖基化谱的新型方法。谱的新型方法。谱的新型方法。


技术研发人员：A
受保护的技术使用者：百时美施贵宝公司
技术研发日：2021.08.13
技术公布日：2023/8/14