一种多重PCR检测六种葫芦病毒的方法及试剂盒

一种多重pcr检测六种葫芦病毒的方法及试剂盒
技术领域
1.本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种多重pcr检测六种葫芦病毒的方法及试剂盒。


背景技术：

2.葫芦属于葫芦科葫芦属，是重要的瓜类蔬菜之一，在全世界范围内广泛种植。病毒病是为害葫芦的重要病害之一，对葫芦种植及产业发展造成了巨大的经济损失。葫芦病毒种类多、变异快、防控难，快速鉴定出为害葫芦的病毒种类对制定精准防控措施具有重要指导意义。目前在植物病毒检测方法较多，如生物学方法——指示植物法、血清学方法——酶联免疫法、电子显微镜法、多聚酶链式反应（pcr）等。pcr 因其特异性最强、灵敏度最高，已广泛应用于植物病毒检测，这种方法相较于其它方法，更为便捷、高效、准确。但对于多种病毒复合侵染以及需要大量样品进行检测时，单一引物的pcr检测方法仍需要大量的时间去检测，为探索一种更加快速、高效且准确的检测方法，多重pcr（mutiplex pcr）便应运而生，并已经在病毒、真菌和细菌等病原物的检测和鉴定中发挥着重要作用。同时检测多种病毒，可在短时间内检测大量样本，提高了检测效率，大大降低了检测成本，检测成本相比于其他检测方法也更低。多重pcr主要是指在针对包含多种不同核苷酸序列的样品中，同时添加两种及两种以上的特异性引物，根据最终扩增的条带大小，来检测并区分出两种及两种以上的不同病原物。目前检测葫芦病毒的策略还只停留在单一引物的rt-pcr检测方法。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是为同时检测多种葫芦病毒提供一种新选择。
4.本发明的技术方案是一种多重pcr检测六种葫芦病毒的方法，包括如下步骤：分两步进行pcr，第一步扩增wva、ccyv和prsv，第二步扩增cgmmv、wgmmv和ztmv；扩增wva的引物如seq id no.1和seq id no.2所示；扩增ccyv的引物如seq id no.3和seq id no.4所示；扩增prsv的引物如seq id no.11和seq id no.12所示；扩增cgmmv的引物如seq id no.5和seq id no.6所示；扩增wgmmv的引物如seq id no.7和seq id no.8所示；扩增ztmv的引物如seq id no.9和seq id no.10所示。
5.具体的，在第一步扩增完成后，向反应体系中加入第二步扩增的cgmmv、wgmmv和ztmv的引物。
6.进一步的，所述多重pcr的总体系为30ml，各引物的添加量为0.4～0.7ml。
7.具体的，所述多重pcr的总体系中，wva、ccyv、cgmmv、wgmmv、ztmv和prsv引物的终浓度为10 mm。
8.优选的，所述多重pcr的总体系中，wva、ccyv、cgmmv、wgmmv、ztmv和prsv的上下游引物的添加量一致，分别为0.5 ml、0.5 ml、0.4 ml、0.4 ml、0.6 ml和0.6 ml。
9.特别的，所述第一步扩增的程序为：98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，10个循环；72℃ 5 min；12℃ ∞。
10.其中，所述第二步扩增的程序为：98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，32个循环；72℃ 5 min；12℃ ∞。
11.本发明还提供了一种同时检测六种葫芦病毒的试剂盒，包括扩增wva、ccyv、prsv、cgmmv、wgmmv和ztmv引物，扩增wva的引物如seq id no.1和seq id no.2所示；扩增ccyv的引物如seq id no.3和seq id no.4所示；扩增prsv的引物如seq id no.11和seq id no.12所示；扩增cgmmv的引物如seq id no.5和seq id no.6所示；扩增wgmmv的引物如seq id no.7和seq id no.8所示；扩增ztmv的引物如seq id no.9和seq id no.10所示。
12.进一步的，所述试剂盒还包括dntp、depc-h2o、缓冲液、dna聚合酶、rna逆转录酶、rna提取试剂中的至少一种。
13.本发明还提供了上述试剂盒在葫芦病毒检测中的用途。
14.具体的，所述葫芦病毒为wva、ccyv、prsv、cgmmv、wgmmv或ztmv中的至少一种。
15.本发明的有益效果：本发明建立了一种高效的六重rt-pcr病毒检测技术体系，同时检测6种葫芦病毒。本发明提供了针对6种主要葫芦病毒设计6对特异检测引物，还优化了这6对引物的添加顺序及用量达到最佳扩增效果。本发明为葫芦病毒复合侵染的检测提供了一种更加快速、准确、高效的检测方法和检测试剂盒，具有广阔的应用前景。
附图说明
16.图1、不同引物添加顺序的检测结果；1号泳道为6对引物一步法添加的结果，2-6号泳道为两步法不同添加顺序的结果。2号添加顺序为wva+ccyv+cgmmv，wgmmv+ztmv+prsv；3号添加顺序为ccyv+ztmv+wgmmv，wva+cgmmv+prsv；4号添加顺序为ztmv+prsv+wva，ccyv+cgmmv+wgmmv；5号添加顺序为cgmmv+wgmmv+ztmv，wva+ccyv+prsv；6号添加顺序为wva+ccyv+prsv，cgmmv+wgmmv+ztmv。注：marker: 100 ladder；positive control: positive control的阳性对照是将fxhl1-6混合到一起。
17.图2、各个引物不同用量的检测结果；调整其中各个引物的用量：wva、ccyv、prsv，cgmmv、wgmmv、ztmv依次为：1号泳道用量：0.6 ml、0.6 ml、0.6 ml， 0.4 ml、0.4 ml、0.6 ml；2号泳道用量：0.7 ml、0.7 ml、0.6 ml， 0.5 ml、0.4 ml、0.6 ml；3号泳道用量：0.5 ml、0.5 ml、0.6 ml，0.4 ml、0.4 ml、0.6 ml；4号泳道用量：0.7 ml、0.7 ml、0.6 ml，0.5 ml、0.5 ml、0.7 ml；5号泳道用量：0.6 ml、0.6 ml、0.5 ml，0.4 ml、0.4 ml、0.7 ml；6号泳道用量：0.5 ml、0.5 ml、0.5 ml，0.5 ml、0.5 ml、0.5 ml。
18.图3、多重rt-pcr引物混合验证电泳图；注：marker: 100 ladder；positive control: positive control的阳性对照是将fxhl1-6混合到一起；fxhl 1-6: 葫芦样品。
19.图4、wva的引物检测电泳图，注：marker: 100 ladder；fxhl 1-6: 葫芦样品；positive control的阳性对照是将fxhl1-6混合到一起。
20.图5、ccyv的引物检测电泳图，注：marker: 100 ladder；fxhl 1-6: 葫芦样品；positive control的阳性对照是将fxhl1-6混合到一起。
21.图6、cgmmv的引物检测电泳图，注：marker: 100 ladder；fxhl 1-6: 葫芦样品；positive control的阳性对照是将fxhl1-6混合到一起。
22.图7、wgmmv的引物检测电泳图，注：marker: 100 ladder；fxhl 1-6: 葫芦样品；positive control的阳性对照是将fxhl1-6混合到一起。
23.图8、ztmv的引物检测电泳图，注：marker: 100 ladder；fxhl 1-6: 葫芦样品；positive control的阳性对照是将fxhl1-6混合到一起。
24.图9、prsv的引物检测电泳图，注：marker: 100 ladder；fxhl 1-6: 葫芦样品；positive control的阳性对照是将fxhl1-6混合到一起。
实施方式
25.葫芦病毒病发生严重，同时病毒复合侵染情况普遍存在，常规的检测耗时较久，所以急需一种更加快速、准确、高效的检测葫芦上所感染病毒种类的方法。本发明旨在建立一种高效的六重rt-pcr病毒检测技术体系，同时检测6种葫芦病毒。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：1) 针对6种主要葫芦病毒设计6对特异检测引物，2) 通过调整这6对引物的添加顺序及用量达到最佳扩增效果，3) 利用这6对引物对葫芦感病样品进行多重rt-pcr检测，4) 利用特异引物对每一个病毒进行逐一rt-pcr验证。
26.根据已经确定所感染病毒种类的葫芦样品（fxhl 1-6），用设计的多重pcr引物去检测含相应病毒的葫芦样品，从而判断多重pcr引物的有效性。其中wva、wgmmv、ccyv和prsv在第一次验证中皆扩出目标条带，证明其合理有效；ztmv和cgmmv在第一次验证并未扩出目的条带，因此重新设计ztmv和cgmmv的引物，经过验证ztmv扩出目标条带，证明ztmv引物合理有效，cgmmv依旧未能扩出目标条带；重新设计cgmmv的检测引物，通过再次验证扩出了cgmmv的目标条带，证明此次cgmmv的引物合理有效，最终确定了多重pcr检测的六对引物。
27.下述实施例中用到的葫芦样品fxhl 1-6为在田间所采集的葫芦样品：1.植物总rna提取将从田间采集的葫芦病毒疑似样品进行分类，液氮研磨后，通过trizol法提取蒲瓜叶片总rna，trizol试剂购自takara公司。
28.2.反转录将所提取的植物总rna进行反转录，通过反转录得到其cdna，反转录试剂——primescripttm
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1st strand cdna synthesis mix，购自takara公司，以其cdna作为模板进行pcr检测。已经通过小rna测序和rt-pcr结合的方法进行了检测，确定了每个样品种所包含的病毒感染类型；具体如下：fxhl-1: ccyv、wgmmv、wva、ztmv、prsv；fxhl-2: wgmmv、wva、ztmv、prsv；fxhl-3: wgmmv、ztmv、prsv；fxhl-4: cgmmv、wgmmv、ztmv；fxhl-5: cgmmv、wgmmv、ztmv；fxhl-6: ccyv、cgmmv、wgmmv。
29.1.在ncbi病毒数据库查询所要检测病毒wva、ccyv、cgmmv、wgmmv、ztmv、prsv的序列，并进行blast分析，找到与之同源性较高的几条序列并下载。
30.2.再通过dnaman软件进行序列比对，找到对应病毒的保守区进行设计引物，引物设计在snapgene软件中完成。
31.3.由于存在同属的病毒，序列同源性较高，所以在需要在同属病毒的两种病毒之间的保守区，找到两段不同的序列进行设计引物，从而保证在检测时，区分开同属病毒间不
同种类的病毒。根据此思路，设计出以下表格中的6对引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
32.表1六重rt-pcr检测引物
33.在引物添加时，本发明设计了“两步法”的引物添加顺序，由于检测引物较多，引物之间很容易发生一些结合等反应，一步法的策略很难达到更多对引物检测的上限，所以采用“两步法”的策略，以此提高检测引物的效果。同时在两步法的检测中发现，不同的引物的添加顺序直接影响着最终的检测结果。
34.首先用不同顺序添加6对引物，找到能同时扩增出6种目的条带的方法，尝试了多种引物的添加顺序，再根据条带的亮度，细微调整引物的使用量，从而确定了最终的配比体系（表2）和反应条件。
35.首先，不同引物添加顺序的检测体系为：cdna2.5ml；引物f0.5ml；引物r0.5ml；2
×
t5superpcrmix（购自擎科生物科技有限公司）15ml；5
×
enhoncerbuffer4ml；depc-h2o2.5ml，总体系为30ml。一步法是一次性添加6对引物，扩增程序为98℃3min；98℃10s，55℃10s，72℃30s，40个循环；72℃5min；12℃∞。两步法是分两次加入引物，进行两次扩增。首先加入第一次的检测引物，扩增程序为98℃3min；98℃10s，55℃10s，72℃30s，10个循环；72℃5min；12℃∞。再加入第二次的检测引物，扩增程序为98℃3min；98℃10s，55℃10s，72℃30s，32个循环；72℃5min；12℃∞。将rt-pcr产物将rt-pcr产物在3%的琼脂糖凝胶中,使用marker(gldnamarker100ladder，购自艾科瑞生物公司)，并在凝胶成像系统下成像，通过成像结果选出扩增效果最好的引物添加顺序。结果如图1所示，1号泳道为一步法的添加顺序，2-6号泳道为不同引物添加顺序的检测结果，可以看出两步法中，不同引物的添加顺序所扩增出的目的条带，远多于一步法中所扩增的目的条带。且，6号泳道为优选添加顺序，因为它是能扩增出所有条带的引物添加顺序，虽然有的条带不明显，是由于此处所有的引物用量皆是0.5ml，后续将对引物用量进行优化。
36.根据所确定的引物添加顺序方法，根据条带的亮度及常规pcr检测的引物添加量，对引物的浓度和用量进行细微调整，以此得到最佳的检测效果。
37.首先以上述方案确定的引物添加顺序（wva+ccyv+prsv，cgmmv+wgmmv+ztmv），再细
微调整各个引物的用量。具体方法仍是使用两步法，具体体系为：cdna 2.5 ml；引物f；引物r；2
×
t5 super pcr mix 15 ml；5
×
enhoncer buffer 4 ml；depc-h2o 2.5 ml，总体系为30 ml。首先加入wva、ccyv、prsv的检测引物，扩增程序为98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，10个循环；72℃ 5 min；12℃ ∞。再加入cgmmv、wgmmv、ztmv的检测引物，扩增程序为98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃，30 s，32个循环；72℃ 5 min；12℃ ∞。根据检测效果（图2），最终确定wva、ccyv、prsv；cgmmv、wgmmv、ztmv的使用量依次为：0.5 ml、0.5 ml、0.6 ml； 0.4 ml、0.4 ml、0.6 ml。
38.根据上述方法所确定的方案，最终的反应体系和反应条件为：wva、ccyv、cgmmv，wgmmv、ztmv、prsv；引物的终浓度为10 mm，总体系使用30 ml，wva、ccyv、cgmmv、wgmmv、ztmv、和prsv正反引物使用量一致，分别为0.5 ml；0.5 ml；0.4 ml；0.4 ml；0.6 ml；0.6 ml。具体体系为：cdna 2.5 ml；引物f 0.4～0.6 ml；引物r 0.4 ~ 0.6 ml；2
×
t5 super pcr mix（购自擎科生物科技有限公司） 15 ml；5
×
enhoncer buffer 5 ml；depc-h2o 1.5 ml，引物添加顺序为首先加入wva、ccyv和prsv的引物，扩增程序为98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，10个循环；72℃ 5 min；12℃ ∞。再加入cgmmv、wgmmv和ztmv的引物，扩增程序为98℃ 3 min；98℃ 10s，55℃ 10s，72℃，30s，32个循环；72℃ 5 min；12℃ ∞。将rt-pcr产物将rt-pcr产物在3%的琼脂糖凝胶中,使用marker (gl dna marker 100 ladder，购自艾科瑞生物公司)，并在凝胶成像系统下成像，根据条带的大小，判断与之大小对应的病毒类型，从而确定多重rt-pcr引物的合理性。结果如图3所示，根据不同引物用量，可以看出条带的亮度及数量皆有差异，通过细微的调整，从而确定了最佳扩增效果的3号泳道为最终引物的添加量。
39.为验证上述6对引物的多重rt-pcr检测结果是否正确，所以将设计的6对引物逐一进行验证，从而验证引物的效果。反应体系；cdna 2 ml；引物f 0.5 ml；引物r 0.5 ml；2
×
t5 super pcr mix 10 ml；depc-h2o 7 ml，总体系为20 ml。扩增程序为98℃ 3 min；94℃ 10 min，55℃ 15 s，72℃ 30 s，32个循环；72℃ 5 min；4℃ ∞。将rt-pcr产物将rt-pcr产物在3%的琼脂糖凝胶中,使用marker (gl dna marker 100 ladder，购自艾科瑞生物公司)，并在凝胶成像系统下成像，根据条带的大小，判断与之大小对应的病毒类型，从而确定多重rt-pcr引物的合理性。结果见图4~9，从图中可以看出验证了图3中的检测结果。

技术特征：
1.一种多重pcr检测六种葫芦病毒的方法，其特征在于：包括如下步骤：分两步进行pcr，第一步扩增wva、ccyv和prsv，第二步扩增cgmmv、wgmmv和ztmv；扩增wva的引物如seq id no.1和seq id no.2所示；扩增ccyv的引物如seq id no.3和seq id no.4所示；扩增prsv的引物如seq id no.11和seq id no.12所示；扩增cgmmv的引物如seq id no.5和seq id no.6所示；扩增wgmmv的引物如seq id no.7和seq id no.8所示；扩增ztmv的引物如seq id no.9和seq id no.10所示。2.根据权利要求1所述多重pcr检测六种葫芦病毒的方法，其特征在于：在第一步扩增完成后，向反应体系中加入第二步扩增的cgmmv、wgmmv和ztmv的引物。3.根据权利要求1所述多重pcr检测六种葫芦病毒的方法，其特征在于：所述多重pcr的总体系为30ml，各引物的添加量为0.4～0.7ml。4.根据权利要求1所述多重pcr检测六种葫芦病毒的方法，其特征在于：所述多重pcr的总体系中，wva、ccyv、cgmmv、wgmmv、ztmv和prsv引物的终浓度为10 mm。5.根据权利要求4所述多重pcr检测六种葫芦病毒的方法，其特征在于：所述wva、ccyv、cgmmv、wgmmv、ztmv和prsv的上下游引物的添加量一致，分别为0.5 ml、0.5 ml、0.4 ml、0.4 ml、0.6 ml和0.6 ml。6.根据权利要求1所述多重pcr检测六种葫芦病毒的方法，其特征在于：所述第一步扩增的程序为：98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，10个循环；72℃ 5 min；12℃ ∞。7.根据权利要求1所述多重pcr检测六种葫芦病毒的方法，其特征在于：所述第二步扩增的程序为：98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，32个循环；72℃ 5 min；12℃ ∞。8.一种多重pcr检测六种葫芦病毒的试剂盒，其特征在于：包括扩增wva、ccyv、prsv、cgmmv、wgmmv和ztmv引物，扩增wva的引物如seq id no.1和seq id no.2所示；扩增ccyv的引物如seq id no.3和seq id no.4所示；扩增prsv的引物如seq id no.11和seq id no.12所示；扩增cgmmv的引物如seq id no.5和seq id no.6所示；扩增wgmmv的引物如seq id no.7和seq id no.8所示；扩增ztmv的引物如seq id no.9和seq id no.10所示。9.根据权利要求8所述多重pcr检测六种葫芦病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括dntp、depc-h2o、缓冲液、dna聚合酶、rna逆转录酶、rna提取试剂中的至少一种。10.权利要求8或9所述多重pcr检测六种葫芦病毒的试剂盒在葫芦病毒检测中的用途。

技术总结
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种多重PCR检测六种葫芦病毒的方法及试剂盒。本发明要解决的技术问题是为同时检测多种葫芦病毒提供一种新选择。本发明的技术方案是一种多重PCR检测六种葫芦病毒的方法，包括如下步骤：分两步进行PCR，第一步扩增WVA、CCYV和PRSV，第二步扩增CGMMV、WGMMV和ZTMV。本发明还提供了一种多重PCR检测六种葫芦病毒的试剂盒，包括扩增WVA、CCYV、PRSV、CGMMV、WGMMV和ZTMV的引物。本发明的方法和试剂盒可用于六种葫芦病毒的同时检测，效率高。效率高。效率高。


技术研发人员：李正刚 苏琦 何自福 佘小漫 汤亚飞 于琳 蓝国兵 丁善文
受保护的技术使用者：广东省农业科学院植物保护研究所
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/8/14