一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测卡及检测方法与流程

1.本发明涉及食品安全免疫层析快速检测技术领域，具体涉及一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测卡及检测方法。


背景技术：

2.氟苯尼考（florfenicol，ff），又称氟甲砜霉素，是一种合成的广谱抗菌氯霉素衍生物，为白色、类白色的结晶性粉末，用于治疗敏感细菌所致的家禽、家畜和鱼的细菌性疾病，特别是对呼吸系统感染和肠道感染效果显著。ff的主要代谢物有氟苯尼考胺( florfenicol amine,ffa)、氟苯尼考醇、氟苯尼考草氨酸等，且ffa是组织中最主要的代谢物。氟苯尼考在使用时，剂量太小达不到预防或治疗效果，且容易导致耐药性菌株的产生，疾病发生时，养殖户治病心切往往注射大剂量或者超剂量的氟苯尼考对禽畜进行治病或预防疾病，极易造成动物源性食品中有害物质的残留，给食品安全带来巨大隐患。
3.现有检测氟苯尼考的方法主要是气相色谱-质谱、液相色谱-质谱检测方法，虽灵敏度高、准确，适用于配备有专业技术人员和专业仪器设备的检测机构使用，但均具有前处理复杂、烦琐、耗时、需要大型昂贵仪器及专业化程度高的检测人员等缺点，不易在基层推广并应用于大批量样品检测。
4.而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测卡及检测方法，以解决现有技术中需要专业技术人员和专业仪器设备进行检测、前期处理复杂繁琐、灵敏度低、检测范围窄的问题。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测卡，所述检测卡包括pvc底板和检测卡外壳；在pvc底板上从左至右依次设有稀释垫、标记物垫和吸水垫，nc膜位于标记垫的下方，nc膜的一端与吸水垫的一端搭接相连，nc膜的另一端从标记垫的下方穿过后与稀释垫的一端搭接相连，且标记物垫和稀释垫之间具有间隙，使nc膜能够从该间隙中裸露出来；在标记物垫的上方设有样品垫；在标记垫和吸水垫之间的nc膜上从左至右依次设有检测线t1、检测线t2和质控线c；所述pvc底板位于检测卡外壳内，在检测卡外壳上且对应检测线t1、检测线t2和质控线c的位置处开设有视窗孔，对应样品垫的位置处开设有加样孔，对应稀释垫位置处开设有清洗孔；在标记物垫上浸染已分别标记氟苯尼考抗体、氟苯尼考胺抗体和兔igg抗体的镧系荧光微球探针；
在nc膜上，检测线t1处包被氟苯尼考-bsa抗原，检测线t2处包被氟苯尼考胺-bsa抗原，质控线c上包被羊抗兔igg抗体的igg。
7.优选地，所述镧系荧光微球探针采用如下步骤制备：s1：将镧系荧光微球加入稀释液中，进行超声波分散，然后离心处理；其中，稀释液中mes的浓度为0.05mol/l，稀释液中镧系荧光微球的浓度为1mg/ml；s2：取s1中得到沉淀，加入稀释液中分散，室温条件下避光震荡，依次加入edc和nhs震荡混匀，离心处理后，取沉淀加入磷酸盐缓冲液分散；其中，edc的浓度为0.2（g/l），nhs的浓度为0.2g/l，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/l，ph为7.6；s3：加入氟苯尼考单克隆抗体、氟苯尼考胺单克隆抗体或兔igg抗体，室温下避光混匀反应3小时，加入封闭剂，室温下避光混匀反应1小时，离心处理；s4：取s3得到的沉淀，加入偶联缓冲液重悬后，4℃避光保存备用；其中，所述偶联缓冲溶液为0.05mol/l，ph7.6的pbs缓冲液、质量分数为1%的bsa、以及质量分数为0.1%的tween-20的混合溶液。
8.其中，氟苯尼考单克隆抗体和镧系荧光微球的质量比为（2~5）：（2~5），氟苯尼考胺单克隆抗体的质量与镧系荧光微球的质量比为（2~5）：（2~5）；兔igg抗体与镧系荧光微球的质量比为（2~5）：（2~5）；所述封闭剂为质量分数为10%的bsa。
9.优选地，所述镧系荧光微球中，镧系为镧系元素eu、sm或tb。
10.本发明还提供了一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测方法，采用上述定量检测卡，具体操作步骤如下：步骤1：配制待测样品的待测溶液步骤2：将待测溶液加入检测卡的加样孔内，5分钟后，将稀释液滴加在清洗孔中，静置反应15~20min，将检测卡插入高敏荧光分析仪中进行分析得到检测结果。
11.优选地，所述检测卡氟苯尼考的检测限为0.1
µ
g/kg，氟苯尼考胺的检测限为10
µ
g/kg。
12.优选地，根据荧光-浓度标准曲线计算样本中氟苯尼考和氟苯尼考胺浓度含量。
13.优选地，在步骤2中，当待测溶液进入加样孔后，待测溶液经过样本垫和标记物垫后，标记物垫上的标记物随待测溶液向下方nc膜两侧渗透，5分钟后清洗孔中的稀释液将存于nc膜上的待测溶液和标记物冲至吸水垫，同时阻断残留在标记物垫上的标记物和待测溶液继续向nc膜渗透。
14.优选地，在步骤2中，在稀释垫上加入色素，用于指示标记物释放过程；当视窗孔完全被色素覆盖时，开始结果判读。
15.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明所述检测卡结构简单，设计合理，在加样孔的后面新增了清洗孔，通过中间的加样孔加样品，并且在加入样本后侧流到预设定位置时，再在加样孔后面的清洗孔中加入稀释液的方式，由于此时样品垫和标记物垫的湿度都大于nc膜湿度，在吸水垫作用下，稀释液基本稀释nc膜上的样本，稀释液极少流向样品垫和标记物垫，采用这样的结构设计不但提高了检测卡对被检测物的灵敏性、精密性，而且还保留了快诊检测方法的快速和方便特性。
16.2、由于鸡蛋中氟苯尼考胺为氟苯尼考的代谢残留物，基于《gb31650-2019 食品中
兽药最大残留限量》规定，要求检测兽药残留量为氟苯尼考和氟苯尼考胺总和，本发明所述方法操作方便，结合所述检测卡，能够通过一次提取、一次滴卡、同时完成对鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的定量检测，检测时间短，能够在20分钟以内就获得非常准确的结果，从而能够精确判断样品中是否存在氟苯尼考和氟苯尼考胺含量超标。
附图说明
17.图1为本发明所述检测卡的结构示意图。
18.图2为本发明所述检测卡外壳的结构示意图。
19.图3为不同浓度氟苯尼考、氟苯尼考胺和对应荧光信号制备成的标准曲线图。
20.图中：pvc底板1、稀释垫2、标记物垫3、吸水垫4、nc膜5、样品垫6、检测线t1 7、检测线t2 8、质控线c 9、视窗孔10、加样孔11、清洗孔12、检测卡外壳13。
具体实施方式
21.下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
22.一、名词解释：羊抗兔lgg：羊抗兔lgg的免疫球蛋白g。
23.兔lgg：兔免疫球蛋白g。
24.bsa-ff/bsa-ffa半抗原：氟苯尼/考氟苯尼考胺通过化合键与bsa耦连形成的高分子。
25.二、一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测卡本发明提供了一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测卡，所述检测卡包括pvc底板和检测卡外壳；在pvc底板1上从左至右依次设有稀释垫2、标记物垫3和吸水垫4，nc膜5位于标记垫的下方，nc膜的一端与吸水垫的一端搭接相连，nc膜的另一端从标记垫的下方穿过后与稀释垫的一端搭接相连，且标记物垫和稀释垫之间具有间隙，使nc膜能够从该间隙中裸露出来；在标记物垫的上方设有样品垫6；在标记垫和吸水垫之间的nc膜上从左至右依次设有检测线t1 7、检测线t2 8和质控线c 9；在标记物垫上浸染已分别标记氟苯尼考抗体、氟苯尼考胺抗体和兔igg抗体的镧系荧光微球，即：标记物垫上浸染已标记氟苯尼考抗体的镧系荧光微球、已标记氟苯尼考胺抗体的镧系荧光微球和已标记兔igg抗体的镧系荧光微球，这三种镧系荧光微球可以单独制备。
26.在nc膜上，检测线t1处包被氟苯尼考-bsa抗原，检测线t2处包被氟苯尼考胺-bsa抗原，质控线c上包被羊抗兔igg抗体的igg。所述pvc底板位于检测卡外壳内，在检测卡外壳上且对应检测线t1、检测线t2和质控线c的位置处开设有视窗孔10，对应样品垫的位置处开设有加样孔11，对应稀释垫位置处开设有清洗孔12。
27.本发明在加样孔的前面设置了清洗孔12，在通过中间的加样孔11添加样品后，待测样品侧流到预定位置时，再向清洗孔中加入稀释液，此时由于样品垫和标记物垫的湿度都大于nc膜湿度，待测样会和标记物一起留在nc膜上，反应一段时间后清洗孔中的稀释液会将nc膜上的样本和标记物冲至吸水垫，不但可以提高检测卡对待测样品检测的灵敏性、精密性，还能快速得到检测结果，使检测过程更加方便。
28.在具体实施时，所述镧系荧光微球探针采用如下步骤制备：s1：将镧系荧光微球加入稀释液中，进行超声波分散，然后离心处理；其中，稀释液中mes的浓度为0.05mol/l，稀释液中镧系荧光微球的浓度为1mg/ml；s2：取s1中得到沉淀，加入稀释液中分散，室温条件下避光震荡，依次加入edc和nhs震荡混匀，离心处理后，取沉淀加入磷酸盐缓冲液分散；其中，edc的浓度为0.2（g/l），nhs的浓度为0.2g/l，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/l，ph7.6；s3：加入氟苯尼考单克隆抗体、氟苯尼考胺单克隆抗体或兔igg抗体，室温下避光混匀反应3小时，加入封闭剂，室温下避光混匀反应1小时，离心处理；s4：取s3得到的沉淀，加入偶联缓冲液重悬后，4℃避光保存备用；其中，所述偶联缓冲溶液为0.05mol/l，ph7.6的pbs缓冲液、质量分数为1%的bsa、以及质量分数为0.1%的tween-20的混合溶液。
29.其中，当制备标记氟苯尼考抗体的镧系荧光微球时，氟苯尼考单克隆抗体和镧系荧光微球的质量比为（2~5）：（2~5）；当制备标记氟苯尼考胺抗体的镧系荧光微球时，氟苯尼考胺单克隆抗体的质量与镧系荧光微球的质量比为（2~5）：（2~5）；当制备标记兔igg抗体的镧系荧光微球时，兔igg抗体与镧系荧光微球的质量比为（2~5）：（2~5）。
30.所述封闭剂为质量分数为10%的bsa。
31.所述镧系荧光微球中，镧系为镧系元素eu、sm或tb。其中，镧系荧光是指镧系元素eu、sm或tb与β－二酮配基产生的荧光，其发光效率高、吸收光谱宽、发射光谱很窄、斯特克斯位移宽，使其荧光光谱分析的灵敏度很高。
32.本发明还提供了一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测方法，采用上述定量检测卡，具体操作步骤如下：步骤1：配制待测样品的待测溶液。具体为，取一部分待测样品，加入乙酸乙酯和待测样品混合均匀，进行离心处理，取上清液在ep管中，于65℃水浴中氮气吹干，最后用稀释液溶解。此处，稀释液为稀释缓冲液，其配制过程为：依次称取3.64gna2hpo4·
12h2o、0.82g k2hpo4·
3h2o、8g nacl、0.2g kcl、80ml甲醇、13.5ml tween20置于装有800ml纯化水的烧杯中搅拌溶化，定容至1000ml，充分混匀后，置4℃备用。
33.步骤2：将待测溶液加入检测卡的加样孔内，5分钟后，将稀释液滴加在清洗孔中，静置反应15~20min，将检测卡插入高敏荧光分析仪中进行分析得到检测结果。当待测溶液进入加样孔后，待测溶液经过样品垫和标记物垫后，标记物垫上的标记物随待测溶液向下方nc膜两侧渗透，残留在nc膜上的液体停留一段时间后，滴加清洗液于清洗孔中。清洗液将nc膜上的样本和标记物随冲至吸水垫。完成整个层析过程。在滴加清洗液时，稀释垫上的色素能够指示标记物释放过程；当视窗孔完全被色素覆盖时，开始对结果判读。此处加入色素是为了更好的展示标记物的释放过程，使用者可以确保标记物已经充分释放，然后将检测卡插入高敏荧光分析仪中进行结果分析，从而能够进一步缩短检测时间。
34.在具体实施时，所述检测卡氟苯尼考的检测限为0.1
µ
g/kg，氟苯尼考胺的检测限为10
µ
g/kg。
35.三、实施例和对比例1、实施例1：对标准溶液的检测，以及标准曲线制备和阴阳质控建立（1）标准溶液的配制
标准储备液：分别精密称取氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品10 mg，于20 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为500 μg/ml的标准储备液，-18℃保存。
36.中间标准溶液：准确移取标准储备液100 μl于10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成浓度5μg/ml的中间标准溶液，4℃冷藏避光保存。
37.标准工作溶液：准确移取100 μl中间标准溶液于5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度100μg /l标准工作溶液，4℃冷藏避光保存。
38.（2）样品制备采用标准工作溶液或中间标准溶液，分别配制成浓度为0.1ppb、0.2ppb、0.4ppb、0.8ppb、2.0ppb的氟苯尼考系列标准品试样和10ppb、20ppb、40ppb、80ppb、200ppb氟苯尼考胺系列标准品试样。
39.（3）分析步骤制备多个规格完全相同的本发明所述试剂卡，将上述不同浓度的氟苯尼考系列标准品试样和不同浓度的氟苯尼考胺系列标准品试样，分别滴加对应的一个试剂卡的加样孔中，完成免疫层析反应。将试剂卡插入高敏荧光分析仪，用高敏荧光分析仪检测荧光信号与相应的梯度浓度制作氟苯尼考和氟苯尼考胺的标准曲线。
40.（4）质控实验每批样品同时进行空白实验和加标质控实验。
41.空白试验：称取空白试样，按照上述“样品制备”和“分析步骤”所述步骤进行操作。
42.加标试验：准确称取空白试样5g（精确至0.01g）置于50ml离心管中，分别加入一定体积的氟苯尼考标准中间液，使氟苯尼考终浓度为0.15μg/kg，0.50μg/kg，1.80μg/kg。氟苯尼考胺终浓度为15μg/kg，50μg/kg，180μg/kg。按照上述“样品制备”和“分析步骤”所述步骤进行操作。
43.（5）结果分析将上述制备的标准曲线植入荧光分析仪中，检测制备的质控实验样本结果如下：阴性质控样本检测结果:氟苯尼考＜0.1μg/kg，氟苯尼考胺＜10μg/kg;阳性质控样品检测结果：氟苯尼考0.14μg/kg，0.61μg/kg，1.91μg/kg；氟苯尼考胺16.1μg/kg，50.3μg/kg，185.1μg/kg。
44.从检测结果可以看出，本发明所述试剂卡的检测结果与样品实际配制浓度相差很小，具有较高的精准度。
45.2、实施例2：对氟苯尼考和氟苯尼考胺的同时检测（1）样品制备准确称取空白试样5g（精确至0.01g）置于50ml离心管中，在同一份样本中同时加入一定体积的氟苯尼考和氟苯尼考胺标准液，制备2份阳性样本，使2份样本氟苯尼考和氟苯尼考胺终浓度为样本1(0.5μg/kg，50μg/kg)，样本2（1.5μg/kg，150μg/kg）。
46.（2）分析步骤将样本1和样本2的处理液加入本发明所述试剂卡的加样孔中，静置免疫层析反应15-20分钟。将试剂卡插入高敏荧光分析仪，采用手机（app）/电脑（pc）操控检测进行结果判定。
47.（3）结果分析
样本1检测结果：t1(氟苯尼考) 0.58μg/kg：t2(氟苯尼考胺)52.3μg/kg。
48.样本2检测结果：t1(氟苯尼考) 1.48μg/kg：t2(氟苯尼考胺)148.6μg/kg。
49.由此可见，本发明所述试剂卡能够同时准确检测样本中氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量，检测结果具有较高的准确度。
50.3、实施例3：对市场样品禽蛋的检测（1）样本的收集收集市场用药鸡蛋样本2份（液相色谱-质谱法检测样本1的氟苯尼考含量为1.83μg/kg，氟苯尼考胺含量为53.4μg/kg；样本2的氟苯尼考含量为0.68μg/kg，氟苯尼考胺含量为36.9μg/kg）和未用药阴性鸡蛋样本2份（样本3和样本4）。
51.（2）样品制备准确称取样本5g
±
0.05g于50ml离心管中，加入20ml乙酸乙酯。涡旋振动2min，4000r/min离心5min，取上清液4ml于10ml的ep（eppendorf）管中，65℃水浴中氮气吹干，最后用500
µ
l稀释液溶解。
52.（3）分析步骤按照检测流程检测，静置免疫层析反应15-20分钟。将试剂卡插入高敏荧光分析仪，采用手机（app）/电脑（pc）操控检测进行结果判定。
53.（4）结果分析本次检测结果为样本1：t1(氟苯尼考) 1.75μg/kg，t2（氟苯尼考胺）55.6μg/kg。
54.样本2：t1(氟苯尼考) 0.71μg/kg，t2（氟苯尼考胺）38.3μg/kg。
55.样本3：t1(氟苯尼考) ＜0.1μg/kg，t2（氟苯尼考胺）＜10μg/kg。
56.样本4：t1(氟苯尼考) ＜0.1μg/kg，t2（氟苯尼考胺）＜10μg/kg。
57.由此说明，本发明所述试剂卡具有实用性，能够同时检测实际样本中氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量，且检测结果较为准确。
58.4、对比例1：现有市场上氟苯尼考检测试剂卡和氟苯尼考胺检测试剂卡（1）样品制备采用与实施例2完全相同的待检测试样（2）分析步骤从市面上购买的氟苯尼考检测试剂卡和氟苯尼考胺检测试剂卡，这两种检测试剂卡均为胶体金试剂卡。将待检测试样1分别滴加在两种试剂卡的加样孔上，通过观察t线比c线显色强弱分别判定样品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量是否超标。
59.（3）分析结果这两种试剂卡的检测时间分别为15min，检测结果为样本1氟苯尼考试剂卡和氟苯尼考胺试剂卡检测t线颜色比c线颜色深，因此判定为氟苯尼考＜1μg/kg，氟苯尼考胺＜50μg/kg。样本2氟苯尼考检测试剂卡和氟苯尼考胺检测t线均比c线暗，判定氟苯尼考＞1μg/kg氟苯尼考胺＞50μg/kg。检测试剂卡只能检测待检测样本中的氟苯尼考含量，而无法检测氟苯尼考胺的含量；同样的，氟苯尼考胺检测试剂卡只能检测待测样本中的氟苯尼考胺含量，而无法检测氟苯尼考的含量，由此可见，现有市场上的试剂卡无法同时对氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量进行检测，并且检测时间长；和本发明相比，检测结果的准确性较低，且无法同时定量检测氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量。
60.最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测卡，其特征在于，所述检测卡包括pvc底板和检测卡外壳；在pvc底板（1）上从左至右依次设有稀释垫（2）、标记物垫（3）和吸水垫（4），nc膜（5）位于标记垫的下方，nc膜的一端与吸水垫的一端搭接相连，nc膜的另一端从标记垫的下方穿过后与稀释垫的一端搭接相连，且标记物垫和稀释垫之间具有间隙，使nc膜能够从该间隙中裸露出来；在标记物垫的上方设有样品垫（6）；在标记垫和吸水垫之间的nc膜上从左至右依次设有检测线t1（7）、检测线t2（8）和质控线c（9）；所述pvc底板位于检测卡外壳（13）内，在检测卡外壳上且对应检测线t1、检测线t2和质控线c的位置处开设有视窗孔（10），对应样品垫的位置处开设有加样孔（11），对应稀释垫位置处开设有清洗孔（12）；在标记物垫上浸染已标记氟苯尼考抗体、氟苯尼考胺抗体和兔igg抗体的镧系荧光微球探针；在nc膜上，检测线t1处包被氟苯尼考-bsa抗原，检测线t2处包被氟苯尼考胺-bsa抗原，质控线c上包被羊抗兔igg抗体的igg。2.根据权利要求1所述氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测卡，其特征在于，所述镧系荧光微球中，镧系为镧系元素eu、sm或tb。3.一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述定量检测卡，具体操作步骤如下：步骤1：配制待测样品的待测溶液；步骤2：将待测溶液加入检测卡的加样孔内，随后，将稀释液滴加在清洗孔中，静置反应15~20min，将检测卡插入高敏荧光分析仪中进行分析得到检测结果。4.根据权利要求3所述氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测方法，其特征在于，所述检测卡氟苯尼考的检测限为0.1
µ
g/kg，氟苯尼考胺的检测限为10
µ
g/kg。5.根据权利要求3所述氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测方法，其特征在于，用高敏荧光分析仪检测荧光信号，根据荧光-浓度标准曲线计算检测样本浓度。6.根据权利要求3所述氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测方法，其特征在于，在步骤2中，当待测溶液进入加样孔后，待测溶液经过样品垫和标记物垫后，标记物垫上的标记物随待测溶液向下方nc膜两侧渗透，残留在nc膜上的液体停留一段时间后，滴加清洗液于清洗孔中；清洗液将nc膜上的样本和标记物随冲至吸水垫。7.根据权利要求3所述氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测方法，其特征在于，在步骤2中，在稀释垫上加入色素，用于指示标记物释放过程；当视窗孔完全被色素覆盖时，开始对结果判读。

技术总结
本发明公开了一种氟苯尼考和氟苯尼考胺快速定量检测卡及检测方法，所述检测卡包括PVC底板和检测卡外壳；在PVC底板上从左至右依次设有稀释垫、标记垫、NC膜和吸水垫，在标记物垫的上方设有样品垫；在标记垫和吸水垫之间的NC膜上设有检测线T1、检测线T2和质控线C；所述PVC底板位于检测卡外壳内，在检测卡外壳上且对应检测线T1、检测线T2和质控线C的位置处开设有视窗孔，对应样品垫的位置处开设有加样孔，对应稀释垫位置处开设有清洗孔。本发明所述检测卡结构简单，设计合理，不但能够提高被检测物的灵敏性、精密性，而且还保留了快诊检测方法的快速和方便特性。测方法的快速和方便特性。测方法的快速和方便特性。


技术研发人员：李根容 龚迎昆 童兰艳 肖昭竞 李明伟 章健 余文琴 谭立华
受保护的技术使用者：成都微瑞生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/8/14